感病毒抗原中的一种或多种;进一步优选地，所述其他抗原为猪 传染性胃肠炎病毒抗原。
[0082] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0083] 本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法;所述的生物材料，若无特 殊说明，均可从商业途径获得。
[0084] 实施例1抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备、纯化、鉴定及检验
[0085] 1.1抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备和纯化
[0086] 将猪流性腹泻病毒HN1301株（参见中国专利CN104513827A)按照张丽燕等（张丽 燕.猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的研制.四川农业大学.硕士论文）中的方法纯化病毒，免 疫小鼠，克隆获得杂交瘤细胞，在小鼠体内制备2株单克隆抗体。
[0087] 将制备的2株单克隆抗体按照陈丹等（陈丹，孙广瑞，柳增善.辛酸-硫酸铵联合沉 淀法在单克隆抗体纯化中的应用.安徽农业科学，2007，35(26): 8105，8108)的辛酸-硫酸铵 联合沉淀法纯化单克隆抗体的操作方法分别纯化抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McABl、抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB2。
[0088] 1.2抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的鉴定
[0089] 1.2.1单克隆抗体类型和亚类的鉴定
[0090] 运用PierceRapidELISAMousemAbIsotypingKit并参照说明书对抗体的亚 型进行鉴定。鉴定结果见表1:
[0091] 表1各单克隆抗体类型的鉴定
[0094] 注:+表示阳性反应，-表示阴性反应。
[0095] 由表1可知，单克隆抗体PEDV-McABl、单克隆抗体PEDV-McAB2重链亚型都为IgG2a， 轻链类型都为kappa。
[0096] 1.2.2单克隆抗体特异性的鉴定
[0097] 将PEDV、TGEV、PoRV、PRRSV、PRV及Vero细胞分别包被反应板，测定单克隆抗体PEDV-McABl、单克隆抗体PEDV-McAB2 与PEDV、TGEV、PoRV、PRRSV、PRV及Vero细胞是否具有交 叉反应性。
[0098] 测定结果显示：单克隆抗体PEDV-McABl、单克隆抗体PEDV-McAB2与TGEV、PoRV、PRRSV、PRV及Vero细胞均无交叉反应，仅与PEDV反应呈阳性，表明单克隆抗体PEDV-McABl、 单克隆抗体PEDV-McAB2均是抗猪流行性腹泻病毒的特异性单克隆抗体。
[0099] 1.3纯化后单克隆抗体的检验
[0100] 1.3.1外观检验
[0101] 室温下，肉眼观察可见纯化的单克隆抗体PEDV-McAB1、单克隆抗体PEDV-McAB2均 呈无色澄清状态，未见絮状物沉淀。
[0102] 1.3.2无菌检验
[0103] 采用无菌检验法，分别取纯化后的单克隆抗体原料接种10ml/管的营养琼脂斜面 培养基、改良马丁培养基和硫乙醇酸盐培养基各2管(接种量为0.5ml/管）。接种后的硫乙醇 酸盐培养基及营养琼脂斜面培养基各一管置于30_35°C培养，另一管于2〇-25°C培养。改良 马丁培养基置于20_25°C培养。同时以无菌生理盐水同法操作做阴性对照。培养14天后均未 观察到培养基中有微生物生长，观察结果表明：单克隆抗体PEDV-McABl、单克隆抗体PEDV-McAB2原料均符合无菌要求。
[0104] 1.3.3单克隆抗体的纯度
[0105] 采用陈丹等（孙广瑞，柳增善.辛酸-硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应 用.安徽农业科学，2007，35(26): 8105，8108)SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定，上样量为10yg， 检测结果如图1所示。结果表明：单克隆抗体PEDV-McAB1、单克隆抗体PEDV-McAB2的纯度均 不低于95%。
[0106] 1.3.4单克隆抗体相对亲和力的测定
[0107] 将制备的单克隆抗体PEDV-McABl、单克隆抗体PEDV-McAB2按照宋帅等（宋帅，林 彤，邵军军，常惠芸.抗〇型口蹄疫病毒单克隆抗体相对亲和力的测定.兽医免疫学，2009，25 (4) :333-335)中的操作方法测定其相对亲和力。其中抗原的包被浓度为5yg/ml，酶标二抗 的稀释度为1:10000,测定纯化后的单克隆抗体的相对亲和力。计算结果表明：单克隆抗体 PEDV-McABl的相对亲和力为0 · 78yg/ml，单克隆抗体PEDV-McAB2的相对亲和力为0 · 44yg/ ml〇
[0108] 1.3.5单克隆抗体中和活性的测定
[0109] 2株单克隆抗体与500TCID5Q的不同来源的PEDV毒株中和后接种Vero细胞，通过中 和试验测定该单克隆抗体具有中和疫苗株PEDVCV777株、疫苗株SM98株及流行毒株的代表 毒株HN1301株的能力。测得单克隆抗体PEDV-McABl中和抗体效价均不小于1:512，表明单克 隆抗体PEDV-McABl具有良好的中和活性，而单克隆抗体PEDV-McAB2的中和抗体效价均小于 1:2，表明单克隆抗体PEDV-McAB2无中和活性。
[0110]表2用不同毒株与单克隆抗体中和后测得的中和抗体效价
[0111]
[0112] 1.4单克隆抗体含量的测定
[0113] 用BCA蛋白定量试剂盒分别对单克隆抗体PEDV-McABl、单克隆抗体PEDV-McAB2按 照说明书进行定量分析，测定结果表明：单克隆抗体PEDV-McABl、单克隆抗体PEDV-McAB2的 浓度分别为4、4.5mg/ml。
[0114] 1.5单克隆抗体的配对
[0115] 选择HN1301株猪流行性腹泻病毒，稀释到105Λ(Π05()/πι1，对不同搭配模式进行检 测，结果见表3:
[0116]表3单克隆抗体搭配
[0117]
[0118] 注："+"表示阳性，表示阴性。
[0119] 结果表明：标记单克隆抗体PEDV-McABl和固定单克隆抗体PEDV-McAB2检测猪流行 性腹泻病毒液为阴性，其余搭配检测结果均为阳性。因而选择固定单克隆抗体PEDV-McABl、 标记单克隆抗体PEDV-McAB2为搭配方式。
[0120] 实施例2单克隆抗体可变区序列的测定
[0121 ] 2.1单克隆抗体重链和轻链可变区引物设计
[0122] 根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：
[0123]PI:5 '-ACTAGTTGACGTGGTCTCTAGGGTCACTTTAGTTTTCCT-3'
[0124]P2:5 '-CGGAAGCTTCCAGCGRCCARKCCATATACIGRTGG-3 '
[0125]设计轻链可变区引物序列：
[0126]P3:5 '-GCCATCTCATGRAGWCATTKWCYCAAGTCTTT-3 '
[0127]P4:5 '-CGGACGCTTACTGCCTGGTAAGAAGATGGA-3 '
[0128] 2.2单克隆抗体可变区序列测定
[0129]按照张爱华等(张爱华，闭兰，王志友等.系列鼠抗⑶分子单克隆抗体轻、重链可变 区基因的克隆和序列分析.中国生物制品学杂志，2001，15(2):65-68)建立的可变区序列测 定方法，通过分子克隆技术分别获得单克隆抗体PEDV-McABl、单克隆抗体PEDV-McAB2的可 变区序列，选取对应的克隆质粒送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。
[0130] 测定单克隆抗体PEDV-McABl的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQID No.l、SEQIDNo.3所示，由其推导的氨基酸序列分别为SEQIDNo.2、SEQIDNo.4;单克隆 抗体PEDV-McAB2的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQIDNo.5、SEQIDNo.7 所示，由其推导的氨基酸序列分别为SEQIDNo.6、SEQIDNo.8。
[0131]实施例3试剂盒的制备及应用
[0132] 3.1试剂盒之胶体金检测试纸条
[0133]胶体金检测试纸条的制备:按照李红梅等(李红梅，聂政，陈佳等.免疫检测用的胶 体金制备工艺的优化研究.食品工业科技，2009，30(12): 289-291)建立的胶体金制备方法， 制备胶体金溶液并标记单克隆抗体PEDV-McAB2，单克隆抗体PEDV-McABl和羊抗鼠IgG(购自 Sigma公司）喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线，将该硝酸纤维素膜和浸润有 金标单克隆抗体PEDV-McAB2的金标垫用塑料外壳包装起来，做成胶体金检测试纸条。并配 置相应的磷酸盐缓冲液作为样品处理液。检测时，将待检样品置于样品处理管中，使样品尽 可能溶解在溶液中，将含有待检样品的样品处理管盖子头部折断，滴加2-3滴混匀后的样品 (约80μ1)至试纸条加样孔中心；10分钟后在检测试纸条的检测区观察记录结果，并依据判 定标准进行判定。结果判定标准：质控线显色则试验成立，检测线显色即为阳性、不显色即 为阴性;质控线未显色则试验不成立，无论检测线是否显色均判定为无效结果，需重测。
[0134] 质量研究：
[0135] (1)灵敏度检验:将PEDVΗΝ1301株病毒液(病毒滴度为106'5TCID5Q/ml)进行10倍倍 比稀释，稀释至毒价为105'5TCID 5Q/ml、104'5TCID5Q/ml、103'5TCID5()/ml，用胶体金检测试纸条 进行检测。结果显示试纸条的检测下限为l〇4、CID5()/ml。
[0136] (2)敏感性检验:将PEDV(HN1301株和CV777株)病毒液(病毒滴度均为106'5TCID50/ ml)进行 10倍倍比稀释，稀释至毒价为 105'5TCID5Q/ml、104'5TCID5Q/ml、103'5TCID5Q/ml，用胶 体金检测试纸条进行检测。结果显示试纸条对PEDVHN1301株和CV777株的检测下限均为 104-5TCID5〇/ml〇
[0137] (3)特异性测定:取猪传染性胃肠炎病毒(华毒株)病毒液、猪轮状病毒(0SU株)病 毒液、猪细小病毒(WH-1株)病毒液、猪痕病毒(C株)病毒液、猪伪狂犬病病毒(BarthaK-61 株)病毒液，以及阴性粪便样品，按照胶体金检测试纸条检测方法进行检测。结果显示试纸 条检测以上6份特异性样品均为阴性。
[0138] (4)重复性试验
[0139]批间重复性:取3批猪流行性腹泻病毒胶体金检测试纸条按实施例3.1中所述的检 测方法分别检测PEDV阳性和阴性样品。试纸条批间的符合率大于90%，且试纸条间检测同 一份样品的显色强度一致。
[0140]批内重复性:取1批猪流行性腹泻病毒胶体金检测试纸条，由1人对PEDV阳性和阴 性样品进行重复检测三次。试纸条批内的符合率大于90%，且试纸条间检测同一份样品的 显色强度一致。
[0141]临床应用:将采集的20份临床样品按照实施例3.1中所述的检测方法进行检测，结 果见表4。
[0142]同时，20份临床样品分别用邹勇等建立的RT-PCR(邹勇，钱永清，唐永兰等.猪流行 性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪轮状病毒RT-PCR鉴别诊断技术研究.上海农业学报，2003，2: 82-84)和胶体金试纸条(韩国安捷公司，参照试剂盒参考说明书进行操作)检测，结果见表 4〇
[0143]由表4可知:试纸条的检测结果和RT-PCR检测结果的符合率达到了 90%，并且没有 出现非特异性。安捷纸条与RT-PCR检测结果的符合率为80%，且有假阳性结果的出现。故自 制胶体金试纸条的敏感性和特