]
[0149] 表3逆转录反应体系 阳1加] 阳 147!
[0148；
[0151]
阳K2] 阳 153] 阳 154] 阳1巧] 阳 156] 阳157] 2. 2细胞感染实验
[0158] Escherichia col He. col i) W MOI = 10 感染细胞，Salmonel Ia typhimurium(strain SL1344)鼠伤寒沙口氏菌 Wmoi = 5 感染细胞。
[0159] LPS(Esche;richia coli, serotype 055:B5)购自 Sigma(St. Louis, MO) Wpbs溶液 配制，处理细胞。
[0160] 3.实验结果及分析 阳161] 3. 1 MST4与细菌感染性疾病的相关性 阳162] 为研究MST4在天然免疫中的潜在功能，我们首先研究了 MST4与细菌感染相关疾 病的关联性。我们比较了 26例正常人和36例败血症病人样本，我们发现败血症病人样本 中的MST4的mRNA水平在外周血样品中明显下调（P = 0. 0163)，MST4的转录水平降低（图 la)。MST4的mRNA水平与IL-6负相关（r = -0. 3477, P = 0. 0377)(图化）。运些结果表 明MST4与特定的感染性疾病相关。
[0163] 3. 2 MST家族基因在细菌感染后表达水平的变化 阳164] 为研究MST4是否在细菌感染中发挥作用，我们采用人单核细胞系THP-I检测内毒 素对该细胞蛋白表达的影响。我们检测了 MST4 W及与MST4进化关系上比较接近的生发中 屯、激酶 MST1、MST2、MST4 和 STK25。 阳1化]结果显示1 y g/ml LI^刺激THP-I细胞使MST4的mRNA水平显著增高，而MST1/2 W及STK25的mRNA水平无显著变化。MST3由于与MST4在序列上有很高的同源性，MST3的 没RNA水平也有所上升（图1C)。在小鼠骨髓来源巨隧细胞BMM细胞系中我们也获得了相 似的实验结果（图Id)。鼠伤寒沙口氏菌化1344株W及大肠杆菌等革兰氏阴性菌处理，也 获得了相似的实验结果（图Ie, If)。因而，MST4在不同生理和病理条件下可能发挥不同的 功能。
[0166] 实施例2 MST4在细菌感染后表达水平的变化 阳167] 1.实验目的
[0168] 本实施例目的在于研究细菌感染后MST4表达水平对炎症细胞因子表达水平的影 响，W及MST4在免疫相关组织或细胞中其表达水平的变化。
[0169] 2.实验方法
[0170] 2. 1 LI^刺激后，THP-I细胞中基因表达水平检测
[0171] 提总RNA方法如基本实验方法12所述，样品扩增及检测方法如实施例1所述。 MST4基因扩增PCR引物见表1，TNFa及比-6扩增PCR引物见表7。 阳172] 表7引物序列 阳 173]
[0174] 2. 2小鼠动脉血管上皮细胞（AVEC)、肺泡上皮细胞（AEC)、肺成纤维细胞（LF)、肺 泡巨隧细胞（AM)中W及小鼠器官中基因表达水平检测的实验方法如实施例1所述，MSW基 因扩增PCR引物见表2。 阳1巧]3.实验结果及分析 阳176] 3. 1 LPS刺激后炎症细胞因子TNF a W及IL-6转录水平的变化
[0177] 由于MST4在免疫相关的巨隧细胞中表达水平受到LPS W及细菌感染的调控，我们 进一步研究了 LPS的刺激下，THP-I细胞中，MST4的mRNA水平W及参与炎症反应的细胞因 子TNF a、IL-6的转录水平（Fig. 2a)。结果显示，LPS刺激后，TNF a的转录水平迅速上调， 其mRNA水平在刺激后3小时达到峰值。与此同时，MST4的mRNA水平有所下降。在其后的 12小时，TNF a的mRNA水平逐步下降恢复至正常水平，而MST4的mRNA水平迅速上调。在 随后的48小时内，TNF a的mRNA维持正常水平，MST4的mRNA水平缓慢下降。IL-6的mRNA 水平变化模式与TNF a及MST4类似，但其变化滞后数小时，其mRNA水平在6小时内上升约 25%，在24小时后达到峰值。因而LPS刺激引起的MST4的mRNA水平变化及细胞因子表达 与炎症反应有很强的关联性。
[0178] 3. 2 MST4表达水平的变化在免疫细胞中最为明显
[0179] 为进一步验证MST4在免疫反应中的作用，我们检测了小鼠不同原发细胞系中LPS 刺激引起的MST4的mRNA水平变化，包括动脉血管上皮细胞（AVEC)，肺泡上皮细胞（AEC)， 肺成纤维细胞（L巧和肺泡巨隧细胞（AM) (Fig. 2b)。与THP-I细胞中的结果一样，LI^刺 激后3小时内，肺泡巨隧细胞中的MST4转录水平急剧下降，而后急剧上升，在12小时转录 水平升高至8倍达到峰值，然后48小时内缓慢下降。相较于巨隧细胞，动脉血管上皮细胞 (AVEC)，肺泡上皮细胞（AEC)和成纤维细胞（L巧的MST4转录水平在LPS刺激24小时后增 加了约4倍，增幅较缓，而后缓慢下降。化1344菌株感染小鼠后，其MST4转录水平也有类似 变化（Fig. 2c)。肺泡巨隧细胞中MST4的转录水平在感染后急剧下降约50%，而后急剧上 升至9倍。动脉血管上皮细胞（AVEC)，肺泡上皮细胞（AEC)和成纤维细胞（L巧的MST4转 录水平上升2-4倍，增幅较缓。W上结果印证了在LI^刺激和细菌感染的情况下，MST4的 表达水平会发生明显改变，运种变化在免疫细胞，特别是巨隧细胞中尤为突出。
[0180] 3. 3 MST4表达水平在免疫器官中有明显改变
[0181] 我们还分析了 LI^刺激下，小鼠器官中MST4的表达水平（Fig. 2d)。结果表明， MST4的表达水平在骨髓、脾脏和胸腺等免疫器官中有明显变化。肺部、膜腺、肝脏和淋己结 中的MST4表达水平变化较小。此外，LI^刺激后，MST4在其他实质器官如脑，屯、脏，肠道和 肾脏的表达水平无明显改变。 阳182] 说明MST4基因的表达水平可用于败血症、细菌性频疾W及追疾的早期诊断指标， 通过调控MST4水平改善宿主过度免疫反应而用于败血症等感染性疾病的治疗。
[0183] 实施例3 MST4负调控LPS或细菌诱导的TLR信号通路
[0184] 1.实验目的
[01化]本实施例目的在于研究MST4对于免疫相关促炎症细胞因子表达的影响及信号通 路的调控作用。 阳186] 2.实验方法 阳187] 2. 1慢病毒重组shMST4的制备
[0188] 设计一段21个碱基的祀序列（ShRNA)分别敲除MST4的编码区和非编码区， 该序列可W形成反向互补的发卡状结构，沉默相关基因表达。MST4shRNA W及对照 shRNA(scramble)连接至慢病毒载体 pLKO. l-puro。shRNA(scramble)为对照。
[0189] 人 shMST4olig〇-l (针对 MST4 编码区） 阳 190] F 阳1W] 5 ' -CCGGCAGCAAGTCGTTGCTATTAAAATCTCGAGATTTTAATAGCTTCGACTTGCTGTTTTTG-3 '(沈Q ID NO :63)
阳192] R 阳 193] '佛Q 阳 194] 阳1巧] 阳 196] '佛Q 阳 197] 阳19引 AA-3'. 阳 199] 阳200] 阳 201] '佛Q 阳202] 阳203] '(沈Q ID NO :68) 阳204] 0.0 lM的正向和反向DNA链混合，稀释至50ul，经过如下反应： 阳2化] 阳2〇6] 退火连接为双链。双链DM与pLKO.
1-puro (EcoRI/Agel双酶切）载体连接，转 化D册a，鉴定得到的阳性克隆经测序验证后提取质粒。将质粒转染293细胞，用2 y g/ ml puromycin筛选基因组稳定整合shRNA序列的细胞，48-72小时后，使用Vivaspin 20ml (Sartorius Stedim Biotech, Auba即e, Rrance) W 3000g 的离屯、力，离屯、50min，浓缩 病毒液。 阳207] pLKO. 1-puro质粒从中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究 所季红斌研究员处获得，为市售的构建RNAi的常用载体，可从Addgene公司购得。 阳20引将MST4的cDNA克隆至自失活慢病毒载体pLKO. I-EGFP中，过表达MST4,带有EGFP 的空载体作为对照。 阳209] 过表达的真核MST4载体Flag-MST4质粒从中国科学院上海生命科学院生物化学 与细胞生物学研究所赵允研究员处获得，质粒信息参见化i Z，et al. (2013) Structure of the MST4in complex with M025provides insights into its activation mechanism. Struc化re 21(3) :449-461. O
[0210] 2.2基因转录水平的检测 阳211 ] THP-I细胞和PEM细胞提取总RNA方法如基本实验方法所述，样品扩增及检测方法 如实施例1所述。THP-I细胞样品比-6基因扩增PCR引物见表5,阳M细胞样品中TNFa、 比-6、比-1基因扩增PCR引物见表8 : 阳212] 表8引物序列 阳 213]
[0214] 2. 3 I邸表达水平的检测
[0215] 采用免疫印迹的方法检测细胞中的I KBa的蛋白水平，免疫印迹的实验方法如 基本实验方法4所述，IkBq抗体购自Cell Si即aling (Danvers, MA)。IkBq蛋白水平 的变化W免疫印迹结果的灰度值表征。
[0216] 3.实验结果及分析
[0217] 3. 1 THP-I细胞中MST4对于促炎症细胞因子表达的影响
[0218] 为检测MST4是否会促进促炎症细胞因子的产生W及NF-K B的激活，我们在THP-I 细胞中过表达MST4或shMST4的重组慢病毒转染THP-I细胞。我们发现，过表达MST4使 TNFa W及比-6的mRNA及蛋白水平下调（Fig. 3a-b'）。相反的，敲除MST4(shMST4的重组 慢病毒转染）大大促进TNF a和IL-6的表达（Fig. 3c-d')。
[0219] 3. 2阳M细胞中MST4对于促炎症细胞因子表达的影响
[0220] 我们检测了小鼠腹腔巨隧细胞（PEM)被细菌感染后MST4的作用。与LPS刺激相 同，感染大肠杆菌或化1344菌株后，过表达MST4可W使阳M细胞中TNFa，比-6和比-1的 转录水平明显下调（Fig. 3e-g')。 阳22U 3. 3 MST4参与调控天然免疫反应 悦巧我们检测了 MST4对LI^刺激诱导的NF-KB激活的调控作用。我们检测了 I邸的 水平，发现在THP-I细胞中，过表达MST4使I邸的降解略有减少（Fig. 3h，h')。相反，敲除 MST4,在LI^刺激后，I邸快速降解（Fig. 3i，i')。W上数据显示MST4很有可能负调控LPS 和细菌诱导的天然免疫反应。 阳22引实施例4 MST4抑制LPS诱导的免疫应答的功能与其激酶活性相关 阳224] 1.实验目的
[0225] 本实施例目的在于研究MST4对免疫反应的调控是否与其激酶活性相关 阳226] 2.实验方法 阳227] 2. 1 MST4突变体T187E及K53R的构建 阳22引 MST4突变体K53R W Flag-MST4为模板，采用表9中沈Q ID NO :31~32所示引 物进行PCR扩增后，使用化nl去甲基化酶去除未突变的野生型MST4模板，扩增获得带有特 定位点突变的带有MST4基因的载体片段，将PCR产物转化D册a感受态细胞，通过抗性筛 选，获得的阳性克隆。 阳229] MST4突变体T178E W Flag-MST4为模板，采用表9中沈Q ID NO :33~34所示引 物进行PCR扩增后，使用化nl去甲基化酶去除未突变的野生型MST4模板，扩增获得带有特 定位点突变的带有MST4基因的载体片段，将PCR产物转化D册a感受态细胞，通过抗性筛 选，获得的阳性克隆。
[0230] 表9引物序列 [02311
阳232] 2. 2 shMST4沉默M邸细胞中MST4的表达的实验方法如实施例3所述。 阳23引 2. 3 TNF a、比-6分泌表达的检测 阳234] 收集细胞及培养液进行化ISA (酶联免疫吸附实验）检测细胞因子。人THP-I细胞 中TNF a和IL-6的转录和分泌水平采用eBioscience试剂盒检测。小鼠 MEF细胞中TNF a 和IL-6的转录和分泌水平采用抓Bioscience试剂盒检测。检测方法按产品手册所述。 [0235] 3.实验结果及分析 阳236] 3. 1 MST4突变体对于炎症细胞因子的表达及信号通路的影响 阳237] 为研究MST4的激酶活性是否与其抑制LPS诱导的免疫应答有关，我们基于已解析 的MST4结构及生化信息，构建了两个MST4突变体，即激酶激活突变体T178E灯巧激酶失活 突变体K53R化时。通过检测THP-I细胞中TNFa和IL-6的转录和分泌水平，我们发现，相 较于野生型，T178E突变体对于LPS诱导的NF- K B信号通路有着更强的抑制作用，I邸的降 解也更多（Fig. 4曰，a')。相对地，激酶失活突变体K53R对LI^诱导的NF- K B信号通路没 有抑制作用，TNFa，IL-6 W及I邸的水平与转染野生型没有显著差别（Fig. 4b-c')。我们 进一步在小鼠胚胎成纤维细胞中证实了 IKB的降解和p65的转运（Fig. 4d，e)。W上实验结 果说明，MST4的激酶活性对于其抑制LPS介导的NF- K B激活是必须的。
[0238] 3. 2 Rescue实验验证MST4突变体对于炎症细胞因子的表达及信号通路的影响 阳239] 为研究MST4在天然免疫中的作用，我们在M邸细胞中转染了 MST4的shRNA，沉默 内源的MST4表达（Fig. 4f)。该ShRNA针对MST4的非编码区，不影响外源的野生型或突变型 的1514化