稀释度接种5 孔，每孔0.1ml; 6) 培养:将步骤5)得到的细胞培养板置于35°C、C02浓度为5%的培养箱中培养12化； 7) 测定病毒效价：观察细胞培养板中的细胞病变情况，使用Reed-Muench方法计算 TCI化0值，测定病毒效价； 其中细胞病变的判定方法为：当细胞孔内100%细胞发生病变判定为有病毒感染，计入 细胞发生CPE数。
[0016] 8)同时如发明专利(CN 102703602 B)方法沛则毒板进行血凝实验，计算TCIDso。
[0017] 9)实验结果
从本结果可W看出，观察CF*E计算的TCIDso与进行血凝测定计算的TCIDso相比，无明显 差异，并且操作上更为简便，更重要的是，本发明方法避免了不同的实验员因操作熟练度及 血凝情况判定所造成的人为误差。
[001引 实施例2 一种禽流感病毒效价的测定方法，包括W下步骤： 1) 细胞传代:将处于细胞对数生长期的MDCK细胞进行传代培养，并使细胞密度为1 X 105个/ml,然后将MDCK细胞铺到96孔细胞培养板上，每孔10化L，并将细胞培养板置于溫度 37°C、C02浓度为5%的培养箱中培养30h; 2) 稀释样品：将禽流感病毒液用抑7.4的DMEM培养液进行10倍倍比稀释稀释至ΙΟΛ 得到不同稀释度的禽流感病毒液，备用； 3) 洗板:将上述步骤1)长满MDCK细胞的细胞培养板中的细胞培养液弃去，用ο. Olmol/L 的憐酸盐缓冲液洗涂3次； 4) 加液:在细胞培养板上设样品组和对照组，样品组每孔加入0.1ml含膜酶的pH 7.4的 DMEM培养液，对照组每孔加入0.2ml含膜酶的抑7.4的DMEM培养液，所述DMEM培养液中膜酶 的质量浓度为50yg /ml;然后将细胞培养板置于35°C环境中解育15min; 5) 接毒:取上述步骤2)10-6-10-8稀释度的禽流感病毒液接种细胞，每个稀释度接种5 孔，每孔0.1ml; 6) 培养:将步骤5)得到的细胞培养板置于35°C、C02浓度为5%的培养箱中培养10化； 7) 测定病毒效价：观察细胞培养板中的细胞病变情况，使用Reed-Muench方法计算 TCI化0值，测定病毒效价； 其中细胞病变的判定方法为：当细胞孔内100%细胞发生病变判定为有病毒感染，计入 细胞发生CPE数。
[0019] 8)同时如发明专利(CN 102703602 B)方法沛则毒板进行血凝实验，计算TCIDso。
[0020] 9)实验结果
从本结果可W看出，观察CF*E计算的TCIDso与进行血凝测定计算的TCIDso相比，无明显 差异，并且操作上更为简便，更重要的是，本发明方法避免了不同的实验员因操作熟练度及 血凝情况判定所造成的人为误差。
[0021] 实施例3 一种禽流感病毒效价的测定方法，包括W下步骤： 1) 细胞传代:将处于细胞对数生长期的MDCK细胞进行传代培养，并使细胞密度为1.5 X105个/ml,然后将MDCK细胞铺到96孔细胞培养板上，每孔10化L，并将细胞培养板置于溫 度37°C、C〇2浓度为5%的培养箱中培养28h; 2) 稀释样品：将禽流感病毒液用抑7.4的DMEM培养液进行10倍倍比稀释至ΙΟΛ得到 不同稀释度的禽流感病毒液，备用； 3) 洗板:将上述步骤1)长满MDCK细胞的细胞培养板中的细胞培养液弃去，用0.Olmol/ L的憐酸盐缓冲液洗涂3次； 4) 加液:在细胞培养板上设样品组和对照组，样品组每孔加入0.1ml含膜酶的抑7.4 的DMEM培养液，对照组每孔加入0.2ml含膜酶的抑7.4的DMEM培养液，所述DMEM培养液中膜 酶的质量浓度为50yg /ml;然后将细胞培养板置于35°C环境中解育15min; 5) 接毒:取上述步骤2)10-6-10-8稀释度的禽流感病毒液接种细胞，每个稀释度接种5 孔，每孔0.1ml; 6) 培养:将步骤5)得到的细胞培养板置于35°C、C〇2浓度为5%的培养箱中培养12化； 7) 测定病毒效价：观察细胞培养板中的细胞病变情况，使用Reed-Muench方法计算 TCI化0值，测定病毒效价； 其中细胞病变的判定方法为：当细胞孔内100%细胞发生病变判定为有病毒感染，计入 细胞发生CPE数。
[0022] 8)同时如发明专利(CN 102703602 B)方法对测毒板进行血凝实验，计算TCIDso。
[0023] 9)实验结果_
从本结果可W看出，观察CF*E计算的TCIDso与进行血凝测定计算的TCIDso相比，无明显 差异，并且操作上更为简便，更重要的是，本发明方法避免了不同的实验员因操作熟练度及 血凝情况判定所造成的人为误差。
【主权项】
1. 一种禽流感病毒效价的测定方法，其特征在于:其包括以下步骤： 1) 细胞传代:将处于细胞对数生长期的MDCK细胞进行传代培养，并使细胞密度为1-2 X 105个/ml，然后将MDCK细胞铺到细胞培养板上，每孔lOOyL，并将细胞培养板置于温度37°C、 C〇2浓度为5%的培养箱中培养28-30h; 2) 稀释样品：将禽流感病毒液用DMEM培养液进行10倍倍比稀释，得到不同稀释度的禽 流感病毒液，备用； 3) 洗板:将上述步骤1)长满MDCK细胞的细胞培养板中的细胞培养液弃去，用0.0 lmol/L 的磷酸盐缓冲液洗涤3-4次； 4) 加液:在细胞培养板上设样品组和对照组，样品组每孔加入0. lml含胰酶的DMEM培养 液，对照组每孔加入0.2ml含胰酶的DMEM培养液，所述DMEM培养液中胰酶的质量浓度为40-50yg /ml;然后将细胞培养板置于35°C环境中孵育15min; 5) 接毒:取上述步骤2)适当稀释度的禽流感病毒液接种细胞，每个稀释度接种5孔，每 孔0·lml; 6 )培养：将步骤5 )得到的细胞培养板置于3 5 °C、C 0 2浓度为5 %的培养箱中培养10 0 -120h； 7)测定病毒效价：观察细胞培养板中的细胞病变情况，使用Reed-Muench方法计算 TCID5Q值，测定病毒效价。2. 根据权利要求1所述的一种禽流感病毒效价的测定方法，其特征在于:所述细胞培养 板为96孔细胞培养板。3. 根据权利要求1所述的一种禽流感病毒效价的测定方法，其特征在于:所述DMEM培养 液为DMEM培养基用超纯水配制而成，并调节pH至7.4。
【专利摘要】本发明公开了一种禽流感病毒效价的测定方法，通过细胞传代、稀释样品、洗板、加液、接毒、培养、计算TCID50值等步骤来测定禽流感病毒效价，本发明通过对MDCK细胞进行传代铺细胞板，接种不同稀释度的禽流感病毒，一定温度下培养一定时间，通过观察细胞病变，使用Reed-Muench方法计算TCID50值，测定病毒效价。本发明方法因使用细胞测定，测定结果稳定，同时排除了细胞株的外源性病源污染，使测定结果更准确。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/70, C12Q1/02
【公开号】CN105586440
【申请号】CN201610155426
【发明人】王玉玲, 黄金妹, 韦姜玲, 许必钊
【申请人】福州大北农生物技术有限公司
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2016年3月18日