t-BuOH/DCM k)NaI04, NaHC03, EtOAc/ 水
[0133] 如本文公开的式5化合物可用于制备式1、2或3化合物。在一个实施方案中，这 类化合物的合成在流程3和4中公开。
[0134] 在流程3中，式5g化合物与式6a化合物偶联形成式2c化合物。类似于式6a 化合物的化合物的合成在如下文献中有公开：PCT国际公开号WO 2005/118565A1，Guo, Η. 等人，J. Am. Chem.Soc·，2009,131,15387-93, Kim, D-S.等人，了.厶111.(：116111· Soc.，2009, 131，15636-641 和 Choi, H-w.等人，Org. Lett.，2002, v. 4 (25)，4435-38 (均引 入本文作为参考）。在所示实施方案中，偶联反应采用Ni/Cr催化剂进行，偶联反应的条件 与 US 专利号 6, 214, 865B1 或 Kim, D-S.等人，J. Am. Chem. Soc.，2009, 131，15636-641 (均引 入本文作为参考）中公开的那些类似。偶联反应后，可以进行氯的置换以形成四氢吡喃环。 所用试剂没有特别的限制，在所示实施方案中，试剂是四氟硼酸银（AgBF4)。所得化合物可 以采用本领域技术人员应当已知的条件进行脱硅烷基化。在所公开的实施方案中，通过四 丁基氟化铵（TBAF)进行脱硅烷基化，获得式2e化合物。式2e化合物与式4a化合物的偶 联可以在类似于本文所提及的和在US专利号6, 214, 865B1 (引入本文作为参考）中所公开 那些的碱性条件下进行，形成中间体醇。采用如上文提及的试剂使醇氧化，导致形成了式lc 化合物。所述醇的氧化继之以分子内环化，形成了式le化合物。
[0136] 流程 3
[0137] a)配体（S)-2, NiCl2.DMP,质子海绵，CrCl2, LiCl, Mn, ZrCp2Cl2, MeCNb)AgBF4, 2, 6- 二叔丁基-4-甲基吡啶，t-BuOAc c)TBAF, THF d)化合物 3-14, n-BuLi, THF e)Dess-Marti n, CH2C12 f) 4, 4' -二叔丁基-2, 2' -联吡啶，CrCl3. 3THF, NiCl2. DMP, Mn, ZrCp2Cl2, THF
[0138] 如流程4中所示，采用还原剂、例如和非限制性地是三价铬和锌使芳基磺酰基部 分还原，随后采用如上所述的试剂进行氧化，可以获得式lg化合物。异亚丙基保护基的除 去可以采用酸进行，形成式lh化合物。硅烷基保护基的除去可以采用氟化物来源进行，如 本领域技术人员应当已知的那样，继之以采用酸进行分子内环化，形成式lj化合物。采用 本领域技术人员应当已知的条件进行Boc-保护基的除去，形成艾日布林。
[0139]
[0140] 流程 4
[0141] 8)4,4'-二叔丁基-2,2'-联吡啶，〇(：13.31'册，211，1'册11)0688-]\&1竹111，〇1 2(：121) pTSA, MeOH j) TBAF, AcOH, THF k) PPTS, CH2C12 1) TMSOTf, 2, 6-二甲基吡啶，CH2C12
[0142] 艾日布林（3)或式1和2化合物的盐的形成没有特别的限制。所形成的盐可用于 化合物的分离和纯化；并且可以产生具有较高纯度和/或减少量的杂质的产物。在一个实 施方案中，例如和非限制性地，艾日布林与酸在本领域技术人员应当已知的或可以确定的 条件下反应，形成预期的盐。在另一个实施方案中，艾日布林与甲磺酸反应，形成艾日布林 甲磺酸盐。
[0143] 本文所述的反应中所用的有机溶剂没有特别的限制，并且应当是本领域技术人员 已知的或可以确定的。所用的具体溶剂将取决于反应物和所进行的反应，以允许反应进行。
[0144] 微管蛋白聚合分析:
[0145] 按照Cancer Research, 2001，61:1031-1021(引入本文作为参考）中所述的方 法可以例如测定软海绵素 B、艾日布林、软海绵素 B类似物和艾日布林类似物的生物学活 性。详细地，可以评价牛脑微管蛋白的体外聚合并与参比物进行比较。可以将感兴趣的物 质溶于无水DMS0中，进一步在10% DMS0、90% PEM缓冲液（PEM-缓冲液：80mM PIPES [哌 嗪-N，N'-双（2-乙磺酸）]，pH 6.9、lmM EGTA(乙二醇四乙酸），ImM氯化镁）中稀释。通 过将总体积为 100 μ 1 的 3mg/ml 牛脑微管蛋白（Cytoskeleton, Inc, Denver, CO, USA)、ImM ATP、3% (体积/体积）甘油、1%DMS0在PEM-缓冲液中合并可以制备测试样品。通过 历经3分钟使温度从4°C增加至37°C可以引发反应物聚合。分析的读数是例如通过随时 间推移、例如每分钟一次测定340nm处吸光度达60分钟而测定的微管蛋白聚合（Cancer Research, 61,第1014页，左彳丁，第3段和第1018页图6) 〇
[0146] 类似的分析在 Journal of Biological Chemistry, 1985, 26:2819-2825(引入本 文作为参考）中有描述。
[0147] 细朐牛长抑制分析:
[0148] 细胞生长抑制分析在Cancer Research, 2001，61:1031-1021(引入本文作为参 考）中也有描述。例如，对存活人癌细胞的生物学活性可以通过使用表示不同类型的人类 癌症的细胞系来证明，所述细胞系例如是C0L0 205和DLD-1 (结肠癌）、DU 145和LNCaP (前 列腺癌）、HL-60 (早幼粒细胞白血病）、U937 (组织细胞淋巴瘤）、MDA-MB-435 (人乳癌）和 L0X(人黑素瘤）。这些细胞可以获自美国典型培养物保藏中心（ATCC)，Rockville,马里兰 州，USA)或获自 Division of Cancer Treatment-NCI Tumor Repository (Frederick,马 里兰，USA) (L0X-细胞系）或获自Dr.Mary J.C. Hendrix, University of Iowa College of Medicine, Iowa City, Iowa, USA) (MDA-MB-435 细胞系，MDA-MB-435S,获自 ATCC)。所有细 胞系可以在37°C、5%二氧化碳下、在凭经验优化的细胞密度下生长。所有细胞系可以在如 ATCC推荐的组织培养条件下进行培养。L0X细胞系可以在RPMI1640培养基、10%热灭活胎 牛血清、2mM L-谷氨酰胺中培养，MDA-MB-435细胞系可以在DMEM (高葡萄糖）、10 %热灭活 胎牛血清、20mM N-2-羟基乙基-哌嗪-Ν' -2-乙磺酸、ImM丙酮酸钠中培养。
[0149] 对于生物学细胞生长抑制分析，可以将细胞以7, 500个细胞/孔（除了 LNCaP， 其可以以10, 〇〇〇个细胞/孔接种）接种在96-孔培养板中。所有细胞可以在所述感兴 趣物质的存在下生长4天。随后，为了对细胞数目进行定量，可以向各孔加入无菌过滤的 3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基）-2, 5-二苯基四唑鑰溴化物，最终浓度为0. 5mg/ml，于37°C孵 育4小时，加入150μ1 0.1 N HC1 (在异丙醇中），温和混合，于540nm测定吸光度。该方法的 细节在Cancer Research, 61，1031-1021，第1013页，最后一段至第1014页第1段以及该出 版物的图2和表1中有描述。而且，该技术在Analytical Biochemistry, 1984, 139:272-277 和 Journal of Immunological Methods, 1983, 65:55-63 中有记载（均引入本文作为参 考）。
[0150] 对于比较，在体外微管蛋白聚合或细胞生长抑制试验中可以使用参比物质如微管 去稳定剂长春花碱和微管稳定剂紫杉醇。
[0151] 通讨HPLC测宙纯度：
[0152] 通过如本领域已知的高压液相色谱法（HPLC)可以例如测定软海绵素 B、艾日布 林、软海绵素 B类似物和艾日布林类似物的纯度测定。将感兴趣物质溶于适宜的溶剂如有 机溶剂如乙醇中，进行HPLC。记录感兴趣物质和任意潜在杂质或降解产物的洗脱性质。然 后通过分别测定感兴趣物质的峰下面积和所有从HPLC柱洗脱出的其它杂质的峰下面积而 计算出感兴趣物质的纯度百分比。或者，可以分别收集感兴趣物质的峰和所有其它峰，除去 HPLC-洗脱缓冲液（例如如果缓冲液是有机溶剂如乙醇的话则通过蒸发），由此能够称重所 洗脱的感兴趣物质和所洗脱的其它物质，以计算出感兴趣物质的纯度百分比。 实施例
[0153] 现在通过实施例的方式描述了本发明，所述实施例公开了本发明的实施方案，但 是不意欲限制如本文所述和所要求的本发明的范围。
[0154] 实施例1:制备式7a化合物
[0155]
[0156] 历经20分钟向二甲基甲苯磺酰基甲基膦酸酯（17. 6g, 63. 2mmol, 1. 3eq)在 四氢呋喃（75mL)中的4-5°C溶液中加入双（三甲基硅烷基）氨基锂溶液（1M THF溶 液，58mL，1.3eq)。将混合物于4-5°C搅拌30分钟，然后温热至室温。加入另外的四氢 呋喃（50mL)，历经1小时于室温将混合物加入化合物9(25. 0g，48. 6mmol，leq)在甲苯 (100mL)中的溶液中。将混合物于室温搅拌1小时，然后在冰浴中冷却。混合物用0. 5M aq HCl(lOOmL)淬灭，温热至室温。水层用甲苯（50mL)萃取。合并的有机层用水（100mL)、饱 和NaHC03水溶液（100mL)和盐水（100mL)洗涤。将有机层浓缩至干，采用乙酸乙酯/庚 烷混合物（5 %，20%，50% )的梯度作为洗脱剂经柱色谱法纯化，得到27. 5g7a，为橙色油 (85%)，烯烃异构体比例为6:1。
[0157] 实施例2:制备式7b化合物
[0159] 历经 15 分钟向化合物 7a(25. 0g，37. 4mmol，leq)在二氯甲烷（250mL)中的 4_5°C 溶液中加入碘三甲基硅烷（10. 7mL，75. Ommol，2eq)。将反应物温热至室温，搅拌18小时。 将混合物冷却至4-5°C，加入Na2S203 · H20(28g)在饱和NaHC03水溶液（175mL)中的溶液。 将混合物温热至室温，加入水（50mL)。水层用二氯甲烷（3x 75mL)萃取。合并的有机层用 盐水（50mL)洗涤，浓缩至干。所得油采用乙酸乙酯/庚烷溶液（10%，20% )的梯度作为 洗脱剂经柱色谱法纯化，得到20. 5g 7b，为橙色油（73% )。
[0160] 实施例3:制备式7c化合物
[0162] 向三乙酰氧基硼氢化钠（22. 0g，104mmol，3eq)在甲苯（80mL)和1，2-二甲氧基乙 烧（160mL)中的混合物中加入四丁基氯化铵（19. 3g，69. 4mmol，2eq)。将混合物于60°C加 热1小时。滴加化合物7b(20. 0g)在甲苯（80mL)中的溶液。混合物于75°C加热3小时。 将混合物冷却至室温，加入水（160mL)。将有机层用饱和NaHC03水溶液（2x 150mL)和盐水 (150mL)洗涤。有机层浓缩至干，所得油采用乙酸乙酯/庚烷混合物（25%，50% )的梯度 作为洗脱剂经柱色谱法纯化，得到15. 6g 7c，为橙色油（78% )。
[0163] 实施例4:制备式7d化合物
[0165] 向化合物7c(15. 0g，25. 9mmol，leq)在二氯甲烷（150mL)中的溶液中加入质子海 绵_ (15. 0g, 70.0 mmol, 2. 7eq)和三甲基氧鐵四氟硼酸盐（8. 6g, 64. 8mmol, 2. 5eq)。将混 合物于室温搅拌18小时。过滤出固体，用二氯甲烷（20mL)洗涤。将滤液用1M HC1水溶液 (150mL)淬灭。水层用二氯甲烷（3x 100mL)萃取，合并的有机层用盐水（100mL)洗涤，浓缩 至干。所得油采用乙酸乙酯/庚烷混合物（30%，50%)的梯度作为洗脱剂经柱色谱法纯 化，得到12.8g 7d，为橙色油（83% )·
[0166] 实施例5:制备式7f化合物
[0168] 向化合物7d(12· 5g，21. lmmol，leq)在二氯甲烷（15mL)中的溶液中加入甲醇 (65mL)。将溶液冷却至4-5°C，加入碳酸钾（2. 9g, 21. 2mmol, leq)。混合物温热至室温，搅 拌18小时。混合物冷却至4-5°C，加入饱和NH4C1水溶液（40mL)。混合物搅拌30分钟，加 入乙酸乙酯（100mL)和水（100mL)。混合物温热至室温，水层用乙酸乙酯（3x 50mL)萃取。 合并的有机层用盐水（100mL)洗涤，用Na2S04干燥，浓缩至干。将所得化合物7e油直接进 行下一步骤。
[0169] 向化合物7e(基于8g 7e)在二氯甲烷（80mL)中的溶液中加入二丁基氧化 锡（IV) (0· 10g, 0· 42mmol, 0· 02eq)、对甲苯磺酰氯（3. 9g, 20. 8mmol, leq)和三乙胺 (2. 9mL, 20. 8mmol, leq)。混合物于室温搅拌3小时，加入水（40mL)。水层用二氯甲烧（3x 40mL)萃取。合并的有机层用盐水（20mL)洗涤，用Na2S04干燥，浓缩至干。所得油采用乙 酸乙酯/庚烷混合物（30%，50% )的梯度作为洗脱剂经柱色谱法纯化，得到9. 5g 7f，为橙 色油（85% )。
[0170]
[0171] 向化合物7f (9. 0g，16. 7mmol，leq)中加入氨溶液（7M甲醇溶液，420mL)。给烧瓶 盖上盖子，反应混合物于室温搅拌3天。将反应混合物浓缩至干，加入二氯甲烷（150mL)和 2N NaOH水溶液（50mL)。水层用二氯甲烷（50mL)萃取。合并的有机物用水（50mL)、盐水 (50mL)洗涤，用Na2S04干燥，浓缩至干。将所得化合物5c油直接进行下一步骤。
[0172] 向化合物5c (基于6. 4g 5c)在1，4-二噁烷（80mL)中的溶液中加入INNaOH水溶 液（80mL)。加入焦炭酸二叔丁基酯在1，4-二噁烷中的溶液（80mL)。混合物于室温搅拌18 小时，然后加入1M HC1水溶液至pH 6-7。混合物浓缩至一半体积，加入乙酸乙酯（200mL) 和水（200mL)。水层用乙酸乙酯（2x 200mL)萃取。合并的有机物用盐水洗涤，浓缩至干。 所得油采用70 %乙酸乙酯/庚烷溶液作为洗脱剂经柱色谱法纯化，得到6. 5g 5d，为橙色油 (80% ) 〇
[0173] 实施例7:制备式5e化合物
[0175] 向5d(6. 5g, 13. 4mmol, leq)在丙酮（130mL)中的溶液中加入2-二甲氧基丙烷 (16. 5mL, 134. 4mmo1, 10eq)和对甲苯横酸单水合物（0. 26g, 1. 34mmol, 0