：以touch down程序扩增10个循环，每 循环降低〇. 6°C); 94°C，20秒(变性)一55°C，60秒继续扩增26个循环。扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则继续扩增，每3个循环查看 分型情况，直至分型完全。
[0093] 结果如图1所示，结果显示分型效果良好，A0220509373G/T位点能特异区分该位点 为纯合GG、或纯合TT或杂合G/T的材料。
[0094]若待测大白菜基因组的A0220509373G/T位点的核苷酸为GG纯合，则待测大白菜为 感根肿病大白菜;若待测大白菜基因组的A0220509373G/T位点的核苷酸为TT纯合或G/T杂 合，则待测大白菜为抗根肿病大白菜。
[0095] 2、根肿病抗性检测
[0096]将表1中的68份大白菜DH播种后，接种根肿病4号生理小种（湖北长阳病原菌），发 病后调查病情，接种和调查方法方法可参照文献"汪维红等，湖北省长阳县十字花科蔬菜根 肿病菌生理小种鉴定及抗源筛选，中国蔬菜，2013"中所记载记载的内容进行。
[0097]病情分级标准:0级：无病；1级：侧根上有结节状的小根瘤，发病根占根系全部的 1 %-10% ; 3级:侧根上有根瘤附着，侧根发病根量占10 %以上;5级:主根根瘤较小，侧根发 病根量占根系的50 %以上;7级:主根根瘤较大，侧根发病根量占根系的80 %以上，9级：主根 根瘤大，呈纺锤形。根据病情调查结果按下式计算病情指数：
[0098]具体计算公式如下：
[0100] 病情指数< 10为抗根肿病，病情指数>10为感根肿病。
[0101] 结果如表1所示，在17(请补充）份病情检测为抗根肿病材料中，分子标记鉴定 A0220509373G/T位点为TT纯合的材料有13份(请补充），GT杂合的材料有4份(请补充），经过 实验室人工接种常规验证，该17种为抗根肿病，本发明方法的鉴定准确度为76.5% ;在51份 病情检测为感根肿病材料中，分子标记鉴定A0220509373G/T位点为GG纯合的材料有50份， TT材料的有1份，经过实验室人工接种常规验证，这51份材料为感根肿病病，本发明方法的 鉴定准确度为92%。综合而言，在68份株系材料中，A0220509373G/T位点有5个发生交换，鉴 定准确率为92.6%。结果表明六02205093736/1'位点可用于大白菜抗根肿病分子标记辅助育 种。
[0102] 表1:分子标记在DH群体中的准确性验证
[0103]
【主权项】
1. A0220509373G/T位点在如下A-F任一中的应用： A、 在鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性中的应用； B、 在选育大白菜根肿病抗病品种中的应用； C、 大白菜育种中的应用； D、 预测大白菜根肿病抗性中的应用； E、 在制备鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性产品中的应用； F、 在制备预测大白菜根肿病抗性产品中的应用。2. 检测大白菜基因组中A0220509373G/T位点的多态性或基因型的物质在如下A-F任一 中的应用： A、 在鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性中的应用； B、 在选育白根肿病抗病品种中的应用； C、 大白菜育种中的应用； D、 预测大白菜根肿病抗性中的应用； E、 在制备鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性产品中的应用； F、 在制备预测大白菜根肿病抗性产品中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述检测大白菜基因组中A0220509373G/T 位点的多态性或基因型的物质包括由引物1、引物2和引物3所组成的引物组； 所述引物1为如下al)或a2): al)序列1所不的单链DNA分子； a2)将al)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 a 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物2为如下bl)或b2): bl)序列2所示的单链DNA分子； b2)将bl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 b 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物3为如下cl)或c2): cl)序列3所不的单链DNA分子； c2)将cl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 c 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。4. 一种鉴别或辅助鉴别待测大白菜是否为抗根肿病大白菜的方法，包括如下步骤:检 测待测大白菜基因组A0220509373G/T位点的多态性或基因型，若所述待测大白菜基因组 A0220509373G/T位点的多态性或基因型为TT或TG，则所述待测大白菜为抗根肿病大白菜或 候选抗根肿病大白菜;若所述待鉴别大白菜基因组A0220509373G/T位点的多态性或基因型 为GG，则所述待鉴别大白菜为非抗根肿病大白菜或非候选抗根肿病大白菜。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述检测待鉴别大白菜基因组 A0220509373G/T位点的多态性或基因型的方法为如下（1)或(2): (1) 测序； (2) 用引物对待测大白菜进行等位基因特异性PCR; 所述引物由引物1、引物2和引物3组成； 所述引物1为如下al)或a2): al)序列1所不的单链DNA分子； a2)将al)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 a 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物2为如下bl)或b2): bl)序列2所示的单链DNA分子； b2)将bl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 b 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物3为如下cl)或c2): cl)序列3所不的单链DNA分子； c2)将cl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 c 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。6. 权利要求4或5所述的方法在下述1)_4)任一中的应用： 1) 在鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性中的应用； 2) 在选育大白菜根肿病抗病品种中的应用； 3) 大白菜育种中的应用； 4) 预测大白菜根肿病抗性中的应用。7. 大白菜的育种方法，包括检测待测大白菜基因组A0220509373G/T位点的多态性或基 因型，选择基因组A0220509373G/T位点的多态性或基因型为TT的待测大白菜作为亲本进行 育种。8. 权利要求1-3任一所述的应用或权利要求4-7任一所述的方法，其特征在于：所述 A0220509373G/T位点为序列表序列4中第301位核苷酸。9. 鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性的引物组，所述引物由引物1、引物2和引物3组 成； 所述引物1为如下al)或a2): al)序列1所不的单链DNA分子； a2)将al)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 a 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物2为如下bl)或b2): bl)序列2所示的单链DNA分子； b2)将bl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 b 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物3为如下cl)或c2): cl)序列3所不的单链DNA分子； c2)将cl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 c 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。10. 含有权利要求9所述引物组的鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性的试剂或试剂盒。
【专利摘要】本发明公开了一种鉴别大白菜根肿病4号生理小种抗性的特异SNP分子标记及应用。本发明提供了A0220509373G/T位点在如下A-F任一中的应用：A、在鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性中的应用；B、在选育大白菜根肿病抗病品种中的应用；C、大白菜育种中的应用；D、预测大白菜根肿病抗性中的应用；E、在制备鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性产品中的应用；F、在制备预测大白菜根肿病抗性产品中的应用。本发明的实验证明了，本发明开发的A0220509373G/T位点及其特异引物可以对大白菜根肿病抗性良好分型，具有良好的应用价值，可实现对抗根肿病遗传材料的预先选择和辅助育种。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105525024
【申请号】CN201610086622
【发明人】苏同兵, 汪维红, 于拴仓, 张凤兰, 余阳俊, 张德双, 赵岫云, 卢桂香
【申请人】北京市农林科学院
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年2月16日...