320bp，VH-TI inker-VL 约 740bp。
[0030] 2、抗体库的筛选 收集转化后全部克隆，经IPTG(0.25mmol/L)诱导4h，经EDTA-MgCl2处理，与抗兔VP2蛋 白的多克隆抗体（即实施例4制备的多克隆抗体溶液，工作浓度为1:5000倍稀释)及FITC标 记的羊抗兔二抗(P3838购自sigma公司，工作浓度为1:500倍稀释)各孵育lh，PBS洗涤后利 用流式细胞仪对其进行筛选。
[0031 ]经三轮筛选后，通过多克隆抗体及FITC标记的二抗得到一个与VP2蛋白具有结合 能力的单克隆抗体，将其命名为scFv-GXC抗体。
[0032] scFv-GXC抗体(为单链抗体，又称scFv-GXC蛋白）如序列表的序列1所示，其编码基 因如序列表的序列2所示。
[0033] 实施例2、scFv-GXC抗体的制备 1、合成序列表的序列2所不的双链DNA分子。
[0034] 2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用Fl和Rl组成的引物对进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物。
[0035] Fl:5，-CGCCATATGGCCGTGACGTTGGACGAG-3，； Rl:5，-CCCAAGCTTTTAACCTAGGACGGTCAGGG-3，。
[0036] 3、用限制性内切酶NdeI和HindII I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0037] 4、用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切pET-27b( + )载体，回收约5367bp的载体 骨架。
[0038] 5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对 重组质粒进行结构描述如下：在pET-27b( + )载体的NdeI和HindIII酶切位点之间插入了序 列表的序列2所示的双链DNA分子。
[0039] 6、将步骤5得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta，得到重组菌。
[0040] 7、将步骤6得到的重组菌接种至含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37°C、 lOOr/min 振荡培养至 0D_r?=0 · 3;加入 IPTG 并使其浓度为 0 · 25mmol/L，37°C、100r/min 振荡 培养4h。
[0041 ] 8、取15L完成步骤7的培养体系，4°C、4000r/min离心30min并收集菌体沉淀。
[0042] 9、取步骤8得到的菌体沉淀，用I3BS缓冲液重悬，加入溶菌酶溶液(购自Amresco )并 使溶菌酶的浓度为lmg/ml，4°C放置lh，然后进行超声破碎(25瓦的功率，3min)，4°C、10000g 离心30min，收集沉淀。
[0043] 10、使用AKTA Purifier 100蛋白层析系统(购自GE公司）纯化目的蛋白 取步骤9得到的沉淀，用100毫升溶解缓冲液(8mol/L尿素水溶液，pH8.0)充分溶解，然 后上样于HiLoad 16/60 Superdex75 pg柱子（购自GE公司），然后用500毫升复性缓冲液 (2mol/L尿素水溶液，pH8.0)洗脱并收集过柱后的洗脱液，然后在PBS缓冲液中透析过夜，得 到溶液即为scFv-GXC抗体溶液。所有步骤均在4°C环境下。scFv-GXC抗体溶液的SDS-PAGE图 谱见图1，显示约为28KD的条带，与预期相符。
[0044] 11、取步骤10得到的scFv-GXC抗体溶液，进行SEC-HPLC分析 硅胶填充物，型号为G-3000SWxl;将scFv-GXC抗体溶液上样后，用流速为0.5ml/min的 洗脱液(PH8.0,溶剂为水，含50mM Na3PO4和150mM NaCl)进行洗脱。SEC-HPLC图谱见图2,目 的蛋白的纯度可达90%。
[0045] 实施例3、VP2蛋白的制备 一、重组质粒的构建 1、合成序列表的序列4所不的双链DNA分子。
[0046] 2、以步骤合成的双链DNA分子为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物。
[0047] F2:5，-GAAGACTTAGGT ACAAACCTGCAAGATCAA-3，； R2:5 '-GGATCCTTA TGCTCCTGCAATCTTCAG-3 '。
[0048] 3、用限制性内切酶Bbs I和BamHI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0049] 4、用限制性内切酶BbsI和BamHI双酶切质粒pHisSUMO,回收约5700bp的载体骨架。
[0050] 5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。重组质粒中，VP2 蛋白的编码基因和载体骨架上的分子伴侣SUMO的编码序列、以及载体骨架上的His标签的 编码序列（位于SUMO的编码序列的上游，由6个组氨酸残基组成）融合，形成融合基因，表达 融合蛋白（融合蛋白自N端至C端依次为His标签、分子伴侣SUMO和VP2蛋白）。
[0051 ] 二、VP2蛋白的制备和纯化 1、将步骤一得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta，得到重组菌。
[0052] 2、将步骤1得到的重组菌接种至含lOOμg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C、 lOOr/min振荡培养至0D_?=0.3;加入IPTG并使其终浓度为0.4mmol/L，25°C、65r/min振荡 培养I Oh。
[0053] 3、取完成步骤2的培养体系，4°C、4000r/min离心30min，并收集菌体沉淀。
[0054] 4、取步骤3得到的菌体沉淀，用Binding buffer重悬，加入溶菌酶溶液（购自 Amresco)并使溶菌酶的浓度为lmg/ml，4°C放置lh，然后进行超声破碎(25瓦的功率，3min)， 4°C、1000 Og离心30min，收集上清液。
[0055] 5、取步骤4得到的上清液，进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。
[0056] 柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。
[0057] 上样量为10ml。
[0058] 洗脱过程:先用5倍柱体积的杂蛋白洗脱液(溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质： 40mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl和50mmol/L Na3P〇4;pH7.4)洗脱以去除杂蛋白，流速为Iml/ min;然后用3倍柱体积的目的蛋白洗脱液(溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质:500mmol/L 咪挫、500mmol/L NaCl和50mmol/L Na3P〇4;pH7.4)洗脱，流速为lml/min，280nm波长监测，收 集目标峰(即峰值高于SOmAU的峰），即为融合蛋白溶液。
[0059] 6、采用HiPrepTM 26/10 Desalting将步骤5得到的融合蛋白溶液进行脱盐。
[0060] 7、取步骤6得到的溶液，用SUMO蛋白酶I (SUMO蛋白酶I与融合蛋白的摩尔比为1: 50)和终浓度为2mmol/L的DTT 4°C切割过夜。
[0061 ] 8、取步骤7得到的溶液，进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。
[0062] 柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。
[0063] 上样量为15ml，280nm波长监测，收集目标峰（即峰值高于30mAU的峰），即为VP2蛋 白溶液。将VP2蛋白溶液进行聚丙烯凝胶电泳，显示分子量约为42KDa的单一蛋白条带，回收 蛋白条带并测序，N端前15个氨基酸残基如序列表的序列3自N末端第1至15位氨基酸残基所 不。
[0064] 实验例4、抗兔VP2多克隆抗体的制备和纯化 一、免疫家兔 1、用实验例3得到的VP2蛋白与等体积的弗氏完全佐剂，置于混合器上剧烈振荡混匀， 形成"油包水"状乳悬液，充分乳化后采取背部多点皮下免疫注射，每点注射约l〇〇yL，免疫 剂量为0.5 mg。
[0065] 2、2周后用同样剂量蛋白质与等体积的弗氏不完全佐剂混合后进行加强免疫。
[0066] 3、一周后用同样剂量蛋白质与等体积的弗氏不完全佐剂混合后进行加强免疫。
[0067] 4、一周后用同样剂量蛋白质与等体积的弗氏不完全佐剂混合后进行加强免疫。
[0068] 5、6 d后，颈静脉采血，先放37°Clh，再放4°C过夜，取血清。
[0069]二、多克隆抗体的纯化 1、取步骤一得到的血清，进行protein A亲和层析。
[0070] 柱子型号为:柱长0.7cm，柱高2.5cm。
[0071] 上样量为20ml。
[0072] 以每分钟0.5 ml的速度将抗血清上到柱上，为保证抗血清与填料的结合，需连续 上柱2次并保留上样流出液。用TBS缓冲溶液(溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质：50 mM/ L Tris，150 mM/L NaCl;pH7.4)清洗柱子去除杂蛋白，后加洗脱缓冲溶液(溶剂为水，含有 如下浓度的溶质50 mM/Ι甘氨酸；pH2.7 )，以0.5ml/min的速度洗脱，280nm波长监测，收集 目标峰，即为多克隆抗体。将多克隆抗体溶液进行聚丙烯凝胶电泳，显示分子量约为50 kDa 和25 kDa的两条蛋白条带。
[0073] 实施例5、ELI SA检测scFv-GXC抗体的亲和力和特异性 一、ELISA检测scFv-GXC抗体对VP2蛋白的特异性和亲和力 1、分别用蛋白浓度为 200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、lμg/ml 的scFv-GXC抗体溶液（即实施例2制备的scFv-GXC抗体溶液，用包被液调整蛋白浓度)包被 酶标板，4°C过夜，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。