，两者杂交获得Fi 单株自交，其种子繁殖成^代分离群体近6000株，常规水肥管 理。观测幼苗下胚轴的颜色（紫色或绿色），共挑出下胚轴呈绿色的含花青素缺乏纯合突变 位点的植株。对母本、父本、F1、和F2群体中下胚轴呈绿色的幼苗，分单株采用常规的CTAB法 提取基因组DNA。
[0023]比对番茄国际基因组计划测序的番茄品种Heinzl706序列和醋栗番茄LA1589序 列，开发与番茄花青素缺乏突变体aa位点连锁的分子标记。根据前期番茄花青素缺乏突变 体aa位点遗传定位所在的染色体区域范围，有间隔的比对Heinzl706和LA1589的序列，找出 所含InDel的位置及其侧翼序列，设计引物。分别扩增父本、母本及其F1的基因组DNA，琼脂 糖凝胶电泳检测，发现了 10个具有多态性的InDel分子标记。利用上述10个InDel分子标记， 分别对F2群体中挑选的下胚轴呈绿色的植株进行分子检测。统计结果表明番茄花青素缺乏 突变体AA基因位于分子标记HP523和HP527之间，物理区段为番茄2号染色体上第45272582 碱基到第45368897碱基(SL2.50版本），物理距离约96.3kb。物理位置为番茄2号染色体上第 45320525碱基(SL2.50版本)的分子标记AAM1与AA基因共分离（图1)。
[0024] 进一步确定上述96.3kb内的3〇17〇028〇81340编码一个谷胱甘肽转移酶 (Glutathione S-transferase，GST)，是番前花青素缺乏基因 AA。
[0025]基于番茄花青素缺乏基因 A A优化引物设计，利用正向引物5 -GAATAAGGGGACAAAATACAACGACGAC-3，和反向引物5-GGAGTAGTTTACAGCCACAGAGGTT-3，对含有 aa位点的番茄母本材料进行PCR扩增，PCR扩增得到单一条带。测序后得到一段877bp的序列 (序列如下）。将该序列与番茄参考基因组Heinzl706的序列比对，发现在番茄2号染色体上 第45339693碱基到第45343097碱基（SL2.50版本)位置处存在一个约3.4kb的DNA片段缺失 (Deletion)(图2)，此DNA片段缺失被命名为AAD(AA Deletion)。
[0027] 实施例2 InDel分子标记AAD的开发与验证
[0028] InDel分子标记AAD的引物设计
[0029] 根据AAD及其侧翼序列，设计了3条引物。正向引物（AAD-F)为5-GGGACAAAATACAACGACGAC-3，反向引物1 (AAD-R1)为 5-GCTGATGTTGATGTGAAGGAA-3，反向引物 2(AAD-R2)为5-TAAAAGGGCTAGTGACTTGGTGT-3。
[0030] InDel分子标记AAD的多态性检测
[0031] PCR 扩增。
[0032] 以母本、父本及其基因组DNA为模板，利用用于检测InDel标记AAD的3条特异 性引物进行PCR扩增。含有番茄花青素缺乏(aa)纯合突变位点的母本植株可以检测到一条 363bp的条带;aa位点为正常纯合(野生型）的父本植株可以检测到一条487bp的条带;aa位 点为杂合状态的^植株可以同时检测到上述2条条带（图3)。
[0033] InDel分子标记AAD的F2群体验证
[0034] 利用InDel分子标记4六0对^群体中下胚轴呈绿色的植株进行分子检测。发现都只 扩增出一条363bp的条带，表明InDel分子标记AAD与aa突变等位基因共分离。从F2群体中挑 选一些下胚轴呈紫色的植株用InDel分子标记AAD进行分子检测，约1/3的植株只扩增出一 条487bp的条带，其余的植株可以同时检测到上述2条条带（图3)。
[0035] InDel分子标记AAD的广适性验证
[0036]利用InDel分子标记AAD对含有番茄花青素缺乏(aa)突变位点的材料、8份下胚轴 呈紫色的樱桃番茄品种或育种材料、8份下胚轴呈紫色的普通栽培番茄品种或育种材料进 行分子检测。发现含有番茄花青素缺乏(aa)突变位点的材料只扩增出一条363bp的条带，其 它的番茄材料只扩增出一条487bp的条带，PCR扩增条带的大小与表型一致。上述结果表明， 当将aa突变等位基因导入到表型正常的番茄育种材料时，AAD可以作为分子标记辅助选择 工具。
【主权项】
1. 番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子标记，其特征在于，所述番茄花青素 缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子标记的物理位置为番茄2号染色体上第45339693碱基到 第45343097碱基。2. 番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子标记在分子育种中的应用。3. 鉴定番茄花青素缺乏性状的特异性引物，其特征在于，所述引物为： 正向引物AAD-F 为：5-GGGACAAAATACAACGACGAC-3， 反向引物AAD-R1为：5-GCTGATGTTGATGTGAAGGAA-3， 反向引物AAD-R2 为:5-TAAAAGGGCTAGTGACTTGGTGT-3。4. 一种鉴定番茄花青素缺乏性状的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 1) 提取待测番茄的基因组DNA; 2. PCR扩增，以待检测的番茄基因组DNA为模板，利用权利要求3所述的特异性引物进行 PCR扩增； 3. PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测，含有番茄花青素缺乏纯合突变位点的植株检 测到一条363bp的条带；正常纯合的植株检测到一条487bp的条带；番茄花青素缺乏纯合突 变位点为杂合状态的植株同时检测到上述2条条带。
【专利摘要】本发明涉及分子育种领域，具体涉及与番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子标记AAD及其应用。所述番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子标记的物理位置为番茄2号染色体上第45339693碱基到第45343097碱基本发明可以替代传统的通过选择绿色植株以确保番茄育种材料含有花青素缺乏(aa)突变位点的方法。通过分子标记辅助选择表型正常育种材料中的aa位点杂合植株，可以缩短育种周期、提高育种效率。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105525016
【申请号】CN201610064102
【发明人】黄泽军, 胡鸿, 张丽媛, 杜永臣, 王孝宣, 高建昌, 国艳梅
【申请人】中国农业科学院蔬菜花卉研究所
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年1月29日