毒活性研究.新疆农 业大学硕士学位论文，2014)建立的单链抗体制备的操作方法，分别用单克隆抗体PEDV-McABl和单克隆抗体PEDV-McAB2的可变区序列制备相对应的单链抗体1和单链抗体2,用单 克隆抗体PEDV-McABl的重链可变区和单克隆抗体PEDV-McAB2的轻链可变区制备单链抗体 3，用单克隆抗体PEDV-McAB2的重链可变区和单克隆抗体PEDV-McAB1的轻链可变区制备单 链抗体4。
[0187] 取实施例1.1制备HN1301株PEDV接种细胞，至细胞出现30%的病变，用80%丙酮4 °C固定30min，用PH7.4PBS洗涤3次，5min/次，分别加入单链抗体1、单链抗体2、单链抗体3和 单链抗体4置于37°C作用lh，用pH7.4PBS洗涤3次，5min/次，加入FITC标记的兔抗鼠IgG置于 37°C作用lh，用pH7.4PBS洗涤3次，5min/次，置于荧光显微镜下观察。
[0188] 按照实施例1.3.5操作方法，测定单链抗体1、单链抗体2、单链抗体3和单链抗体4 的中和效价。
[0189] 结果显示:单链抗体1、单链抗体2、单链抗体3和单链抗体4均可以和猪流行性腹泻 病毒发生特异性反应。单链抗体1和单链抗体3的中和效价为1:64,而单链抗体2和单链抗体 4无中和效价。
[0190] 以上结果显示SEQIDNo·l、SEQIDNo·3、SEQIDNo·5和SEQIDNo·7可用于猪 流行性腹泻病毒基因工程抗体的制备。
[0191] 以上全面描述了本发明的优选实施例，但是可对它们进行各种替代和修改。因此， 不应参照以上描述来决定本发明的范围，而是应参照所附权利要求书及其全部等同物来决 定本发明的范围。任何特征，（不论是否为优选)均可与任何其他特征(不论是否为优选)相 结合。本发明的权利要求书不应被理解为具有方法+功能的限制，除非在某一权利要求中通 过术语"…的方法"明确地列举出此类限制。
【主权项】
1.一种特异性结合猪流行性腹泻病毒的鼠单克隆抗体PEDV-McABl的可变区序列，其 中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个 氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体;2)轻链可变区氨基酸序列 为SEQ IDNo.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰 保守性突变获得的保守性变异体。2. -种由权利要求1所述的可变区序列中重链可变区序列或其保守性变异体，和/或所 述的可变区序列中轻链可变区序列或其保守性变异体组成的抗体;所述抗体可以为单克隆 抗体、基因工程抗体;其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆 抗体、猪源单克隆抗体或所述抗体的片段;所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合 猪流行性腹泻病毒的能力；优选地，所述抗体为单克隆抗体PEDV-McABl，所述单克隆抗体 PEDV-McABl重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNo.2,轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID Νο·4〇3. -种特异性结合猪流行性腹泻病毒的鼠单克隆抗体PEDV-McAB2的可变区序列，其 中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNo.6所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个 氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体;2)轻链可变区氨基酸序列 为SEQ IDNo.8所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰 保守性突变获得的保守性变异体。4. 一种由权利要求3所述的可变区序列中重链可变区序列或其保守性变异体，和/或所 述的可变区序列中轻链可变区序列或其保守性变异体组成的抗体;所述抗体可以为单克隆 抗体、基因工程抗体;其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆 抗体、猪源单克隆抗体或所述抗体的片段;所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合 猪流行性腹泻病毒的能力；优选地，所述抗体为单克隆抗体PEDV-McAB2,所述单克隆抗体 PEDV-McAB2重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNo.6，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID No. 8〇5. -种药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的权利要求2所述的抗体或所述 抗体的片段，以及药学上可接受的载体;优选地，所述药物组合物包含免疫量的所述单克隆 抗体PEDV-McABl，以及药学上可接受的载体;优选地，所述药物组合物包含免疫量的权利要 求1所述单克隆抗体PEDV-McAB1的重链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体； 更优选地，所述药物组合物包含免疫量的权利要求1所述单克隆抗体PEDV-McABl的重链可 变区和轻链可变区序列制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体;更优选地，所述药物组 合物包含免疫量的权利要求1所述单克隆抗体PEDV-McABl的重链可变区和权利要求3所述 单克隆抗体PEDV-McAB2的轻链可变区序列制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。6. -种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的权利要求2所述的抗体或所述抗体的片 段，和/或有效量的权利要求5所述的抗体或所述抗体的片段，以及用于对猪流行性腹泻病 毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照;优选地，其中，所述权利要 求2所述的抗体或所述抗体的片段以及权利要求5所述的抗体或所述抗体的片段使用酶标 记，所述用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述标记的 酶产生颜色反应的底物;优选地，所述试剂盒包括有效量的权利要求2所述的单克隆抗体 PEDV-McABl，和/或有效量的权利要求4所述的单克隆抗体PEDV-McAB2，用于对猪流行性腹 泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。7. -种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的权利要求2所述的抗体或所述抗体的片 段，和/或有效量的权利要求5所述的抗体或所述抗体的片段，以及用于对猪流行性腹泻病 毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照;优选地，其中，所述用于对 猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述抗体或所述抗体的片 段结合的酶标二抗以及与所述标记的酶产生颜色反应的底物，所述酶标二抗包括酶标羊抗 鼠多抗、酶标羊抗鼠二抗;优选地，所述试剂盒包括有效量的权利要求2所述的单克隆抗体 PEDV-McABl，和/或有效量的权利要求4所述的单克隆抗体PEDV-McAB2，用于对猪流行性腹 泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。8. -种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McABl、有效量的 所述单克隆抗体PEDV-McAB2,以及用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的 检测试剂； 其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括底板，所述底板 具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有滤纸、样品垫、金标垫、 硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗 原与所述单克隆抗体PEDV-McAB2的结合体能在其上向底板第二端迀移;所述金标垫上含有 胶体金标记的所述单克隆抗体PEDV-McAB2,所述硝酸纤维素膜近所述底板第二端的位置上 包括一条检测线和一条质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体PEDV-McABl，所述 质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。9. 一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McABl、有效量的 所述单克隆抗体PEDV-McAB2,以及用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的 检测试剂； 其中，所述试剂盒包括缓冲液供应单元和酶免疫层析检测试纸条;所述缓冲液供应单 元用于将缓冲液供给所述酶免疫层析检测试纸条;所述酶免疫层析检测试纸条包括硝酸纤 维素膜（1)，所述酶免疫层析检测试纸条在纵向上依次包括底物供应区、样品供应区、检测 区;所述底物供应区包括底物垫(3)，其上吸附有干燥的酶底物，所述底物垫(3)与硝酸纤维 素膜(1)接触，所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元 的远端迀移;所述样品供应区包括酶标垫(2)，其上吸附有酶标记的所述单克隆抗体PEDV-McAB2,所述酶底物能与所述单克隆抗体PEDV-McAB2上标记的酶产生显色反应，所述酶标垫 (2)与硝酸纤维素膜(1)接触，所述单克隆抗体PEDV-McAB2溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜 (1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迀移；以及所述检测区固定化有所述单克隆抗体 PEDV-McABl； 其中，所述缓冲液供应单元包括展开液垫(5)、底物缓冲液槽(8)、底物缓冲液(9)和缓 冲液按钮，所述底物缓冲液(9)放置于底物缓冲液槽(8)中，所述缓冲液按钮位于底物缓冲 液槽(8)的上方，按下可将所述展开液垫(5)浸入缓冲液(9)中；所述检测区包括检测线(6)、 质控线(7)，其中，所述质控线(7)较检测线(6)更远离所述样品供应区，在所述检测线(6)上 固定化有所述单克隆抗体PEDV-McABl，在所述质控线（7)上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠 多抗，且吸附在酶标垫(2)上的酶标记的所述单克隆抗体PEDV-McAB2对于固定在检测线(6) 上的所述单克隆抗体PEDV-McABl而言是过量的；所述硝酸纤维素膜（1)全段粘附在所述支 撑物（10)上，支撑物（10)连接所述缓冲液供应单元，底物供应区，样品供应区，检测区以及 吸水垫(4)，所述吸水垫(4)在距所述缓冲液供应单元的最远端；以及检测样品（11)加入的 位置为所述酶标垫(2)的位置。10. -种试剂盒，其中，所述试剂盒包括包被所述单克隆抗体PEDV-McABl的ELISA板、含 酶标记所述单克隆抗体PEDV-McAB2的反应液、用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应 进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照;优选地，其中，所述试剂盒包括包被所述单克隆 抗体PEDV-McABl的ELISA板、含酶标记所述单克隆抗体PEDV-McAB2的反应液、洗涤液、稀释 液、底物显色液、终止液、阴性对照、阳性对照;其中，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液，所述稀释 液为含牛血清白蛋白的溶液，所述底物显色液为四甲基联苯胺TMB显色液，所述终止液为 2mol/l的浓H2S04溶液，所述阴性对照为磷酸盐缓冲液，所述阳性对照为包含灭活纯化后的 猪流行性腹泻病毒的溶液。11. 一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括包被猪流行性腹泻病毒抗原的ELISA板、含所述 单克隆抗体的反应液、洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液、阴性对照、阳性对照;其中，含 所述单克隆抗体的反应液为含所述单克隆抗体PEDV-McABl的反应液、或含所述单克隆抗体 PEDV-McAB2的反应液、或含所述单克隆抗体PEDV-McABl与所述单克隆抗体PEDV-McAB2的混 合反应液;其中，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液，所述稀释液为含牛血清白蛋白的溶液，所述 底物显色液为四甲基联苯胺TMB显色液，所述终止液为2mol/l的浓H2S04溶液，所述阴性对照 为磷酸盐缓冲液，所述阳性对照为包含灭活纯化后的猪流行性腹泻病毒的溶液。12. 如权利要求6~11任一项所述试剂盒在非诊断目的的猪流行性腹泻病毒检测中的 应用;优选地，所述非诊断目的的猪流行性腹泻病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进 行检测、表位鉴定研究以及定性和定量鉴别检验含猪流行性腹泻病毒抗原和其他抗原的疫 苗组合物中的猪流行性腹泻病毒抗原的检测。
【专利摘要】本发明提供了特异性结合猪流行性腹泻病毒的鼠单克隆抗体的可变区序列、其制备的抗体或抗体片段，以及使用该抗体制备的疫苗和试剂盒。本发明的药物组合物能有效预防和治疗猪流行性腹泻病毒感染。本发明的试剂盒能有效检测猪流行性腹泻病毒，灵敏度高，检测快速。
【IPC分类】A61P31/14, C07K16/10, G01N33/577, G01N33/569, A61K39/395
【公开号】CN105461805
【申请号】CN201510948571
【发明人】田克恭, 张云静
【申请人】洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月17日