] 2)农杆菌的培养
[0051]将保存的农杆菌菌株贮备液在YEP(添加50mg/LKan，50mg/LStr)，28°C划线活 化卜1.5d。用无菌牙签挑取农杆菌单克隆于5mlYEP(含50mg/LKan和50mg/LStr)培 养液中，28°C，250rpm振荡培养12-36h至菌液0D600饱和，从中吸取农杆菌菌液50μ1于 30mlYEP(含 50mg/LKan和 50mg/LStr)培养液中，28°C，250rpm振荡培养 12-16h至菌液 0D6000. 8-1. 5。将培养完毕的农杆菌液低速离心（4000rpm，10min)，弃上清，用适量的AAM 培养液（含200μMAs)重悬，稀释成0D600 = 0. 3-0. 5的菌悬液。
[0052] 3)共培养及抗性愈伤的筛选
[0053] 将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，切割成粒状，放入农杆菌菌悬液，振荡培养 30分钟。将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40min。然后将愈伤组织置于共培养 基上。25°C暗培养2. 5d后，将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡。再 用含250mg/L羧节青霉素钠的无菌水清洗1~2遍。最后置于无菌滤纸上沥干2h。将瞭 干的愈伤转入含250mg/L羧苄青霉素钠和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择， 28°C，暗培养14d。将长大的初始愈伤转到含250mg/L羧苄青霉素钠和80mg/L潮霉素选择 培养基上进行第二轮选择，28°C，暗培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。如果三周结束 未长出抗性愈伤，需转到相同成分的选择培养基上进行第三轮选择。
[0054] 4)抗性愈伤的分化及成苗
[0055] 挑取从同一愈伤得到的抗性愈伤2-3颗置于分化培养基上，28°C光照培养 [14h/10h(day/light)光周期，光强为20001x]。分化培养20-50d后愈伤组织会分化出小 苗，当绿芽长至3-5cm左右，转入生根培养基中，28°C光照培养[14h/10h(day/light)光周 期，光强为20001x]。
[0056] 5)转基因苗的移栽和分子鉴定
[0057] 生根培养10-15d后，将苗根部和茎叶分化得较完整的植株挑出，打开封口膜，加 入适量蒸馏水或无菌水，在培养室炼苗2-3d后，洗去琼脂，转入水稻营养液中培养2周。利 用除草剂草丁磷涂抹转基因叶片，选择出有抗性的转基因材料。提取阳性转基因材料的RNA 和总蛋白，利用RT-PCR和WesternBlot进行转基因幼苗鉴定。最后将获得的转基因阳性 苗移入大田或盆栽，收种子。
[0058] 实施例3:
[0059] 转基因超表达OsPAPlOa，超表达OsPAPlOc的材料和野生型水稻种子用1%硝酸破 休眠，室温放置16小时，清水反复冲洗掉硝酸，于37°C培养箱黑暗培养两天至露白。催芽完 成后，用水稻营养液（表1)培养。温室光照周期为12h白天/12h黑夜，光强30001UX，白天 温度30°C，夜间22°C。生长至10天的幼苗在正常条件，缺磷和供给ATP条件下处理两周， 测定所有植株的酶活性和磷含量。
[0060] 表1水培条件下水稻营养液配方
[0061]
[0062] *营养液用2M盐酸调节pH至5. 5。
[0063] 实施例4、转基因水稻分子鉴定：
[0064] 1、半定量PCR分析：
[0065] 取50-100mg样品组织用液氮充分研磨，加入1mlTrizol试剂，继续研磨至完全粉 末。放置片刻至溶解后，将组织匀浆转移到干净的离心管中。加入200ml氯仿，剧烈震荡15 秒，于4°C，12000g离心10分钟。上清转入一个新的离心管中，再次加入200ml氯仿，剧烈震 荡15秒，于4°C，12000g离心10min。取上清至新离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后 室温放置1〇111；[11，于4<€，1200(^离心10111；[11。弃上清，用75%乙醇（需用1?熟86?代6水配 置）充分洗涤两次。室温干燥后，用20-40μ1RNAseFree水溶解。RNA样品保存在-80°C 超低温冰箱中。
[0066] 本发明的逆转录过程均采用Promega公司的逆转酶（M-MLVReverse Transcriptase，Promega)，总RNA按照试剂盒提供的操作说明进行逆转录。逆转录完成后， 将样品置于75°C处理lOmin，冰上冷却。短暂离心后，-20°C保存样品。
[0067] 先将模板稀释5-10倍后再进行半定量PCR分析。半定量PCR过程中，首先对 OsACTIN进行PCR分析，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。通过控制PCR产物的上样量，将所 有样品调节一致后，然后按照此水平对目标基因进行分析。
[0068] 2、Westernblot分析：
[0069] 取植物材料并称量鲜重，在用液氮预冷的研钵中将组织磨碎。加入两倍体积（2ml/ g)的蛋白提取液（蛋白提取液：2%SDS，60mMTris-HCl，pH8.5,2.5%glycerol，0.13mM EDTA,IXproteaseinhibitorcocktail)。混勾，于 4°C，12000g离心 15 分钟，取上清。测 定蛋白浓度后保存在-80°C超低温冰箱中。
[0070] 蛋白样品用5XSDS电泳缓冲液稀释到10-15μg总蛋白量，100°C煮5分钟，将蛋 白质变性，13000rpm，室温离心10分钟，取上清液上样。60V电泳15分钟（浓缩胶）后， 150V电泳90分钟（分离胶）。SDS-PAGE分离后的凝胶（不染色）置于转膜缓冲液中浸泡 1分钟。将海绵、滤纸、凝胶、硝酸纤维滤膜、滤纸及海绵依续叠放在支持架上，间隙之间不 能有气泡。插入转膜槽中，凝胶接（一）极，PVDF膜接（+)极，电流强度为0· 75-1. 0mA/cm2 滤膜，转移 1. 5-2.Oh。（90V，350mA，1. 5h)完成后，TBST洗膜 3 次，每次 10min。
[0071]PVDF膜置于TBSTM中，孵育lh，用TBST洗膜3次，每次10min。在1 %BSA加入 TBST(或者用0. 1%TBSTM)中，再按1/500-5000加入一抗，孵育l-2h。用TBST洗膜3次， 每次10min。在1%BSA加入TBST中，再按1/5000加入二抗，孵育l-2h。TBST洗膜3次， 每次10min。BCIP/NBT/显色液=1:1:38混匀，膜置于其中进行显色反应3-10min，显色后 的膜置于水中结束反应，结果扫描仪记录。
[0072] 实施例5、水稻酸性磷酸酶活性分析：
[0073]取 10μg蛋白置于6〇0μL预热的反应液中（10mMpNPP，5〇mMsodiumacetate， pH5. 5)，在25°C，反应10分钟后，加入1. 2ml的NaOH(lM)终止反应，于410nm波长测定吸 收值（图6, 7)。
[0074] 以上所述仅为本发明的若干个【具体实施方式】，应当指出，对于本领域的普通技术 人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范 围。
【主权项】
1. 水稻紫色酸性磷酸酶蛋白基因编码的蛋白质，其特征是：为SEQIDNO:2所示的氨 基酸序列。2. 编码如根据权利要求1所述的蛋白质的水稻紫色酸性磷酸酶OsPAPlOc基因，其特征 是：为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。3. 如权利要求1所述的水稻紫色酸性磷酸酶OsPAPlOc基因的用途，其特征是：用于构 建转基因水稻，所述转基因水稻提高了酸性磷酸酶活性，相应提高了对磷吸收和利用的效 率。4. 对水稻紫色酸性磷酸酶进行改造的方法，其特征是：包括用具有SEQIDNO:1所示 的核苷酸序列的基因转化水稻愈伤组织，再将转化后的愈伤组织再生培育成植株。
【专利摘要】本发明公开了一种水稻紫色酸性磷酸酶蛋白基因编码的蛋白质，为SEQ？ID？NO：2所示的氨基酸序列。本发明还同时提供了编码上述蛋白质的水稻紫色酸性磷酸酶OsPAP10c基因，为SEQ？ID？NO：1所示的核苷酸序列。本发明还同时提供了上述水稻紫色酸性磷酸酶OsPAP10c基因的用途是：用于构建转基因水稻，所述转基因水稻提高了酸性磷酸酶活性，相应提高了对磷吸收和利用的效率。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/82, C12N15/55, C12N9/16
【公开号】CN105420208
【申请号】CN201510869740
【发明人】王创, 陆玲鸿, 寿惠霞, 高雯雯, 邱文敏
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月2日