使用3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶提高遗传修饰植物的生长和/或种子产量的方法
【专利说明】使用3-羟基-3-甲基戊二酿基-CoA合酶提高遗传修饰植物的 生长和/或种子产量的方法
[0001]相关申请的交叉引用 本申请要求享有2013年6月19日提交的美国临时申请系列号61/836,739的优先权，其 以其整体通过引用并入本文。
[0002] 序列表的并入 大小为14，640字节(在操作系统MS-Windows中测量的)并且在2014年4月16日创建的命 名为"56720-130938_SL.txt"的文件中含有的序列表同时被电子提交(使用United States Patent Office EFS-Web提交系统)并且其以其整体通过引用并入本文。 发明领域
[0003] 本发明一般涉及植物改造领域。具体而言，本发明涉及以有效提高生长和/或种子 产量的量过表达一种或多种外源3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶1 (HMGS1)的遗传改造 的植物以及提高遗传修饰的植物的生长和/或种子产量的方法。
[0004] 发明背景 现代农业中希望改善生长和/或种子产量，因为籽粒代表食物的重要来源(Jiao等， Nat. Genet.，42:541-544，2010)。为此目的，必须首先鉴定增加种子产量的关键基因。酶 3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶1 (HMGS1)和3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMGR) 参与甲轻戊酸（MVA)途径（Lynen等，Biochem.Z. 330:269-295，1958; Ferguson Jr.和 Rudney， J. Biol.Chem.234:1072_1075， 1959; Rudney和Ferguson Jr. ， J. Biol.Chem.234:1076-1080, 1959; Lynen, Pure Appl.Chem.14:137-167, 1967; Stewart和Rudney, J. Biol.Chem.241:1222-1225, 1966; Balasubramanlam等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:1421-1425，1977)。除了HMGR，HMGS 也是哺乳动物以及植物 中胆固醇合成的关键酶(Kimberly等，J. Biol.Chem.273:1349-1356，1998; Alex等， Plant J. 22:415-426，2000; Wang等，Plant Biotechnol.J. 10:31-42，2012)。在植物 中，研究最初聚焦在HMGR上，而后来才出现对HMGS的兴趣（Bach, Lipids, 21:82-88， 1986; Alex等，Plant J. 22:415-426，2000; Ishiguro等，Plant Cell Physiol.51: 896-911, 2010; Hemmerlin等，Prog·Lipid·Res· 51:95-148，2012)。在芥菜（Brassica juncea)中，四个基因（BjHMGSl-BjHMGS4)编码 HMGS(Alex 等，Plant J. 22:415-426， 2000)。对BjHMGSl的研究揭示了其定位在胞质溶胶中并且其重组蛋白质在大肠杆菌 (Escherichia coli)中的表达导致其晶体结构被阐明（Nagegowda等，Biochem.J. 383: 517-527，2004 ; Nagegowda等，Planta 221:844-856，2005 ; Pojer等， Proc .Natl. AcacL Sci .USA 103:11491-11496，2006)。对拟南芥 hmgs 突变体的分析揭示了 HMGS参与绒毡层发育并影响花粉粒的育性（Ishiguro等，Plant Cell Physiol. 51:896-911，2010)。近期已经研究了野生型和突变体BjHMGSl (H188N、S359A和H188N/S359A)在转 基因拟南芥中的过表达，其显示转基因拟南芥中BjHMGSl过表达上调固醇生物合成中的若 干基因，包括HMGR、SMT2、DWF1、CYP710A1和BR60X2，达到约11.3-26.8%的增加的固醇含量以 及提高的胁迫耐受性，如灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea)抗性和H2O2耐受性(Wang等， Plant Biotechnol.J. 10:31-42，2012)。然而，相同的研究显示转基因拟南芥中的 BjHMGSl过表达不导致植物生长的任何明显表型变化或种子产量的增加。当BjHMGSl在拟南 芥中过表达时，仅更快的种子萌发是明显的。
[0005] 需要具有提高的生长和/或种子产量(例如增加的荚果大小和种子数量)的遗传修 饰植物和用于产生所述遗传修饰植物的方法。本发明满足该需要。
[0006] 发明概述 本文提供具有提高的生长和/或种子产量的转基因植物。本文中还提供植物部分，包括 但不限于果实、叶、块茎、种子、花、茎、根和其他解剖部分，其中表达HMGS1及其突变衍生物 (H188N、S359A和H188N/S359A)。此外，本文提供提高植物生长和/或种子产量的方法以及筛 选芥菜HMGS1的功能变体的方法。
[0007] 在一个实施方案中，提供了被遗传改造以相对于对照植物有效提高生长和/或种 子产量的量过表达一种或多种外源HMGS1的转基因植物/种子/后代。转基因植物属于前科 (Solanaceae family)，并且一种或多种外源HMGS1包含与SEQ ID N0:6至少77%相同的氨基 酸序列。
[0008] 在另一实施方案中，提供了提高植物生长和/或种子产量的方法。该方法包括遗传 改造植物以相对于对照植物有效提高生长和/或种子产量的量过表达一种或多种外源 HMGS1。一种或多种外源HMGS1包含与SEQIDN0:6至少77%相同的氨基酸序列。
[0009] 在又一实施方案中，提供了筛选包含SEQ ID N0: 6中阐明的氨基酸序列的芥菜 HMGS1的功能变体的方法。该方法包括获得被遗传修饰以表达候选变体的植物细胞;从所述 植物细胞再生植物;和确定所述植物是否展示生长和/或种子产量增加，由此确定所述候选 变体是否是芥菜HMGS1的功能等同物的步骤。
[0010] 附图简述 图1显示了BjHMGSl转化构建体和对转基因烟草植物的所得聚合酶链式反应(PCR)分 析。图（a)显示了表明引物位置的转化载体的概略图。BjHMGSl野生型和突变体插入片段来 源于质粒pBjl32 (H188N/S359A)、pBjl34 (wtBjHMGSl)、pBjl36 (S359A)和pBjl37 (Η188Ν)<ΧαΜν353:花椰菜花叶病毒35S启动子;NOSpro:胭脂碱合酶(N0S)启动子;NOSter: N0S终止子;NPTII:编码针对卡那霉素的抗性的新霉素磷酸转移酶II基因；RB:T-DNA的右边 界;LB: T-DNA的左边界。35S: 35S启动子3 ' -端正向引物;ML264: BjHMGSl-特异的3 '-端反向 引物。图（b)显示了琼脂糖凝胶分析，使用引物对35S/ML264根据PCR阐明了来自转基因烟草 的预期1.65-kb BjHMGSl cDNA条带;在本文中显示了代表性株系。0E-wtBjHMGSl (泳道1-3);0E-H188N (泳道4-6);0E-S359A (泳道7-9);0E-H188N/S359A (泳道 10-12);阳性PCR对 照(泳道13, PCR模板为质粒pBjl34);空白（泳道14，PCR反应中没有DNA)。
[0011]图2显示了代表性转基因烟草HMGS-OEs的分子分析。图（a)显示了使用针对 B jHMGSl的抗体来验证代表性载体转化对照（pSal3)和HMGS-OEs (0E-wtB jHMGSl、0E-H188N、0E-S359A和0E-H188N/S359A)中BjHMGSl (52.4-kDa)表达的Western印迹分析和总 蛋白质的相应考马斯亮蓝染色的凝胶(20 yg/孔）。每个构建体测试了三个独立的株系。图 (b)显示了代表性载体转化对照（pSal3)和HMGS-OEs中BjHMGS 1和内源HMGR mRNAs的 Northern印迹分析。箭头指示预期的1.7-kb BjHMGSl条带和2.5-kb烟草HMGR条带。底部凝 胶显示每条泳道装载的rRNA。显示了每个构建体的两个独立的株系。
[0012] 图3显示了烟草HMGS-0E叶片和幼苗中的固醇含量。显示了在培养皿上生长的20天 龄幼苗的和在土壤中生长的60天龄盆栽植物的叶的固醇含量，包括菜油固醇、豆固醇、谷固 醇和总固醇。值为均值土 SD (n = 5) ;H，高于载体转化的对照;通过Student t-检验，*，P 〈0.05;林，P〈 0.0UDW:干重；S:幼苗；L:叶。条(Bars)代表SD。
[0013] 图4显示了烟草HMGS-0E幼苗与载体(pSal3)转化的对照之间根长和干重的比较。 图（a)显示了萌发后14天的幼苗。比例尺(Bar)，lcm。图（b)显示了 14天龄幼苗的干重，提示 烟草HMGS-OEs比载体转化的对照具有更高的质量。值为均值土 SD (n=30);条是SD;#，P〈 0.01。图（c)显示了 14天龄幼苗的根长测量，提示烟草HMGS-0E根比载体转化的对照生长得 更快。值为均值土 SD (n=30);条是SD;#，P〈 0.0UpSal3,载体转化的对照;0E植物是标 记的财-8]_腿651、!118815359厶和!1188~/5359八。
[0014]图5显示了烟草HMGS-OEs与载体转化的对照之间生长的比较。图（a)显示了萌发后 80天拍照的代表性温室生长植物。比例尺=10 cm。图（b)显示了萌发后136天拍照的代表 性温室生长植物。比例尺=10 cm。图（c)显示了两个不同生长阶段80天和136天时转基因 植物高度的统计学分析。值为均值土 SD (n=30);条是SD;H，高于对照;通过Student t-检 验，#，P〈 0.01 DpSan，载体转化的对照；0E植物是标记的wt-BjHMGSl、H188N、S359A和 H188N/S359A。
[0015] 图6显示了温室生长的HMGS-0E与在温室中生长的载体转化的对照之间植物生长 的比较。图（a)显示了萌发后98天拍照的代表性植物，其中HMGS-0E烟草植物和载体转化的 对照在生长上具有差异。比例尺=10 cm。图（b)显示了萌发后98天拍照的代表性烟草叶， 其中HMGS-0E烟草植物和载体转化的植物在生长上具有差异。比例尺=10 cm。图（c)显示 了对98天龄转基因植物高度的分析。图（d)显示了对98天龄转基因植物的底部四片叶的鲜 重的分析。图（e)显示了对98天龄转基因植物的底部四片叶的长度的分析。图（f)显示了对 98天龄转基因植物的底部四片叶的宽度的分析。值为均值± SD (n=6);条是SD;通过 Student t-检验，**，P〈0.01;*，P〈 0.05;**和*显著高于对照。载体转化的对照标记为 "pSal3"，wt-BjHMGSl植物的三个独立株系被标记为"401"、"402"和"404"，而S359A植物的 三个独立株系被标记为"602"、"603"和"606"。
[0016] 图7显示了具有增加的种子产量的烟草HMGS-OEs。图（a)显示了烟草荚果的表型。 pSal3:载体转化的对照；"401"和"402" ：wt-BjHMGSl的两个独立株系；"603"和"604" ：S359A 的两个独立株系。比例尺=1 cm。图（b)显示了 30个烟草荚果的总干重。图（c)显示了每个荚 果的平均干重。图（d)显示了 30个荚果的种子总干重。图（e)显示了对照与烟草HMGS-OEs之 间100粒种子的干重的比较。对每个株系测量30次重复。结果是每一株系30次重复每100粒 烟草种子的平均干重。图（f)显示了 30个荚果里的总种子数量。图（g)显示了每个荚果的平 均种子数量。值为均值土 SD，n = 30;通过Student t-检验，#，P〈 0.01;*，P〈0.05。
[0017] 图8显示了通过qRT-PCR的20天龄载体转化的对照(pSal3)烟草幼苗中HMGS下游基 因的表达。研究了 wt-BjHMGSl烟草幼苗的三个独立株系(401、402和404)和33594烟草幼苗 的三个独立株系（602、603和606)。从载体转化的对照化5&13)、￥卜8犯]\?^1(401、402和 404)和S359A(602、603和606)的20天龄烟草幼苗提取总RNA。!!:值高于对照（P〈0.05);L:值 低于对照(Ρ〈〇·〇5)。值为均值土 SD (n=3)。分析了烟草(Nicotiana tabacum)3_羟基-3-甲 基戊二酰基-CoA还原酶（NtHMGRl和NtHMGR2)、异戊烯基-二磷酸δ-异构酶（NtIPIl和 NtIPI2)、法呢基二磷酸合酶(NtFPPS)、角鲨烯合酶(NtSQS)、栊牛儿基栊牛儿焦磷酸合酶 (NtGGPPSl)、固醇甲基转移酶(NtSMTl-2、NtSMT2-l和NtSMT2-2)和细胞色素 P450单加氧酶 (NtCYP85Al)〇
[0018] 图9显示了完全开放的载体转化的对照(pSal3)烟草花中HMGS下游基因的表达。通 过qRT-PCR研究了 wt-BjHMGSl烟草花的三个独立株系（401、402和404)和3359六烟草花的三 个独立株系（602、603和606)。从载体转化的对照（？3&13)、￥丨-8」圓631(401、402和404)和 S359A(602、603和606)的3周龄烟草幼苗提取总RNA。!!:值高于对照(P〈0.05);L:值低于对照 (卩〈0.05)。值为均值±30(11=3)。
[0019] 图10显示了用于番茄转化的BjHMGSl构建体和对所得转基因番茄株系的PCR分析。 图（a)显示了表明引物位置的转化载体的概略图。BjHMGSl野生型和突变体插入片段分别来 源于pBjl34 (wtBjHMGSl)和pBjl36 (S359A)(Wang等，PlantBiotechnol J 10:31-42， 2012)<XaMV35S:花椰菜花叶病毒35S启动子;NOSpro:胭脂碱合酶(NOS)启动子;NOSter: N0S终止子;NPTII:编码赋予卡那霉素的抗性的新霉素磷酸转移酶II的基因；RB:T-DNA的右 边界;LB: T-DNA的左边界。35S: 35S启动子3 ' -端正向引物;ML860: B jHMGSl-特异的3 ' -端反 向引物。图（b)显示了琼脂糖凝胶分析，使用引物对35S/ML860根据PCR阐明了来自野生型 BjHMGSl转基因番茄的预期1.4-kb BjHMGSl cDNA条带（箭指向的）。泳道1，1 kb标志物;泳 道2，阳性对照（pB j 134的质粒）；泳道3，阴性对照（载体pSa 13的质粒）；泳道4，pB j 134-1 (401);泳道5,pBj 134-3 (403);泳道6,pBj 134-5 (405);泳道7,pBj 134-6 (406);泳道8， pBjl34-21 (421);泳道9，pBjl34-23 (423);泳道 10，pBjl34-30 (430);泳道ll，pBjl34-42 (442);泳道 12，pBjl34-45 (445)。质粒pBjl34是pSal3衍生物，其含有35S::野生型BjHMGSl (wtBjHMGSl)融合物(Wang等，Plant Biotechnol.J. 10:31-42，2012)。图（c)显不了琼脂 糖凝胶分析，使用引物对35S/ML860根据PCR阐明了来自突变体B jHMGSl (S359A)转基因番茄 的预期1.4-kb BjHMGSl cDNA条带（箭指向的）。泳道1，1 kb标志物；泳道2,阳性对照 (pB j 134的质粒）；泳道3，阴性对照（载体pSal 3的质粒）；泳道4，pB j 136-5 (605);泳道5， pBjl36-7 (607);泳道6，pBjl36-8 (608);泳道7，pBjl36-12 (612);泳道8，pBjl36-13 (613);泳道9，pBjl36-14 (614);泳道 10，pBjl36-15 (615);泳道ll，pBjl36-22 (622);泳 道 12，pBjl36-25 (625)。质粒pBjl36是pSal3衍生物，其含有35S::突变体BjHMGSl(S359A) 融合物（Wang等，Plant Biotechnol.J. 10:31-42，2012)。
[0020] 图11显示了代表性转基因番茄HMGS-OEs的分子分析。图（a)显示了使用针对 BjHMGSl的抗体来验证代表性载体(pSal3)转化的对照和野生型HMGS-OEs (0E-wtBjHMGSl) 中BjHMGSl (52.4-kDa)表达的Western印迹分析和装载在12% SDS-PAGE凝胶中的总蛋白质 的相应考马斯亮蓝染色的凝胶(20 yg/孔）。在阳性对照和交叉反应的番茄株系中显示了交 叉反应的52.4-kDa BjHMGSl条带（箭头指向的）。泳道1，阳性对照（烟草BjHMGSl 0E株系 "402"）；泳道 2，载体（pSa 13)-转化的对照；泳道 3，pB j 134-6 (406);泳道 4，pB j 134-10 (410);泳道5，pBjl34-13 (413);泳道6，pBjl34-14 (414);泳道7，pBjl34-15 (415);泳道 8，pBjl34-27 (427);泳道9，pBjl34-28 (428);泳道 10，pBjl34-30 (430);泳道ll，pBjl34-39 (439);泳道 12，pBjl34-42 (442);泳道 13，pBjl34-44 (444);泳道 14，pBjl34-45 (445)。在用于进一步测试中的ΟΕ-wtBjHMGSl植物"430"和"445"（泳道10和14)的两个独立 株系下面划线。质粒pBj 134是pSal3衍生物，其含有35S::野生型BjHMGSl (wtBjHMGSl)融合 物(Wang等，Plant Biotechnol.J. 10:31-42，2012)。图（b)显示了使用针对BjHMGSl的抗 体来验证代表性载体（pSal3)转化的对照和突变体HMGS-OEs (0E-S359A)中BjHMGSl (52.4-kDa)表达的Western印迹分析和装载在12% SDS-PAGE凝胶中的总蛋白质的相应考马 斯亮蓝染色的凝胶（20 yg/孔）。在阳性对照和交叉反应的番茄株系中显示了交叉反应的 52.4-kDa BjHMGSl条带（箭头指向的）。泳道1，阳性对照(烟草BjHMGSl 0E株系"402"）；泳 道2,载体(pSal3)转化的对照；泳道3，pBjl36-5 (605);泳道4，pBjl36-13 (613);泳道5， pBjl36-15 (615);泳道6，pBjl36-19 (619);泳道7，pBjl36-20 (620);泳道8，pBjl36-22 (622);泳道9，pBjl36-23 (623);泳道 10，pBjl36-24 (624);泳道ll，pBjl36-25 (625);泳 道12，pBjl36-31 (631);泳道13，pBjl36-35 (635)。在用于进一步测试中的0E-S359A 植物 "622"和"625"（泳道8和11)的两个独立株系下面划线。质粒pBj 136是pSal3衍生物，其含有 35S::突变体 BjHMGSl(S359A)融合物（Wang 等，Plant Biotechnol.J. 10:31-42，2012)。 [0021]图12显示了代表性转基因番前植物的Southern印迹分析。图（a)显示了表明 EcoRI (E)位点的转化载体的概略图。BjHMGSl野生型和突变体插入片段来源于质粒 pBjl34 (wtBjHMGSl)和pBjl36 (S359A)<XaMV35S:花椰菜花叶病毒35S启动子;NOSpro:胭 脂碱合酶(N0S)启动子;NOSter:N0S终止子;NPTII:编码赋予卡那霉素的抗性的新霉素磷酸 转移酶Π 的基因；RB: T-DNA的右边界;LB: T-DNA的左边界。虚线表示载体上核苷酸的位置。 图（b)显示了在代表性印迹中通过限制性内切核酸酶EcoRI消化的并利用地高辛标记的 BjHMGSl全长cDNA探测的基因组DNA的Southern印迹分析。预期杂交条带比4.8 kb长(参见 图（a)中的图）。泳道 l，pBjl34-30 (430);泳道 2，pBjl36-15 (615);泳道 3，pBjl36-17 (617);泳道4，pB j 136-19 (619);泳道5，pB j 136-25 (625);泳道6，载体(pSa 13)-转化的对 照；泳道7，pBjl36-15 (615);泳道8，pBjl36-17 (617);泳道9，pBjl36-19 (619);泳道 10， pBjl36-21 (621);泳道ll，pBjl36-23 (623);泳道 12，pBjl36-28 (628);泳道 13，pBjl36-35 (635);泳道 14，pBjl36-13 (613);泳道 15,载体(pSal3)_ 转化的对照；泳道 16，pBjl34