琼脂糖电泳鉴定PCR扩增产物。
[0138] (2)结果如图2所示，特异性PCR检测引物的5'端加尾之后，检测特异性明显提高。
[0139] 同时，图2中的各泳道为不同引物浓度下的PCR结果，可见18、19、20、21外显子加尾 引物分别在引物浓度范围〇 · 3125-40ymoL/L、1 · 25-40ymoL/L、1 · 25-40ymoL/L、0 · 3125-40μ m〇L/L内均可见单一目的扩增条带；相较各无尾引物的适宜引物浓度范围1.25-5ym 〇L/L、 0 · 625-40ymoL/L、5-40ymoL/L、0 · 3125-20ymoL/L来说，5 '加尾PCR引物具有相似或更宽的弓丨 物应用浓度范围。
[0140] 以上结果表明，未加尾时，随着引物浓度的变化，引物浓度持续降低或者持续升 高，检测效果都会逐渐变差，而加尾之后检测结果的特异性没有随着引物浓度的改变而出 现明显的变化，即上述在EGFR基因的18、19、20、21外显子特异性引物的5'端加尾之后，具有 了相似或更宽的引物应用浓度范围。
[0141] 实施例3表皮生长因子受体"6?1〇18、19、20、21外显子的？0?检测--15bp加尾
[0142] 1、在实施例1所设计的EGFR基因18~21外显子的特异性PCR引物18F/18R、19F/ 19R、20F/20R和21F/21R，以及5'加尾特异性PCR引物(尾长20bp)的基础上，分别设计合成5' 加尾长度为15bp的5'加尾特异性PCR引物，具体加尾后的特异性引物序列如下所示：
[0143] 18F-15T(SEQIDN0.17K*):5'-TGTTACTCGGGATTAGGCTGAGGTGACCCTT-3' ；
[0144] 18R-15T(SEQ ID N0·18所示）：5'-CACGACTGAGAGCACGAGTAAAGTAGATGATGGAAATA-3，。
[0145] 19F-15T(SEQIDN0.19K*):5'-GGTCAGTCGGCATTAAGCATGTGGCACCATC-3' ；
[0146] 19R-15T(SEQ ID N0.20所示）：5'-CACGACGGTCAGCACCTAGAGCTAGAAAGGGAAAG-3'。
[0147] 20F-15T(SEQIDN0.2U；f*):5'-AGTCAAGCGGAATTACCATGCGAAGCCACA-3' ；
[0148] 20R-15T(SEQ ID N0.22所示）：5'-CACCACTCTCAGCACTCCCTTCCCTGATTACCT-3'。
[0149] 21F-15T(SEQIDN0.23K*):5'-GCTCAAGCGGGATTAGCATGAACATGACCCTGAA-3' ；
[0150] 21R-15T(SEQ ID N0.24所示）：5'-CACGACTCAAATCACGCTGACCTAAAGCCACCT-3'。
[0151] 2、样本基因组DNA提取、PCR反应体系、PCR反应条件、PCR产物鉴定同实施例1。
[0152] 3、结果如附图3所示，特异性PCR检测引物的5'端加尾之后，检测特异性明显提高。
[0153] 同时，图3中的各泳道为不同的退火温度下的PCR结果，加尾之后检测结果的特异 性没有随着退火温度的改变而出现明显的变化，即上述在EGFR基因的18、19、20、21外显子 特异性引物的5'端加尾之后，具有了更宽的适宜退火温度范围，结果与实施例1相同。
[0154] 实施例4表皮生长因子受体"6?1〇18、19、20、21外显子的？0?检测--10bp加尾
[0155] 1、在实施例1所设计的EGFR基因18~21外显子的特异性PCR引物18F/18R、19F/ 19R、20F/20R和21F/21R，以及5'加尾特异性PCR引物(尾长20bp)的基础上，分别设计合成5' 加尾长度为l〇bp的5 '加尾特异性PCR引物，具体加尾后的特异性引物序列如下所示：
[0156] 18F-10T(SEQIDN0.25K*):5'-CTCGGGATTAGGCTGAGGTGACCCTT-3' ；
[0157] 18R-10T(SEQ ID N0.26所示）：5'-CTGAGAGCACGAGTAAAGTAGATGATGGAAATA-3'。
[0158] 19F-10T(SEQIDN0.27K*):5'-GTCGGCATTAAGCATGTGGCACCATC-3' ；
[0159] 19R-10T(SEQ ID N0.28所示）：5'-CGGTCAGCACCTAGAGCTAGAAAGGGAAAG-3'。
[0160] 20F-10T(SEQIDN0.29m*):5'-AGCGGAATTACCATGCGAAGCCACA-3' ；
[0161] 20R-10T(SEQ ID N0.30所示）：5'-CTCTCAGCACTCCCTTCCCTGATTACCT-3'。
[0162] 21F-10T(SEQIDN0.3U；f*):5'-AGCGGGATTAGCATGAACATGACCCTGAA-3' ；
[0163] 21R-10T(SEQ ID N0.32所示）：5'-CTCAAATCACGCTGACCTAAAGCCACCT-3'。
[0164] 2、样本基因组DNA提取、PCR反应体系、PCR反应条件、PCR产物鉴定同实施例1。
[0165] 3、结果如附图4所示，特异性PCR检测引物的5'端加尾之后，检测特异性明显提高。
[0166] 同时，图4中的各泳道为不同的退火温度下的PCR结果，加尾之后检测结果的特异 性没有随着退火温度的改变而出现明显的变化，即上述在EGFR基因的18、19、20、21外显子 特异性引物的5'端加尾之后，具有了更宽的适宜退火温度范围，结果与实施例1相同。
[0167] 综上所述，以上结果显示，不同加尾长度的引物均可提高PCR反应的特异性，且具 有更宽的适宜退火温度范围，具有更宽的引物应用浓度范围。
[0168] 实施例5PCR引物5'加尾前后灵敏度的变化
[0169] 1、引物为上述实施例1、3、4所述的引物18F/18R，19F/19R，20F/20R，21F/21R，以及 各自加尾20bp、15bp、1 Obp的加尾引物。
[0170] 2、样本基因组DNA提取同实施例1。
[0171] 提取后的样本基因组DNA经50倍稀释后重新测定浓度为28.4ng/ul，以该稀释样本 为最高浓度样品再按2倍倍比稀释5个浓度梯度样本，最终共获得6个浓度梯度样品 (28 · 4ngAU、14 · 2ngAU、7 · lng/μL、3 · 55ngAU、1 · 775ngAU、0 · 8875ngAU)用于测试反应体 系的扩增灵敏度。
[0172] 3、PCR反应体系同实施例1，PCR反应条件、PCR产物鉴定同实施例2。
[0173] 4、结果如图5所示，18外显子未加尾与加尾引物均可检出0.8875~28.4ngAU浓度 梯度范围的样品，且未加尾引物的扩增产物中存在一定的非特异性扩增，故两种引物具有 相似的扩增灵敏度且加尾引物的特异性更佳。19外显子未加尾引物可检出1.775~28.4ng/ μL浓度梯度范围的样品，而加尾l〇bp、15bp、20bp的引物则分别可检出1.775~28.4ngAU、 3.55~28.4ngAU、7.1~28.4ngAU浓度梯度范围的样品，显示加尾10bp的引物与未加尾引 物具相似的扩增灵敏度，此引物随加尾长度增加，扩增灵敏度略有下降。20外显子未加尾与 加尾引物均可检出1.775~28.4ngAU浓度梯度范围的样品，具有相似的扩增灵敏度。21外 显子未加尾引物可检出0.8875~28.4ng/yl浓度梯度范围的样品，而加尾10bp、15bp、20bp 的引物则分别可检出7 · 1~28 · 4ngAU、3 · 55~28 · 4ngAU、1 · 775~28 · 4ngAU浓度梯度范围 的样品，加尾20bp的引物与未加尾引物具相似的扩增灵敏度。
[0174] 综上所述，5'加尾引物的加尾长短会对引物的扩增灵敏度有轻微影响，但通过调 整合适的加尾长度均可获得相似的扩增灵敏度，故5'加尾与不加尾PCR引物具有相似的扩 增灵敏度。
[0175] 实施例6加尾引物结合PCR复合反应条件对反应特异性的提高作用
[0176] 1、引物为上述实施例1、3、4所述的引物18F/18R，19F/19R，20F/20R，21F/21R，以及 各自加尾20bp、15bp、1 Obp的加尾引物。
[0177] 2、样本基因组DNA提取以及由此获得的6个浓度梯度样品同实施例5; PCR反应体系 同实施例1。
[0178] 3、PCR反应条件如表1
[0179] 表1
[0180]
[0181] 3、PCR产物鉴定同实施例2。
[0182] 4、结果如图6~9所示，使用18~21外显子未加尾引物结合复合反应条件不能对目 标片段实现有效扩增。使用18~21外显子各种加尾引物结合两步法反应条件仅在加短尾引 物中可见低效率的目标片段扩增，而在加长尾引物中则未见目标片段扩增。使用18~21外 显子各种加尾引物结合两种复合反应条件均可对目标片段实现有效扩增，且其扩增效果以 及灵敏度与相同引物结合常规PCR反应条件一致甚至更高。
[0183] 综上所述，5'加尾特异性PCR引物与复合反应条件结合使用可进一步提高反应特 异性。
[0184] 实施例7扩增产物的测序鉴定
[0185] 1、依据EGFR基因序列以及上述的EGFR基因18~21外显子特异性PCR引物设计测序 引物如下：
[0186] 18外显子测序引物：5 ' -GGCTGAGGTGACCCTTGTCT-3 '
[0187] 19外显子测序引物：5 ' -CATCTCACAATTGCCAGTT-3 '
[0188] 20 外显子测序引物：5 ' -TCACCTGGAAGGGGTCC-3 '
[0189] 21 外显子测序引物：5 ' -GCAGAGCTTCTTCCCATGA-3 '
[0190] 2、利用上述引物测序鉴定以上实施例的PCR扩增产物
[0191] (1 )PCR产物纯化:取PCR产物5μ1加入2μ1北京鑫诺SAP酶混合物混匀，37°Clh，80°C 15min〇
[0192] (2)测序反应体系：纯化PCR产物3ul、Bigdye3.1 ΙμL、测序引物（ΙΟμπι oL/L)lyl、 超纯水ΙμL。
[0193] (3)反应条件:96°(3111^11;96°(31〇8、50°〇58、60°〇41^11，25个循环 ；12°(3恒温。醋酸钠 乙醇纯化测序反应产物，上美国ABI3130xl测序仪测序。
[0194] 3、结果如图10所示，18~21外显