胶球藻属的新的抗辐射藻类的制作方法_3

文档序号:9924934阅读:来源:国知局
水中,其pH通过添加 HCl或KOH而被调节成目标值。培养物生长在维持21 ± TC、W 10化pm摇动且90± IOPAR持续照明的Infors Multitron培养箱中。每日都对介质的抑进行 测试,如果需要则重新进行调节。通过测量藻类的光合产量(是细胞整体生理学状态的指示 物),评价作为介质pH的函数的藻类状态。使用PAM 103巧光计,测量光合产量。图2示出作为 不同抑值的函数的微藻的光合产量值。示出它们可存活在抑为1至9(测试的抑范围)的介质 中。图2示出,微藻在由脱矿质水构成的介质中保持良好的生理学状态,并且不管抑是多少, 它们都保持良好的生理学状态。
[0064] Coccomyxa藻株C-IR3-4C微藻也能生长在宽范围抑的液体介质中。图3示出作为抑 的函数,藻类群落的细胞密度随时间在pH为1至9的介质中的变化。培养条件与图2中的相 同。在显微镜(X40放大率)下,使用Malassez计数板进行细胞密度计数。为了获得快速生长 和高微藻密度,使用4至8的pH范围。
[00化]微藻和生化特征
[0066] 通过光子显微镜和电子显微镜观察,分离的微藻是单细胞的、楠球形,且是有核的 (图4A和图4B)。图4A和图4B是分别通过光子显微镜(Zeiss Axioplan 2双目显微镜,1300放 大率)和透射电子显微镜(JEOL 1200EX和飞利浦(陆ilips)CM 120)观察到的运些微藻的照 片。使用化ilips CM 120TEM的观察在克洛德?贝纳尔-里昂第一大学的显微组织技术中屯、 进行。微藻包含叶绿体(可能有数个),叶绿体包含叶绿素并且是光合作用的位点。其它细胞 器(尤其是液泡)占据了细胞的剩余空间。
[0067] 该有机体的UV-可见吸收光谱示出,存在叶绿素 a(吸收峰为663nm)、叶绿素 b(吸收 峰为647nm)和类胡萝h素(吸收峰为470nm)。
[00側核糖体DNA基因的扩增和测序
[0069] 使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Wizard Genomic DNA 化rification Kit, Promega),提取如上所述分离的C-IR3-4C微藻的总DNA。
[0070] 通过PCR,扩增基因组中覆盖 18S rRNA-ITSl-5.8S rRNA-ITS2-28S rRNA(开始的 500个碱基)核糖体DNA基因的区域。
[0071] 所使用的引物是传统用于扩增微藻rRM基因的EAF3:TCGACAATCTGGTTG ATCCTGCCAG(SEQ ID NO:2)^PITS055R:CTCCTTGGTC CGTGTTTCAAGACGGG(SEQ ID N0:3)〇
[0072] 对使用分离自两个独立培养物的DNA所获得的扩增产物进行测序,并且该扩增产 物具有3101个碱基。运些扩增产物的序列示于图5和附件的序列表中,其在序列表中的编号 为SEQ ID N0:1。该序列代表藻类Coccomyxa C-IR3-4C的基因组中覆盖18S rRNA-ITSl-5.8S rRNA-口S2-28S rRNA(起始)核糖体DNA基因的区域的序列。对应于18S rRNA的部分具 有下划线并且是斜体,ITSl是粗体,5.8S rRNA具有下划线,ITS2是斜体,并且28S rRNA是粗 体并且具有下划线。
[0073] 使用BLASTN算法(Altschul et al. ,Nucleic Acids Research,25:3389-3402, 1997),捜索与SEQ ID NO: I的序列具有最大同一性的核糖体RNA基因序列的数据库。该捜索 显示,特征与微藻C-IR3-4C最类似的物种属于Coccomyxa属。
[0074] 通过使用BLAST?算法的多序列比对,将微藻C-IR3-4C(1807bp)和在数据库中列 出的其它Coccomyxa物种的对应于小核糖体亚基(18S rRNA)的RNA的序列进行对比。下面的 表1I示出了该序列对比的结果。其它物种的序列可在GenBank数据库中获得,并且对应的登 录号也示于表1I中。
[0075] 表1I;
[007引
[OOW] 该序列对比示出,与C-IR3-4C藻株最类似的物种是Coccomyxa rayssiae藻株 UTEX273、Coccomyxa藻株CCAP 216/24、Pseudococcomyxa simplex藻株SAG 216-9日、 Coccomyxa chodatii藻株SAG 216-2、Pseudococcomyxa simplex藻株UTEX 274、Coccomyxa peltigerae藻株SAG 216-5、Pseudococcomyxa simplex藻株CAUP H 102、Coccomyxa藻株 KN-2011-E4、Coccomyxa藻株CCAP 211/97; W及属于Coccomyxae属的具有99%序列同一性 的其它藻株;仍然属于Coccomyxae属的具有98 %序列同一'性的其它藻株,诸如Coccomyxa藻 株CPCC 508或Coccomyxa藻株SAG 2325;具有97%序列同一性的其它Coccomyxae,诸如 Coccomyxa glaronensis藻株CCALA 306、Coccomyxa sp.Flensburg fjord 2或Coccomyxa mucigena藻株SAG 216-4。
[0080] 与Coccomyxa属相比,Coccomyxa藻株C-IR3-4C获得的运些高同一'性分数,接近 Coccomyxae彼此序列进行对比之后获得的那些同一性分数(96%~99%),而与属于另一属 (Chlamydomonas SP.CCMP681 (EF106784.1 ),93%同一性)的单细胞微藻的序列对比所获得 的分数相差很远。运表示藻株CCAP 216/26是Coccomyxa属的成员。
[0081 ] 进一步,还进行了藻株C-IR3-4C与其它Coccomyxae的ITS区域序列的对比。下面的 表1II示出ITS1-5.8S rRNA-ITS2区域的序列对比的结果。其它物种的序列可在GenBank数 据库中获得,并且对应的登录号也示于表HI中。
[0082] 表1II:
[0083]
[0084]
[0085] 该序列对比示出,藻株C-IR3-4C的序列与提到的其它Coccomyxae藻株具有83%至 95 %的同一'性,运与提到的Coccomyxae的ITS区域彼此进行对比所获得的分数(78 %至 99%)-致,而与其它属进行对比所获得的分数(约30%至50%)相差很大。
[0086] 因此,它是与迄今为止提到所有物种都不同的Coccomyxa物种。运些结果示出,事 实上,分离的微藻是Coccomyxa属的成员,但是它的DNA,尤其是口Sl和口S2的DNA,与数据库 中列出的Coccomyxae的其它物种非常不同,从而认为它是一个新的物种,在本文中被命名 为Coccomyxa C-IR3-4C。
[0087] 图6示出在对应于18S rRNA的DNA序列进行比对(BLASTN)之后获得的系统进化树。 条(bar)表示1 % (0.01)的替换率。
[0088] 实施例2:Coccomyxa C-IR3-4C对电离福射的抗性
[0089] 通过将Coccomyxa C-IR3-4C藻类暴露于来自衰减的乏燃料的多种剂量的丫福射, 测试Coccomyxa C-IR3-4C藻类对电离福射的抗性。通过活体染色(中性红),确定福照后的 死亡率。
[0090] 图7示出在急性福照之后S天测量的、作为福照剂量的函数的Coccomyxa C-IR3-4C的死亡百分比。杀死一半群体的电离福射剂量在2kGy至6kGy之间。
[0091] 实施例3:利用C0CC0MYXA C-IR3-4C对来自核厂的水的净化
[0092] 在光照下,将具有来自乏燃料池的水的典型组成的水与Coccomyxae C-IR3-4C接 触24小时。将新鲜的IOOmg重的Coccomyxae C-IR3-4C藻类与初始含有0-发射放射性核素化 (200,000Bq/l)和Mc(1000 Bqzl)及在下面的表1V中列出的丫-发射放射性核素的50ml水接 触,其中Coccomyxae C-IR3-4C藻类首先培养在液体BBM中,并且预先经Milli-Q水冲洗S 次。
[0093] 表1V; 「moAl
LUWS」 巧氷和澡突绘巧24小町联触之后巧打的丫-光谐测足不出,去除J氷甲81 %的丫 活性。
[0096] 在24小时中,藻类结合的丫-发射放射性核素的百分比示于下面的表V中。
[0097] 表V: 「00981
[0099] 从水中,纯化了全部或几乎全部的iiumAg、u'/Cs和W及一半的^Mn和?Co。
[0100] 实施例4:利用Coccomyxa C-IR3-4C的原位作用对存储池的水的净化
[0101 ]存在于核乏燃料池中的Coccomyxae C-IR3-4C微藻,净化存在于该池中的放射性 核素。所述池充满抑在6至7之间、导电性在化S/cm至化S/cm之间并且平均溫度为25°C的水, 并且由于其中储存的材料而包含放射性金属元素。它与环境空气接触,并且通过氛灯进行 照明。
[0102] 在运样的条件下,Coccomyxa C-IR3-4C能植生在池内的存储架上,并且可存活在 存储架上并且在存储架上繁殖数年。
[0103] 丫光谱采集的数量能确定被约Ig鲜重的藻类浓缩的总放射性和性质,W及每一个 T发射体的放射性,并且给出在下面的表VI中。微藻的活性在该表中被定义为:Ig鲜重的藻 类的放射性(Bq)与Iml藻类在其中存活的水的放射性的比率。
[0104]表VI;
[0106] 运些结果示出,藻类的放射性比它们存活在其中的水中的放射性高IO4倍,因此它 们实际上浓缩了放射性元素、 66Cu、92Sr、IWmAg、I^Cs和I37Cs。
[0107] Coccomyxa C-IR3-4C藻类具有约20,000的飽-137(I37Cs)浓缩系数,该飽-137 (I37Cs)浓缩系数被定义为藻类结合的Cs的浓度(原子/g鲜物质)与水中的Cs的浓度(原子/ ml)的比率。
[0108] 实施例5:利用Coccomyxa chodatii对来自核厂的水的净化
[0109] 测定Coccomyxa chodatii(藻株SAG 216/2)藻类对电离福射的抗性,示出杀死一 半群体的电离福射的剂量约为1.化Gy(上面引用的Rivasseau et al. ,2013)。藻类的电离 福射抗性LDso通常在30Gy至1200Gy之间(上面引用的IAEA, 1976)。
[0110] 除了Coccomyxa actinabiotis的抗性之外,属于Coccomyxa属的微藻的福射耐受 性似乎局于属于其它属的澡类,同样,属于Deinococcus属的所有细菌也都具有局福射耐雙 性。
[0111] 为了石角定Coccomyxa chodatii是否共享Coccomyxa actinabiotis和Coccomyxa C-IR3-4C的元素摄取能力,在光照下,将具有来自核乏燃料池的水的典型组成的水与 Coccomyxae chodatii接触24小时。将IlOmg鲜重的Coccomyxae chodatii藻类与初始含有 e-发射放射性核素化(200,OOOBq^)和1化(lOOOBq/1)及在上面的表1V中列出的丫-发射放 射性核素的50ml水接触,其中该Coccomyxae chodatii藻类首先培养在液体BBM中,并且预 先经Mi Ili-Q水冲洗S次。
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