r>[0074] 2、每孔加入100μ1蛋白浓度为40μg/ml的VP2蛋白溶液（即实施例3制备的VP2蛋白 溶液，用PBS缓冲液调整蛋白浓度），37°C孵育Ih，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
[0075] 3、加入抗兔VP2多克隆抗体（即实施例4制备的多克隆抗体溶液，工作浓度为1: 5000倍稀释），37°C孵育lh，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
[0076] 4、加入HRP标记的羊抗兔抗体（HAF008购自R&D system公司，工作浓度为1:8000 倍稀释），37°C孵育lh，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
[0077] 5、加入TMB底物显色液，37°C避光显色5min。
[0078] 6、每孔加入50μ1 2mol/L的H2SO4水溶液，用酶标仪于波长450nm下检测OD值。
[0079]设置用等体积的PBS缓冲液代替步骤1中的scFv-GXC抗体溶液、步骤2中的VP2蛋白 溶液和步骤3中的抗兔VP2多克隆抗体的PBS组。步骤1中用蛋白浓度为200μg/ml的scFv-GXC 抗体溶液包被酶标板时:设置步骤2中不加入VP2蛋白溶液的对照组1，步骤3中不加入抗兔 VP2多克隆抗体的对照组2，步骤2中不加入VP2蛋白溶液且步骤3中不加入抗兔VP2多克隆抗 体的对照组3，用等体积且等蛋白浓度的BSA溶液代替VP2蛋白溶液的对照组4。
[0080] 每个处理设置3个复孔。
[00811 结果见图3<^154结果表明，8(^-6乂(：抗体可以与￥?2蛋白特异性结合。
[0082] 二、ELISA检测scFv-GXC抗体对不同IBDV病毒的特异性和亲和力 1、用蛋白浓度为400μg/ml的scFv-GXC抗体溶液(即实施例2制备的scFv-GXC抗体溶液， 用包被液调整蛋白浓度)包被酶标板，4°C过夜，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。 [0083] 2、每孔加入100μΙ IBDV病毒液（病毒剂量为106·2 TCID5Q)，37°C孵育lh，然后用 PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
[0084] 3、加入抗兔VP2多克隆抗体（即实施例4制备的多克隆抗体溶液，工作浓度为1: 5000倍稀释），37°C孵育lh，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
[0085] 4、加入HRP标记的羊抗兔抗体（HAF008购自R&D system公司，工作浓度为1:8000 倍稀释），37°C孵育lh，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
[0086] 5、加入TMB底物显色液，37°C避光显色5min。
[0087] 6、每孔加入50μ1 2mol/L的H2S〇4水溶液，用酶标仪于波长450nm下检测OD值。
[0088] 分别采用如下IBDV的毒株进行上述实验:Gt株、NF8株、1-65株、BJ836株、MB株、B87 株。
[0089] 设置用等体积的I3BS缓冲液代替步骤1中的scFv-GXC抗体溶液、步骤2中的IBDV病 毒液和步骤3中的抗兔VP2多克隆抗体的I3BS组。设置步骤2中不加入IBDV病毒液的对照组1， 步骤3中不加入抗兔VP2多克隆抗体的对照组2,步骤2中不加入IBDV病毒液且步骤3中不加 入抗兔VP2多克隆抗体的对照组3，用等体积等滴度的新城疫病毒液代替IBDV病毒液的对照 组4。
[0090] 每个处理设置3个复孔。
[0091] 结果见图4 ALISA结果表明，scFv-GXC抗体可以与不同IBDV毒株特异性结合，对不 同的IBDV毒株具有不同的亲和力。
[0092] 实施例6、scFv-GXC抗体的中和活性 一、imw滴度的测定 将处于对数生长期的DFl细胞接种于96孔细胞培养板，将用DMEM培养基IO1至IO12梯度 稀释的IBDV病毒液(B87株)接种到单层细胞中（每孔100μΙ)，每一稀释度接种8个细胞孔;设 置不加入IBDV病毒液的对照组。将细胞培养板放到细胞培养箱中，37°C、5% CO2培养，连续 观察7天，每天记录细胞生长状态。计算病毒滴度，第7天结果见表1。
[0093] 表1 IBDV滴度的测定的结果
按照Reed-Muench两氏法计算TCID5q=10-6'2/0 · Iml ο
[0094] 二、scFv-GXC抗体的中和活性 将处于对数生长期的DFl细胞接种于96孔细胞培养板，将用DMEM培养基梯度稀释后的 scFv-GXC抗体溶液（即实施例2制备的scFv-GXC抗体溶液)和100 TCID5q的IBDV病毒液（ B87株)等体积混合并37°C孵育lh，然后接种到单层细胞中，每一梯度接种8个细胞孔;设置 不加入抗体溶液且不加入病毒液的正常对照，设置只不加入抗体溶液只加入病毒液的病毒 对照。将细胞培养板放到细培养箱中，37°C，5% CO2培养连续观察7天，每天记录细胞生长状 态。第7天结果见表2。
[0095]表2 scFv-GXC抗体的中和活性的测定的结果
结果表明，scFv-GXC抗体具有中和活性，阻断或抑制CPE的最小蛋白浓度为0.037ug/ ml〇
【主权项】
1. 一种单链抗体，包括由重链可变区、轻链可变区以及它们之间的连接区组成； 所述重链可变区为如下(a)或(b) : (a)由序列表中序列1自N末端第1-123位氨基酸残基 组成的蛋白质；（b)将(a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相 同活性的由其衍生的蛋白质； 所述轻链可变区为如下(c)或(d):(c)由序列表中序列1自N末端第139-244位氨基酸残 基组成的蛋白质；（d)将(c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有 相同活性的由其衍生的蛋白质。2. 如权利要求1所述的单链抗体，其特征在于:所述单链抗体为如下(e)或(f):(e)由序 列表中序列1所示的蛋白质；（f)将(e)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。3. 编码权利要求1或2所述单链抗体的基因。4. 如权利要求3所述的基因，其特征在于： 所述基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下（1)或(2)或(3):(1)序列表的序列 2自5 '末端第1-369位核苷酸所示的DNA分子；（2)在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂交且 编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（3)与（1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且 编码具有相同活性的蛋白的DNA分子； 所述基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下(4)或(5)或(6) : (4)序列表的序列 2自5 '末端第415-732位核苷酸所示的DNA分子;（5)在严格条件下与(4)限定的DNA序列杂交 且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6)与（4)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性 且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。5. 如权利要求4所述的基因，其特征在于： 所述基因为如下(7)或(8)或(9)或（10): (7)序列表的序列2自5'末端第1-732位核苷酸 所示的DNA分子；（8)序列表的序列2所示的DNA分子；（9)在严格条件下与（7)或（8)限定的 DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10)与（7)或(8)限定的DNA序列至少 具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。6. 含有权利要求3至5中任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。7. 基于权利要求1或2所述单链抗体的其它形式的抗体。8. 权利要求1所述单链抗体、权利要求2所述单链抗体或权利要求7所述抗体在制备产 品中的应用;所述产品的功能为如下（I)、（ Π )或(ΙΠ )或(IV) : (I)检测鸡传染性法氏囊病病 毒；（Π )辅助鉴定鸡传染性法氏囊病病毒；（ΙΠ )预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病；（IV)预 防和/或治疗由鸡传染性法氏囊病病毒诱发的疾病。9. 含有权利要求1所述单链抗体、权利要求2所述单链抗体或权利要求7所述抗体的产 品；所述产品的功能为如下（〇、（ Π )或（m)或αν): (I)检测鸡传染性法氏囊病病毒；（π) 辅助鉴定鸡传染性法氏囊病病毒；ΟΠ )预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病；（IV)预防和/或 治疗由鸡传染性法氏囊病病毒诱发的疾病。10. 权利要求1所述单链抗体、权利要求2所述单链抗体或权利要求7所述抗体在辅助鉴 定鸡传染性法氏囊病病毒中的应用。
【专利摘要】本发明公开了抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用。本发明提供的scFv-XC抗体，包括由重链可变区、轻链可变区以及它们之间的连接区组成；重链可变区为如下（a）或（b）：（a）由序列1第1-123位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）将（a）经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的蛋白质；轻链可变区为如下（c）或（d）：（c）由序列1第139-244位氨基酸残基组成的蛋白质；（d）将（c）经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的蛋白质。本发明本发明提供的scFv-XC抗体，是利用抗原-抗体共表达的细菌展示技术筛选获得的，该scFv-XC抗体的中和活性比已授专利权的scFv-D抗体高60倍以上，具有特异性强、治疗效果更好等优点。
【IPC分类】C07K16/10, C12N15/13, G01N33/569, C12N7/00
【公开号】CN105504052
【申请号】CN201510958516
【发明人】李德山, 郭笑辰, 任桂萍, 曹宏雪
【申请人】哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月21日