33(d，J = 4.細z，lH)，2.82(s，3H)，1.68(s，細）.
[0099] 对PUK- 丫脂质激酶的体外效能
[0100] 实施例3.PI3K抑制试验
[0101] 使用来自Beckman Coulter的Biomek FX，将10个100%DMS0中2.5倍连续稀释的本 发明化合物各1.扣L加入到96孔聚苯乙締平板[Corning,Costar Item No.3697]的单个孔 中（后面称为"测试孔"）。一个测试孔还含有1.扣L不含化合物的DMS0。另一个孔在DMSO中含 有已知能完全抑制酶的浓度的抑制剂（后面称为"背景孔"）。使用Titedek Multidrop,将 50化反应混合物[IOOmM 肥阳S pH 7.5,50mM NaCiaomM DTT，0.2mg/mL BSA，6化1 憐脂酷 肌醇（4,5)二憐酸醋山(：16。1(4,5冲2;4￥日11^?01日'^91(13，〔日1.齡.840046?)和关注的 PI3K同工型（同工型的浓度参见表1)]加入到各个孔中。为启动反应，将50化ATP混合物 [20mM MgCl2,6測ATP (100此i/皿01 33P-ATP)]加入到各个孔中，然后将各个孔在25 °C下溫 育30分钟。各个孔的最终浓度为50mM肥阳S 7.5，10mM MgCl2,25mM化Cl，5mM DTT，0.1mg/ ml BSA，30iiM PI(4,5)P2,3iiM ATP和关注的PI3K同工型（参见表3)。各个孔中最终化合物浓 度为 lOiiM-lnM。
[0102] 表1 「AO1
[0104] 在溫育后，各个孔中的反应通过加入50化终止溶液[30%TCA/水，IOmM ATP]泽灭。 然后将各个泽灭的反应混合物转移到96孔玻璃纤维滤板中[Corning ,Costar Item No. 3511]。将平板真空过滤，然后用150化的5%TCA/水在改良的Bio-Tek Instruments ELX-405自动平板洗涂器中洗涂3次。将50化闪烁流体加入各个孔中，并将平板在Perkin-Elmer TopCount? NXT液体闪烁计数器上读数，从而获得代表抑制值的33P-数。
[0105] 从各个测试孔获得的数值中减去背景孔的数值，将数据拟合入Morrison和Stone, Comments Mol.Cell Biophys.2:347-368,1985中描述的竞争紧密结合Ki等式中。化合物1 的PI3K 丫抑制程度随ATP浓度呈线性改变，显示竞争性抑制，其中Ki值为8+/-4nM。此外，还 观察到化合物1对?131(-〇、？131(-0、？131(-6同工型测试的同工型选择性且确定对?131(丫15倍 W上的选择性，如表2中所示。
[0106] 表2.化合物1的PI3K同工型选择性
[0107]
[010引细胞效能
[0109] PI3K是由调节亚基和催化亚基组成的多亚基复合物。运类酶催化憐脂酷肌醇-4， 5-二憐酸(PIP2)的憐酸化，得到第二信使憐脂酷肌醇-3,4,5-=憐酸(PIP3)。受体活化导致 PIP3水平瞬时增加。PIP3作为质膜上的停泊位点起作用，从而补充和活化包含蛋白质(例如 Akt、PDK-1、Tek激酶等）的普列克底物蛋白同源性(PH)结构域。然后它们调节关键细胞功 能，例如生长、代谢、迁移、呼吸暴发等。当下游效应物在PI3K信号传导途经中是常见的时， 它是确定PI3K同工型在活化时补充的受体。基于此，众多基于生化-pAkt的和功能性试验用 于分析PI3K 丫抑制剂相对于另外的PI3K同工型的效能和选择性。
[0110] 实施例4. THP-I细胞中MCP-I刺激的pAkt
[0111] 趋化因子如MCP-I结合其受体，导致PI3K 丫信号传导途经活化。PI3K 丫导致PIP3生 成和下游分子(如PDK-I和Akt)活化。Akt憐酸化是细胞中PI3K活性的量度。在本试验中，使 THP-I细胞(人单核细胞系)饥饿过夜，W耗尽pAkt水平。随后用MCP-I刺激3分钟导致PI3K 丫 诱导的苏氨酸308和丝氨酸473位点上Akt的憐酸化。固定细胞，染色胞内phosphoAKT (Ser473)，然后使用抓FACS化libur?细胞计数器分析，得到细胞PI3K 丫活性的测量值。在 本试验中化合物1具有0.24 ± 0.07iiM的ICso。参见表3。
[0112] 表3.化合物1在PI3K-a/e/S依赖性体外试验中的效能
[01"1
[0114] 实施例5.全血和白细胞突发性氧化作用试验
[0115] 中性白细胞、单核细胞和巨隧细胞是先天免疫性的关键介体。它们释放活性氧 (ROS)作为先天性免疫炎症应答的组成部分。ROS产生被炎症介体诱导，如趋化因子、细菌肤 类和募集先天性免疫细胞至炎症部位的补体。运些炎症介体触发PI3K 丫活化并且启动下游 信号传导级联，其导致在生成ROS的质膜处完全NADPH氧化酶复合物装配。根据生成的ROS确 定全血和栋黄层中性白细胞和单核细胞中的PI3K 丫功能活性。用TNF-a将细胞刺激10分钟， 然后用细菌细胞壁衍生的趋化性肤fMLP刺激20分钟，并且加载非巧光染料二氨罗丹明1，2， S(DHR)。由细胞产生的ROS由此将D皿氧化成巧光罗丹明，导致细胞中的巧光罗丹明含量增 加。根据中性白细胞和单核细胞在fMLP刺激后生成ROS的能力确定PI3K 丫功能活性。使用抓 FACS化libur?分析白细胞和全血样品，W便对巧光罗丹明的细胞阳性定量。栋黄层细胞在 血清的存在下生成IC50S，并且全血试验在不存在血清下生成IC50S。化合物1在栋黄层白细胞 试验中具有0.的ICso并且在全血试验中具有0.57iiM的ICso，参见表3。
[0116] 实施例6. THP-I细胞中CSF-I刺激的pAkt
[0117] 生长因子、细胞因子和其它受体酪氨酸激酶配体(如CSFl)结合其受体，导致IA类 PI3K信号传导途经活化。PI3K活化导致生成PIP3和下游分子(如PDK-I和Akt)活化。Akt憐酸 化是细胞中PI3K活性的量度。使THP-I细胞(人单核细胞系)饥饿过夜W耗尽pAkt水平。用 CSF-I刺激5分钟导致PI3Ka/WS诱导的苏氨酸308和丝氨酸473位点上Akt的憐酸化。固定细 胞，染色胞内地OS地oAkt (Ser473)，然后使用抓FACS化1 ibur?细胞计数器分析。运是细胞 IA类PI3K抑制的测量值。化合物1在本试验中具有〉9.7咖的ICso,显示于IA类PI3KS的选择 性。参见表4。
[011引实施例7.人B细胞增殖试验
[0119] B细胞的发育和活性高度依赖于PI3KSJI3K 丫通过B细胞受体(BCR)复合物在信号 传导过程中具有必需和非多余的作用。IgM诱导的Ca+流入和增殖在缺乏PI3K-S或使用 PI3K-S抑制剂的小鼠中减弱。PI3K 丫在任何B细胞活性中都不起作用。BCR复合物对PI3K 丫 的特异性使得它成为用于评价PI3K 丫在细胞中抑制作用程度的理想的PI3K 丫试验。在测试 化合物的存在下用抗-IgM刺激纯化的人B细胞。4天后，使用cell titer-glo测量细胞存活 率/增殖率，W便测定各孔中细胞的ATP含量。增殖缺乏或减少是PI3K 丫抑制作用程度的测 量值。化合物1具有3.05 ± 0.44iiM的ICso，显示11-倍于PI3K-S的选择性窗。参见表4。
[0120] 实施例8. HUVEC增殖试验
[0121] PI3KS是调节细胞存活、生长和细胞周期进入的众多生长因子下游的重要信号传 导分子。PI3K-Q和PI3K-0同工型调节细胞周期进入;抑制任一同工型导致细胞生长下降。 HUVECs是表达PI3Ka和PI3邸同工型的初级人厮静脉内皮细胞。抑制PI3Ka或PI3邮同工型任 一种或它们两者将抑制HUVECs细胞生长。将化合物在HUVECs上铺展，化合物处理后96小时， 使用cell titer-glo测量细胞增殖率/存活率，W便测定各孔中细胞的ATP含量。增殖缺乏 或减少是PI3Ka和/或PI3邮抑制作用程度的巧慢值。化合物1在本试验中具有〉19iiM的ICso, 显示>74-倍于PI3Ka/e的选择性。参见表4。
[0122] 实施例9.MCF-7增殖试验
[0123] PUK-Akt信号传导途经调节许多正常细胞过程，包括细胞增殖、存活和生长，它们 对于肿瘤发生而言是关键的。PI3K信号传导途经失调通常发生在人癌中。MCF7是人乳腺癌 细胞系，其在PllOa蛋白的螺旋结构域中具有活化E545K PI3Ka杂合突变，导致PI3K-Q途径 活动过度。抑制MC巧细胞中的PI3K-0信号传导抑制细胞生长且由此可W在MC巧增殖试验中 评价PI3K-Q抑制剂。将化合物加入到MCF7细胞中，化合物处理后96小时，使用cell titer-glo测量细胞增殖率/存活率，W便测定各孔中细胞的ATP含量。增殖缺乏或减少是PI3Ka抑 制作用程度的测量值。化合物1在本试验中具有的ICso,由此显示>67-倍于PI3Ka的选 择性。参见表4。
[0124] 如上所述，化合物1具有极佳的效能，在PI3K 丫相关细胞试验中为0.2扣M;在基于 细胞的试验中具有12-倍于PI3K-S的选择性;和40-80倍于PI3Ka和PI3K0的选择性。
[0125] 表4.化合物1在PI3Ka/%/S依赖性体外试验中的效能 [01261
[0127] * 每个试验数据(山〇-〉20. >20，19.8
[0128] ** 每个试验数据(iiM)-15.7，>20，18，17
[0129] 药物代谢
[0130] 实施例10.重组CYP酶导致的化合物1代谢
[0131] 包含重组CYP酶化￥?142、286、2〔8、2〔9、2(：19、206、261和344)的微粒体用于测定该 CYP催化化合物1的氧化。因此，将化合物1 (化1)与各重组CYPs在辅因子NADPH的存在下一起 溫育。通过LC-MS/MS测定溫育期结束时剩余的母体药物百分比并且与开始时存在的百分比 比较。结果如表5中所示。尽管是W低表观率，但是仅在与CYP3A4-起溫育中检测到化合物1 的代谢。
[0132] 表5.化合物1与重组CYP酶一起溫育的稳定性*
[01331
[0134] *数据表示为平均值(SD)
[0135] 实施例11.化合物1对CYP酶的抑制
[0136] 评价人肝微粒体中化合物1(0.01-100咖)可逆地抑制〔￥?酶(〔￥?142、286、2〔8、 2C9、2C19、2D6和3A4)的潜能。抑制试验W特定底物浓度(接近其解离常数化m)值)使用针对 每种CYP酶的选择性CYP探针进行。数据如表6中所示。化合物1是CYP1A2JB6和2C8的中度抑 制剂；ICsq值为4-7測。
[0137] 表6.化合物1对在人肝微粒体中的CYP酶的抑制 [013 引
[0139 ]还在人肝微粒体中采用I Cso转移试验评价使用化合物1对CYP3A4的时间依赖性抑 审IJ。在本研究中，将0.1-SOiiM的化合物1与人肝微粒体在NADPH的存在下和它不存在下一起 预溫育0和30分钟。然后用缓冲液将溫育体系稀释10-倍并且测定剩余CYP3A4(睾酬-6-0-径 化酶)活性，历时10分钟期限。在NADPH的存在下或其不存在下化合物1的ICs诚有显著性改 变(ICsq变化=1)。
[0140] 运一结果在追踪研究中得到验证，其中在与10或SOiiM化合物1 一起预溫育后评价 人肝微粒体中的CYP3A4时间-依赖性抑制，历时期限为0、5、10、15和30分钟。本研究中，在两 种浓度下，与阳性对照米非司酬的Kobs = 0.053/min相比，观察到的CYP3A4活性缺失的速率 常数化Obs)为0.0039/min。来自运些研究的两个结果的数据显示化合物1不W时间依赖性 方式抑制CYP3A4。
[0141] 实施例12.酶诱导
[0142] 在为人肝癌细胞系的DPX2细胞中Wo . l-30iiM的6个浓度评价化合物1活化孕烧-X 受体(PXR)的潜能，该细胞系中人P邸基因和连接至人CYP3A4基因的两个启动子的巧光素酶 报道基因被稳定地超表达。将利福平用作阳性对照，化合物1显示得到应答的显著活化水 平，其为具有EC50值〉30iiM的阳性对照的5%。
[0143] 还评价了在肝细胞中化合物1诱导CYP1A2和CYP3A4的潜能。将0.1-30iiM的化合物1 与培养的冷藏保存的来自3个不同供体的初级人肝细胞一起