带，相对分子质量为80kD。
[0101]经对SDS-PAGE电泳图各条带进行灰度扫描，测定人乳铁蛋白纯度为90%，人乳铁蛋白回收率为68.68%。
[0102]实施例2重组人乳铁蛋白的分离(724树脂法)
[0103]1、脱脂、除杂:
[0104]将乳汁加热到55°C，用蝶式离心机(同上)脱脂，用纱布过滤，去除沉淀(主要包括杂质和脂肪等)，脱脂奶冷却到4°C，共得到脱脂乳清85.5L。
[0105]2、在吸附罐中与724树脂搅拌吸附和洗脱技术
[0106]2.1 724树脂的预处理:树脂需经过酸碱处理转型才能使用。
[0107]称取36.6kg 724树脂(同上)，先用纯水洗去杂质；再用3%的NaOH水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近7.5 ;用4%的HC1水溶液搅拌浸泡4_6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近5.5 ;再用4%的NaOH水溶液搅拌浸泡4_6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近7.5 ;最后用0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，pH = 6.5，处理lh。
[0108]2.2脱脂乳清与724树脂的搅拌吸附:
[0109]将步骤1得到的85L脱脂乳清和步骤2.1处理好的724树脂加入到搅拌吸附罐(同上)中，在4-15°C下，搅拌吸附6h。
[0110]2.3杂蛋白的洗脱:
[0111]搅拌吸附后，用纯水洗脱多次，直到溶液澄清为止；再使用3倍于树脂体积的 0.lmol/L NaCl 溶液，该 0.lmol/L NaCl 溶液用 40mmol/L 磷酸盐溶液(0.lmol/NaCl, 0.04mol/L Na2HP04, ρΗ7.4)，ρΗ7.4 配制，洗脱 3 次，每次 30 分钟。
[0112]2.4终洗脱液洗脱人乳铁蛋白:
[0113]使用等树脂体积的5%硫酸铵溶液洗脱被树脂吸附的人乳铁蛋白，洗脱4次，每次40分钟，收集每次的洗脱液160L。该5%硫酸铵溶液用去离子水配制。
[0114]3、膜超滤技术分离杂蛋白:
[0115]步骤2.4收集的160L洗脱液过0.22微米的滤膜过滤，用截留分子量为30000D的膜超滤，得超滤液液2L，将2L的超滤液浓缩脱盐，并冷冻干燥，得产品63.05g。
[0116]经Western-blot测定,该产品为人乳铁蛋白，而不是羊乳铁蛋白。
[0117]经SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)测定，结果显示所得人乳铁蛋白组份为单一条带，相对分子质量为80kD,如图2所示。
[0118]经对SDS-PAGE电泳图各条带进行灰度扫描，测定人乳铁蛋白纯度为90%，人乳铁蛋白回收率为70.93%。
[0119]对比例1重组人乳铁蛋白的分离(732树脂法)
[0120]1、脱脂、除杂:
[0121]将乳汁加热到55°C，用蝶式离心机(同上)脱脂，用纱布过滤，去除沉淀(主要包括杂质和脂肪等)，脱脂奶冷却到4°C，得到脱脂乳清85.5L。
[0122]2、在吸附罐中与732树脂搅拌吸附和洗脱技术
[0123]2.1 732树脂的预处理:树脂需经过酸碱处理转型才能使用。
[0124]称取36.6kg 732树脂(购自上海树脂厂有限公司)，先用纯水洗去杂质；再用3%的NaOH水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近9.0 ;用4%的HC1水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近5.5 ;再用4%的NaOH水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近9.0 ;最后用0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，pH =
6.5，处理 lh。
[0125]2.2脱脂乳清与732树脂的搅拌吸附:
[0126]将步骤1得到的85.5L脱脂乳清和步骤2.1处理好的732树脂加入到搅拌吸附罐(同上)中，在4-15°C下，搅拌吸附6h。
[0127]2.3杂蛋白的洗脱:
[0128]搅拌吸附后，用纯水洗脱多次，直到溶液澄清为止；再使用3倍于树脂体积的 0.lmol/L NaCl 溶液，该 0.lmol/L NaCl 溶液用 40mmol/L 磷酸盐溶液(0.lmol/NaCl, 0.04mol/L Na2HP04, ρΗ7.4)，ρΗ7.4 配制，洗脱 3 次，每次 30 分钟。
[0129]2.4终洗脱液洗脱人乳铁蛋白:
[0130]使用等树脂体积的5%的硫酸铵溶液洗脱被树脂吸附的人乳铁蛋白，洗脱4次，每次40分钟，收集每次的洗脱液160L。该5%的硫酸铵溶液用去离子水配制。
[0131]3.将步骤2.4得到的洗脱液经SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)测定，结果显示所用732树脂没能得到724树脂的纯化效果，人乳铁蛋白蛋白几乎没能获得有效纯化(见图3)。
[0132]比较结果可知，本发明的纯化工艺对人乳铁蛋白的纯化效率显著提高。
[0133]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1.一种从转基因山羊乳汁中分离人乳铁蛋白的方法，其特征在于，包括步骤: (1)对转基因山羊乳汁进行离心处理和过滤处理，从而得到脱脂乳清； (2)对步骤(1)得到的脱脂乳清与弱酸性阳离子交换树脂进行搅拌吸附，从而得到吸附在该阳离子交换树脂上的脱脂乳清； (3)对步骤(2)得到的吸附在阳离子交换树脂上的脱脂乳清用洗涤剂洗涤，从而得到经洗涤的吸附在阳离子交换树脂上的脱脂乳清； (4)对步骤(3)得到的经洗涤的吸附在阳离子交换树脂上的脱脂乳清用洗脱剂进行洗脱，从而得到含人乳铁蛋白的洗脱液； (5)对步骤(4)得到的含人乳铁蛋白的洗脱液进行过滤，收集滤液； (6)对步骤(5)得到的滤液进行浓缩。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的离心处理为在45-60°C下,8000-10000r/min,离心15-30分钟；和/或步骤(1)中，所述的过滤处理为用纱布过滤。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的弱酸性阳离子交换树脂为724树脂；和/或步骤(2)中，所述的弱酸性阳离子交换树脂和脱脂乳清的重量比为1:3 — 1:1ο4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的搅拌吸附进行4-8小时；和/或步骤(2)中，所述的搅拌吸附是在4-20°C下进行；和/或步骤(2)中，所述的搅拌吸附是在50-200r/min的转速下进行。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述洗涤剂为0.1-0.5mol/LNaCl溶液；较佳地，所述洗涤剂为0.1-0.5mol/L NaCl磷酸盐缓冲液。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤⑷中，所述洗脱液为8%±4% NaCl溶液或5% ±2%硫酸铵溶液；较佳地，所述洗脱液为8% ±4% NaCl磷酸盐缓冲液或5%±2%硫酸铵水溶液。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，对步骤⑷得到的含人乳铁蛋白的洗脱液先用0.22微米的滤膜过滤，再用截留分子量为30000D的膜超滤，收集超滤液。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤￠)中，对步骤(5)得到的滤液进行浓缩脱盐。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(6)之后，还包括步骤:将对浓缩后的产品进行冻干。10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)和步骤(2)之间，还包括对弱酸性阳离子交换树脂的预处理步骤:对弱酸性阳离子交换树脂依次经水、碱性溶液、酸性溶液、碱性溶液以及磷酸盐缓冲液处理。
【专利摘要】本发明涉及一种从转基因山羊乳汁中分离人乳铁蛋白的方法。具体地，本发明是以转基因脱脂乳汁为原料，综合了离心、过滤，与阳离子交换树脂进行搅拌吸附，用洗涤剂洗涤，用洗脱剂进行洗脱，以及过滤、浓缩等步骤。该方法适合工业化规模应用，具有更简单、省时、成本低、效率高、高纯度、高回收率等优点。
【IPC分类】C07K1/18, C07K14/79
【公开号】CN105399816
【申请号】CN201410472560
【发明人】成国祥, 刘思国, 陈建泉
【申请人】上海杰隆生物工程股份有限公司, 上海转基因研究中心
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2014年9月16日