ilizationinRice.JIntegrPlantBiol 54, 631-639. (Tian，J.，Wang，C.，Zhang，Q.，He，X.，Whelan，J.，andShou，H. 2012 超表达一 种植物根表的酸性磷酸酶OsPAPlOa提高环境有机磷的利用效率。整合植物学杂志，54， 631-639)〇
[0013] Wang,L. ,Lu,S.,Zhang,Y. ,Li,Z. ,Du,X.,andLiu,D. (2014).Comparative geneticanalysisofArabidopsispurpleacidphosphatasesAtPAPIO,AtPAP12,and AtPAP26providesnewinsightsintotheirrolesinplantadaptationtophosphate deprivation.JIntegrPlantBiol56, 299-314. (Wang,L. ,Lu,S.,Zhang,Y. ,Li,Z. ,Du,X .，andLiu,D. 2014AtPAP10，AtPAP12和AtPAP26的比较基因组学分析证明其在植物缺磷适 应性中的功能。整合植物学杂志，56, 299-314)。
[0014] Wang,X. ,Wang,Y. ,Tian,J. ,Lim,B.L. ,Yan,X. ,andLiao,H. (2009). OverexpressingAtPAP15enhancesphosphorusefficiencyinsoybean.PlantPhysiol 151, 233-240. (Wang,X.,Wang,Y.,Tian,J.,Lim,B.L.,Yan,X.,andLiao,H. 2009 超表达 AtPAP15提高磷大豆的磷效率。植物生理，151，233-240)。
【发明内容】
[0015] 本发明要解决的技术问题是提供一种能大幅提高转基因水稻酸性磷酸酶的蛋白 质及其基因，以及由此获得的转基因植物，和利用所述基因对作物进行改造的方法。该方法 能提高转基因水稻酸性磷酸酶活性达5-10倍。
[0016] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案来实现的：提供一种水稻紫色 酸性磷酸酶蛋白基因编码的蛋白质，其为SEQIDN0 :2所示的氨基酸序列。
[0017] 本发明还提供一种编码上述蛋白质的基因，其具有SEQIDN0:1所示的核苷酸序 列（下划线所述对应上述氨基酸）。
[0018] 本发明还提供一种包含上述核酸的转基因植物。
[0019] 本发明还提供一种对水稻紫色酸性磷酸酶进行改造的方法，包括用具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列的基因转化水稻愈伤组织，再将转化后的愈伤组织再生培育成植 株。
[0020] 进一步具体的说：本发明的目的是提供一种从水稻野生型品种日本晴中克隆的新 基因OsPAPlOc，如SEQIDN0:1和图1所示的DNA序列。其对应的蛋白质序列如SEQID NO:2和图2所示，该蛋白质属于紫色酸性磷酸酶基因家族。
[0021] 本发明的另一个目的是提供一种利用OsPAPlOc基因进行水稻转化的方法，具体 地说，本发明提供了具有SEQIDN0 :1所示的序列的基因载体，其中载体如图3所示，含有 OsPAPlOc基因，该载体可以表达由上述核苷酸序列编码的蛋白质。
[0022] 本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物影响水稻酸性磷酸酶的方法。
[0023] 实现本发明的具体技术步骤如下：
[0024] 1.克隆水稻OsPAPlOc基因
[0025] 通过PCR技术，克隆水稻OsPAPlOc基因，通过酶切连接等分子生物学技术将基因 构建到水稻转化表达载体。见图3。
[0026] 2.水稻转基因
[0027] 通过利用农杆菌介导水稻转基因受体的快速制备方法获得转基因植株。
[0028] 3.调节OsPAPlOc基因在水稻中的表达：
[0029] 通过转基因技术超表达OsPAPlOc基因在水稻中的表达，获得了超表达的转基因 水稻，并通过半定量RT-PCR和WesternBlot(图4)等方法检测转基因植株。
[0030] 4.OsPAPlOc基因功能初步鉴定
[0031] 转基因超表达OsPAPlOa，超表达OsPAPlOc的材料和野生型水稻种子发芽后，培 养于水稻液体培养基中，生长至10天的幼苗在正常，缺磷和供给ATP条件下处理两周，测 定所有植株的酶活性和磷含量。超表达OsPAPlOa之后，转基因材料酸性磷酸酶活性升高 1. 5倍左右（与之前报道一致），而超表达OsPAPlOc之后，转基因材料的地上和地下表面 的酸性磷酸酶活性均升高5倍左右（图5)。进一步分析分泌性酸性磷酸酶活性发现，超表 达OsPAPlOc的转基因材料提高了约10倍的酸性磷酸酶活性，并利用Westernblot证明， OsPAPlOc存在于分泌蛋白中（图6)。同时，超表达OsPAPlOc的转基因材料ATP降解能力 显著提高，ATP处理条件下，超表达OsPAPlOc的转基因材料叶片磷含量也相应提高，说明该 材料利用ATP能力提高（图7)。
[0032] 磷矿石作物一种不开再生资源，国际上磷肥价格逐年上涨，已经逐渐成为一种战 略资源。目前我国是世界第一磷肥进口国，为了应对我国的磷肥危机并且保护生态环境，迫 切需要提高作物的磷肥利用效率和耐低磷能力。本发明通过克隆技术获得水稻紫色酸性磷 酸酶基因OsPAPlOc，并通过转基因获得超表达材料并且初步鉴定了该基因的功能。相比之 前报道，本发明首次在水稻中发现了一种分泌至环境中的紫色酸性磷酸酶，同时该磷酸酶 能大幅度提尚转基因材料的酸性憐酸酶活性，促进转基因材料对有机憐的利用效率，提尚 转基因水稻的田间产量。
[0033] 发明人对所有29个水稻的紫色酸性磷酸酶进行了系统分析，筛选了一些参与磷 信号反应的紫色酸性磷酸酶。除了酸性磷酸酶OsPAPlOa外，其他的酸性磷酸酶功能还 都没有报道，这些酸性磷酸酶在磷高效分子育种中的潜力也都不知道。本发明中超表达 OsPAPlOc提高植株地上和地下部分酸性磷酸酶约5倍，提高分泌型的酸性磷酸酶10倍左 右。
【附图说明】
[0034] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0035] 图1为OsPAPlOc基因的编码DNA序列；
[0036] 图2为OsPAPlOc的蛋白质序列；
[0037] 图3为OsPAPlOc的超表达载体图；
[0038] 图4为OsPAPlOc转基因水稻分子鉴定；
[0039] 图5为OsPAPlOc转基因水稻酶活性测定；
[0040] 图6为OsPAPlOc转基因水稻分泌蛋白酶活性测定和WesternBlot;
[0041] 图7为OsPAPlOc转基因水稻有机磷利用能力分析。
[0042] 备注说明：图中的 0sPAP10c-0el、0sPAP10c_0e2、0sPAP10c_0e3 代表三个独立的 转基因事件。
【具体实施方式】
[0043] 实施例1、克隆水稻OsPAPlOc基因及构建超表达载体：
[0044] 利用引物从水稻根部cDNA中扩增OsPAPlOc全长编码框（图1)，上游引物和下游 引物序列分别为 5' -CGGGATCCATGGGGATGCTGCGGTGG-3' 和 5'-CCCCCGGGTTATACATCGTCGTTGG TGGG-3'。扩增产物和双元载体pTFlOl. 1-Ubi利用BamHI和SmaI酶切后，分别回收酶切 产物。利用DNA连接酶将OsPAPlOc扩增产物导入pTFlOl.Ι-Ubi载体中，获得转化终载体 Ubi-0sPAP10c(图 3)。
[0045]实施例2、水稻转基因：
[0046] 1、野生型日本晴水稻（OryzasatvaL.sspjaponicacvNipponbare);
[0047]2、水稻转基因方法
[0048] 1)水稻成熟胚愈伤组织的准备
[0049] 水稻成熟种子脱壳后，挑选饱满光洁无菌斑的种子放入烧杯中，用70%乙醇消毒 lmin。倒去乙醇，加入20%(v/v)NaC10溶液（有效氯约1~1.2%)消毒90min。倒去 NaCIO溶液，用无菌水清洗5遍，最后1遍在无菌水中浸泡30min。倒去无菌水，将种子置于 无菌滤纸上吸干。用镊子将种子转入诱导培养基中，28°C暗培养10-14d。在超净工作台上 打开培养皿，用镊子将小芽和米粒壳去掉，留下胚性愈伤组织（淡黄色，致密不规则），置入 籼稻继代培养基中，28°C暗培养5-10d。
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