验中，W与对于测定最佳抑所 使用的浓度相同的各自多肤的浓度，在具有O.lmg/ml BSA和5ppm ZEN的处于各自最佳抑下 的IOOmM化is-HCl缓冲液中，在批料中使用运些经预溫育的样品。在O小时、0.5小时、I小 时、2小时和3小时的溫育时间后进行取样。随后，将多肤在99°C下加热失活10分钟，并且将 样品胆存于-2(TC。在解冻后，将样品转移到HPLC小瓶中，并且如在实施例帥所描述的那样 借助于HPLC-DAD来进行分析。将抑稳定性定义为在抑5.0下多肤的残余活性百分比，相对 于在各自最佳抑下的活性而言。对于抑5.0的抑稳定性显示在表11中。
[0143] 表11:在抑5.0下多肤的抑稳定性。
[0144]
[0145] 实施例12: ZEN降解试验
[0146] 示例性地对于具有沈Q ID No. 1、2、5、6、7、9、11、12和15的多肤，进行ZEN至监EN和 畑ZEN的降解。所述降解批料在具有O.lmg/ml BSA和5ppm ZEN的Teorell Stenhagen缓冲液 (pH 7.5)中实施制备。在30°C下溫育所述降解批料。在0小时、0.5小时、1小时、2小时和3小 时的溫育时间后进行取样。随后，将多肤在99°C下加热失活10分钟，并且将样品胆存于-20 °C。在解冻后，将样品转移到HPLC小瓶中，并且如在实施例8中所描述的那样借助于HPLC-DAD来进行分析。如此地来选择多肤浓度，从而在大约3小时后达到完全的降解。降解动力学 描绘在图3中，其中y轴显示了 W微摩尔/升(皿01 /1)表示的ZEN、监EN和DHZEN的浓度，和X轴 显示了 W小时化)表示的溫育时间。
[0147] 邮M表示微体积摩尔浓度，并且相应于单位WIio VI。
【主权项】
1. 以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，其特征 在于，所述多肽是具有选自SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列或其功能性变体的水解酶，其中 在所述功能性变体与至少一个所述氨基酸序列之间的序列同一性为至少40%。2. 根据权利要求1的多肽，其特征在于，所述多肽包含至少一个保守氨基酸序列区段或 其功能性变体，其中所述氨基酸序列区段的功能性变体具有至少70%，优选地至少84%，更优 选地至少92%，和最优选地至少98%的序列同一性，并且所述至少一个保守氨基酸序列区段 选自具有SEQ ID No.l的序列的氨基酸序列+24至+50、+52至+77、+79至+87、+89至+145、+ 150 至+171、+177至+193、+223至+228、+230至+237、+239至+247、+249至+255、+257至+261、+ 263 至+270、+272 至+279、+297 至+301、+303至+313、+24至328、+1至+328。3. 根据权利要求1或2的多肽，其特征在于，所述功能性变体具有选自下列的氨基酸修 饰:各自一个或多个氨基酸的置换、缺失和插入。4. 根据权利要求1、2或3之一的多肽，其特征在于，所述多肽具有至少0.01U/mg，优选地 至少0.1U/mg，特别地至少lU/mg的比活性，和/或具有最高50μΜ，优选地最高3.5μΜ，特别 地最高〇. 5μΜ的以水解方式裂解玉米赤霉烯酮的Km值，和/或具有至少0. Οδ?Γ1，优选地至少 〇. 6JT1，特别地至少δ?Γ1的以水解方式裂解玉米赤霉烯酮的1^*值，和/或具有至少0. ΟΟΟΟΙμ Μ?，优选地至少Ο.ΟΟΟΙμΜ?，特别地至少Ο.ΟΟΙμΜ^?Γ1的以水解方式裂解玉米赤霉 稀酮的Vmax值。5. 根据权利要求1至4之一的多肽，其特征在于，所述多肽包含选自SEQ ID No. 2、5、6、 7、9、11和15的氨基酸序列或其功能性变体，其中所述功能性变体与至少一个所述氨基酸序 列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽在pH 5.0下的pH稳定性为至少15%，优选地 50%，和特别优选地至少90%。6. 根据权利要求1至4之一的多肽，其特征在于，所述多肽包含选自SEQ ID No.l、2、5、 6、7、9、11、15的氨基酸序列或其功能性变体，其中所述功能性变体与至少一个所述氨基酸 序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽在30°C和75°C之间，优选地38°C和55°C之 间，特别优选地38°C和52°C之间的温度范围内具有最高的酶促活性。7. 根据权利要求1至4之一的多肽，其特征在于，所述多肽包含选自SEQ ID No. 1、5、6、 9、11、12和15的氨基酸序列或其功能性变体，其中所述功能性变体与至少一个所述氨基酸 序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽是温度稳定的，直至90°C，优选地75°C，和特 别优选地60°C的温度。8. 根据权利要求1至7之一的多肽，其特征在于，所述多肽在至少一个选自下列的位置 处具有关于SEQ ID No.l的氨基酸序列的至少一个突变:22、23、25、26、27、29、31、32、35、 37、42、43、46、51、53、54、57、60、69、72、73、78、80、84、88、95、97、99、114、118、119、123、132、 141、146、148、149、154、163、164、165、169、170、172、176、180、182、183、190、191、194、196、 197、198、201、204、205、206、207、208、209、210、212、213、214、216、217、220、221、222、229、 231、233、238、240、244、245、246、248、249、251、254、256、260、262、263、266、269、271、277、 280、281、282、283、284、285、286、287、292、296、298、302、307、308、309、311、314、317、319、 321、323、325和326。9. 根据权利要求8的多肽，其特征在于，所述多肽具有选自下列的关于SEQ ID No.l的 氨基酸序列的至少一个突变:D22A、S23Q、S23L、N25D、I26V、F27Y、F27H、S29P、R31A、F32Y、 R35K、R35Q、V37A、V42I、V43T、F46Y、S51E、S51D、D53G、N54M、N54R、L57V、L60I、S69G、P72E、 V73A、A78S、N80H、F84Y、I88L、T95S、T97A、R99K、I114M、I118V、K119R、V123I、L132V、A141S、 I146V、I146L、A148G、A149V、A154P、P163T、A164T、Y165C、Y165H、V169I、L170R、A172G、 A176M、A176V、Y180F、D182T、F183Y、I190V、G191S、K194T、K194E、F196Y、V197C、V197R、 E198R、E198S、K201D、K201G、P204S、P204A、A205S、K206P、A207M、M208A、Q209R、L210A、 L210S、AP212、T213V、P214A、E216T、E216G、A217I、N220H、L221M、K222R、K222Q、G229A、 A231V、F233W、F233Y、F233H、A238G、H240N、H240S、D244E、R245Q、M246L、S248T、S248N、 S248G、Q249R、K251N、I254V、I256L、A260M、T262D、T262G、I263T、E266D、E269H、E269N、 L271V、L277E、E280A、E280L、H281R、H281Q、A282V、Q283R、D284L、D284R、I285L、I286M、 R287E、R287D、R292K、R292T、Q296A、Q296E、H298V、L302S、L307Q、F308S、D309A、A311P、 A314V、L317F、S319Q、S319P、S319R、S321A、S321T、T323A、P325A、A326P。10. 根据权利要求1至8之一的多肽，其特征在于，包含至少一个选自SEQ ID No. 32-69 的下列氨基酸基序。11. 根据权利要求9的多肽，其特征在于，所述多肽在至少一个位置处包含至少一个保 守氨基酸置换，并且所述保守氨基酸置换选自：G至A;或A至G、S;或V至1丄^、1\3;或1至￥、 L、M;或L至I、M、V;或 Μ至L、I、V;或P至A、S、N;或F至Y、W、H;或Y至F、W、H;或W至Y、F、H;或R 至K、 E、D;或K至R、E、D;或H至Q、N、S;或D或N、E、K、R、Q ;或E至Q、D、K、R、N;或S至T、A;或T至S、V、A; 或C至S、T、A;或N至D、Q、H、S;或Q至E、N、H、K、R的置换。12. 分离的多核苷酸，其具有编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有水解玉米赤霉 烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的特性，其特征在于，所述核苷酸序列编码至少一 种根据权利要求1至11之一的多肽;和/或所述核苷酸序列与至少一种选自SEQ ID No.16-31的核苷酸序列具有序列同一性程度，其中所选择的核苷酸序列为至少40%;和/或所述核 苷酸序列在中等严紧条件下与至少一种选自SEQ ID No.16-31的核苷酸序列杂交，和/或与 具有至少200个核苷酸，特别是至少100个核苷酸的其部分序列杂交，和/或与上述核苷酸序 列或其部分序列的互补链杂交。13. 以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的添加剂，其特 征在于，所述添加剂包含至少一种具有选自SEQ ID No.1-15的氨基酸序列或其功能性变体 的多肽，其中在所述功能性变体与至少一个所述氨基酸序列之间的序列同一性为至少 40% ;并且任选地包含助剂。14. 根据权利要求13的添加剂，其特征在于，包含至少一种根据权利要求1至11之一的 多肽。15. 根据权利要求13或14之一的添加剂，其特征在于，所述助剂选自：至少一种惰性载 体，以及任选地，其他成分，例如维生素和/或矿物质和/或酶和/或其他用于使真菌毒素解 毒的组分。16. 根据权利要求13、14或15之一的添加剂，其特征在于，在所述添加剂中，以最高10， 〇〇〇U/g，优选地最高1，000U/g，更优选地最高100U/g，和最优选地最高10U/g的浓度包含至 少一种根据权利要求1至11之一的多肽。17. 根据权利要求13至16之一的添加剂，其特征在于，所述添加剂以经包囊或经包衣的 形式存在。18. 根据权利要求13至17之一的添加剂用于以水解方式裂解在饲料中、在食物中或在 中的玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的用途，所述饲料特别地为用于猪、 家禽和水产养殖的饲料。19. 用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的方法，其 特征在于，所述玉米赤霉稀酮和/或至少一种玉米赤霉稀酮衍生物被具有选自SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列或其功能性变体的多肽水解，其中在所述功能性变体与至少一个所 述氨基酸序列之间的序列同一性为至少40%。20. 根据权利要求19的方法，其特征在于，在根据权利要求14至17之一的添加剂中使用 所述多肽。21. 根据权利要求20的方法，其特征在于，将所述多肽或添加剂与被玉米赤霉烯酮和/ 或被至少一种玉米赤霉烯酮衍生物污染的饲料或食物相掺混，使所述被污染的饲料或食物 与湿气相接触，并且所述多肽或添加剂水解在所述被污染的饲料或食物中所包含的玉米赤 霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物。22. 根据权利要求19至21之一的方法，其特征在于，至少70 %，优选地至少80 %，特别优 选地至少90 %的所述玉米赤霉稀酮和/或至少一种玉米赤霉稀酮衍生物被水解。
【专利摘要】以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，其是具有选自SEQ ID No.1-15的氨基酸序列或其功能性变体的水解酶，其中在所述功能性变体与至少一个所述氨基酸序列之间的序列同一性为至少40％；以及包含所述多肽的添加剂；以及编码所述多肽的分离的多核苷酸；以及用于用所述多肽来以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的方法。
【IPC分类】C12N9/14, C12N15/55, A23K20/189
【公开号】CN105705637
【申请号】CN201480055221
【发明人】S·弗鲁豪夫, M·萨姆海塞尔, M·费菲尔, D·摩尔, G·沙特兹迈尔, E·M·宾德
【申请人】爱尔伯股份公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2014年8月27日
【公告号】CA2922178A1, EP3039134A2, EP3039135A2, WO2015027258A2, WO2015027258A3, WO2015027259A2, WO2015027259A3