用于精准治疗的靶向性干细胞的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于干细胞领域，涉及一种可用于局部部位精准治疗的靶向性干细胞(SP10标记的骨髓间充质干细胞)的制备方法。
【背景技术】
[0002]干细胞是一种能够长期存活，具有不断的自我繁殖能力和多向化潜能，几乎存在于所有组织中的原始细胞。干细胞是维持生命不息的最基本动力，干细胞疗法就是通过利用由自体采集的组织细胞，经实验室分离、培养后，将增殖的干细胞注入回人体内，通过多功能活化细胞自我靶向性功能准确到达相应的受损器官和组织，以达到修复损伤、病变的细胞和组织，重建功能正常细胞和组织的目的。
[0003]目前干细胞的移植途径有:在损伤病变部位原位注射移植，这种方法创伤小，简单易行，但是也存在一定问题，穿刺点到损伤病变部位存在一定的空间距离，精确定位并不容易，且注射的干细胞在短时期内主动迀移、聚集到损伤部位的效率低下，真正到达损伤区存活和发挥功能的细胞数目较少，功能恢复有限。而细胞移植的修复效果很大程度上取决于目标区域能够发挥治疗作用的细胞数量，这无疑使得干细胞的需要量大为增加。且干细胞注射入组织后，易受到周围正常组织的影响，如被组织液稀释而游走，一定时期内若无法到达目标区域，则可能贴附于周围组织结构，呈散在分布，即使能够存活增殖，也起不到理想的治疗作用。
[0004]另外使用较多的方法还有将干细胞-生物支架复合体局部植入，即将体外培养的干细胞与可降解的生物支架进行整合后移植到损伤病变区域。支架多由固体或凝胶等材料合成。但该方法能否成功受到很多因素的影响，如细胞、支架和细胞的生长环境等。这种方法虽然能将细胞准确种植到目标部位并增殖修复，但手术创伤较大、细胞分布不均匀、并发症多、支架长期使用生物安全性不确定、存在免疫排斥反应、炎症反应等干扰机体内环境，不利于细胞生长增殖，且治疗成本较高。
[0005]本发明通过一种新型的磁性靶向投递系统，使用超顺磁性氧化铁纳米颗粒(Superparamagnetic IronOxide，SP10)来标记骨髓间充质干细胞，SP1标记的细胞在适宜的磁场作用下可以顺着磁场方向迀移并定植于目标区域。将此种标记的干细胞通过蛛网膜下腔进行移植，并在脊髓损伤区外置一磁场，SP1标记的骨髓间充质干细胞由于磁场的作用会向损伤区域迀徙，从而提高了脊髓损伤区的细胞迀移率及细胞数量，以更小的创伤、更高的效率、更少的并发症，通过细胞靶向精准定位为干细胞移植治疗提供了一种新手段。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于精准治疗的靶向性干细胞的制备方法。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种用于精准治疗的靶向性干细胞的制备方法，该方法为:将第三代骨髓间充质干细胞培养至细胞的生长面积达到瓶底面积90 %以上，弃去原培养液，PBS溶液洗涤3遍，用含有浓度为8.0yg/ml的超顺磁性氧化铁纳米粒子的培养液进行培养，培养条件为:37°C、100 %饱和湿度、5 %CO2细胞培养箱中孵育24h。然后弃去培养液，PBS溶液洗涤3遍以去除残留的纳米粒子，即得到可用于精准定位的靶向性干细胞。
[0008]进一步地，所述培养液为:含有10%胎牛血清的低糖DMEM培养液。
[0009]本发明的有益效益是，本发明通过将分离培养到的BMSCs使用SP1进行标记，由于SP1具有超顺磁性，因此SP1标记的细胞具有磁响应性，而施加的磁场能促进SP1负荷细胞的定向运动。SP1作为MRI造影增强剂，具有良好的生物安全性，其与转染剂结合形成复合体后，通过静电作用与细胞表面的配体结合，经内吞作用进入胞浆中，被细胞代谢后进入正常血浆铁池，与红细胞血红蛋白结合或用于其他代谢过程，因此避免了支架等载体的使用以及其所带来的不良反应。且SP1及其所标记的干细胞在磁力作用下能定向迀移并定植于病变缺损部位，可增加局部干细胞浓度，提高再生修复效果。
【附图说明】
图1为外加磁场条件下的细胞培养显微图；
图2为无外加磁场条件下的细胞培养显微图。
【具体实施方式】
[0010]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0011]本发明用于精确治疗的靶向性干细胞的制备方法，包括以下步骤:
[0012]1、骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离
[0013]健康成年Sprague-Dawley大鼠，麻醉后处死，用体积浓度为75%的酒精浸泡约1min，无菌条件下取四肢长骨，除去骨表面附着的软组织，用PBS缓冲液清洗干净;将两端干骺端切除，显露骨髓腔；用体积浓度为10%的FBS的低糖DMEM培养液彻底冲洗骨髓腔，然后依次用7号针头和5号针头的注射器反复冲打冲出的骨髓，使骨髓细胞充分分散，制成单细胞悬液。I只大鼠股骨和胫骨骨髓细胞接种于I个T-25cm2塑料培养瓶内，，在37°C、体积浓度为5 % C02培养箱中培养12h后更换培养液，弃去未贴壁细胞，之后每2-3天换液I次。贴壁细胞融合80%以上后，结束原代培养；
[0014]2、骨髓间充质干细胞传代扩增培养
[0015]将原代培养后的细胞用Iml质量体积比为0.25%胰蛋白酶消化约2min，待细胞形态开始皱缩，用含体积浓度为10%的胎牛血清的DMEM培养液3ml终止消化，反复轻轻吹打，移入离心管，1500rpm离心约5min，弃上清，加入含体积浓度为10%胎牛血清的低糖DMEM培养液，按1:3比例传代培养，得到第一代骨髓间充质干细胞，继续传代培养至第三代骨髓间充质干细胞；
[0016]3、超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞
[0017]首先配制标记培养液:将超顺磁性氧化铁纳米粒子以8.0yg/ml溶于含体积浓度为10%胎牛血清的低糖DMEM培养液中。
[0018]当第三代骨髓间充质干细胞生长至瓶底面积90%以上时，弃去旧培养液(含体积浓度为10%胎牛血清的低糖DMEM培养液)，用PBS溶液洗涤3遍，用标记培养液对上述细胞进行培养，轻轻混匀，置于370C ,100%饱和湿度、5 %CO2细胞培养箱中孵育24h。之后弃去旧培养液，用PBS溶液洗涤3次以去除残留的SP10。
[0019]将使用SP1标记的BMSCs以相同的数量接种于两个培养皿中，在其中一个培养皿底部中央外置一圆形磁铁(大小10*10*2mm，磁场强度0.36T)，另一个培养瓶无外加磁场作为对照，将两个培养皿置于37 °C、100%饱和湿度、5 %C02细胞培养箱中孵育24h。之后取出培养皿，用中性红染液染色1min，PBS冲洗后在显微镜下观察，可见磁铁组细胞明显聚集，大量红染细胞核重叠(图1)，对照组则未见明显聚集现象(图2)。可见使用SP1标记的干细胞可以用于精准定位的靶向性治疗。
【主权项】
1.一种用于精准治疗的靶向性干细胞的制备方法，其特征在于，该方法为:将第三代骨髓间充质干细胞培养至细胞的生长面积达到瓶底面积90%以上，弃去原培养液，PBS溶液洗涤3遍，用含有浓度为8.0yg/ml的超顺磁性氧化铁纳米粒子的培养液进行培养，培养条件为:37°C、100 %饱和湿度、5 %CO2细胞培养箱中孵育24h。然后弃去培养液，PBS溶液洗涤3遍以去除残留的纳米粒子，即得到可用于精准定位的靶向性干细胞。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述培养液为:含有10%胎牛血清的低糖DMEM培养液。
【专利摘要】本发明公开了一种用于精准治疗的靶向性干细胞的制备方法，它是在干细胞移植疗法的基础上通过使用超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO)进行标记以达到精准治疗的目的。该方法首先分离骨髓间充质干细胞，然后进行骨髓间充质干细胞传代扩增培养，再将得到的细胞使用SPIO进行标记，因为SPIO的主要成分是Fe3O4，在磁场的作用下，SPIO及其标记的干细胞在磁力的作用下可定向迁移并定植于病变损伤部位，实现精准治疗。这种方法在避免了使用支架等载体及其所带来的不良反应的同时，还能够有效增加目标区域的局部干细胞浓度，大大提高了细胞的利用率和再生修复效果。
【IPC分类】C12N5/0775
【公开号】CN105602894
【申请号】CN201610017937
【发明人】严伟祺, 狄拓宇
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月12日