混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法
【专利摘要】本发明涉及降压肽的制备方法技术领域，具体涉及一种中华鳖通过混合酶解?膜过滤的方法制备降压肽，主要包括原料预处理、混合酶水解、灭酶、离心过滤、膜过滤、冻干等关键步骤，其中混合酶水解过程中混合酶的各配方质量百分数为：木瓜蛋白酶39?44％、中性蛋白酶28?33％、胰蛋白酶24?28％。采用本发明混合酶水解方法制备，酶利用高，中华鳖降压肽转化率高，中华鳖降压肽的抑制率也较高，同时混合酶水解和膜过滤两个过程可以采用连续式进行，达到连续化的操作，易于工业化生产，提高生产效率。
【专利说明】
混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及降压肽的制备方法技术领域，具体涉及一种混合酶解-膜过滤制备中 华鳖降压肽的方法。
【背景技术】
[0002] 中华鳖(Pelodiscus sinensis)俗称甲鱼、团鱼，主要产于中国、日本及东南亚等 国家和地区，中华鳖养殖业是我国淡水产养殖业的重要组成部分，也是水产养殖业中经济 效益较高的养殖种类。中医药学认为，中华鳖有滋阳凉血、益肾壮阳、清热散结、益气健胃功 效，中华鳖的肉、血、卵、胆、脂肪、甲、尿均可入药，适用于骨蒸劳热、久疟久痢、脱肛等疾病。 中华鳖是传统的健康养生食品，经常食用有延年益寿功效，深得广大消费者的青睐。
[0003] 血压是血液在血管内流动时对血管壁所施加的压力，高血压病是一种动脉血管压 力升高的慢性疾病，它最大的危害在于对全身血管造成长期超极限的额外压力，导致血管 的脆性损伤，最终引起血管的破裂、堵塞，各种心脑血管疾病、肾脏病、眼底疾病、神经系统 疾病等都可由它引起，高血压病是导致中老年人死亡的罪魁祸首之一。据国际高血压学会 发表的新闻公报(2009年），全球大约有9.72亿人患高血压或血压偏高症，相当于世界成年 (18周岁以上)人口的26.4%，中国成人高血压患病率为25.2%，其高患病率、致死率严重威 胁着人类的健康。
[0004] 降压肽最早是1965年由Ferriera首次从南美洲蝮蛇的毒液中发现。研究者证明， 血管紧张素转换酶(Angiotensin I-converting enzyme，ACE)通过对肾素-血管紧张素-醛 固酮系统（ReninAngiotensin System，RAS)和血管舒缓激肽-激肽-前列腺素系统 (Bradykinin Kinin System，BKS)的控制实现对人体血压进行调节，其生理过程如图1所 不。
[0005] ACE抑制剂(ACEI)的作用是通过抑制ACE的活性，使血管紧张素II的生成和激肽的 破坏均减少，从而达到降低血压的目的。ACEI属于竞争性抑制剂，作用于ACE的活性区域，它 们与ACE的亲和力比血管紧张素I或舒缓激肽更强，而且也不易从ACE结合区释放，使得ACE 失去其原有的活性，从而阻碍ACE催化水解舒缓激肽和血管紧张素I转化为血管紧张素n两 种生化反应过程，起到降血压的作用。
[0006] 目前，生物活性肽生产常用的方法有四种：（1)化学合成法、（2)酶解法、（3)重组 DNA技术、（4)发酵法。化学合成法广泛应用于生产高价值的中长肽缺点是成本高，而且在 合成过程中可能产生对健康和环境有害的物质;重组DNA技术也被广泛应用，但这种方法需 要昂贵的材料和设备，投资大，成本高，其安全性还需进一步检测，且多限于多肽的生产，而 生物活性肽大都是短肽，所以重组DNA技术在这方面的应用是有限的;发酵法是选取微生物 菌种进行发酵，在发酵过程中产生具有活性的肽序列，该方法生产活性肽安全易操作，但生 产时间较长，该法在乳源性活性肽生产方面应用较多;酶法生产活性肽则有许多优点，该法 可生产大量短肽，反应条件温和反应过程易于控制，生产时间短，且所用试剂和原料均是食 品级的，安全性高。因此，活性肽的研究和生产主要采用酶解的方法进行。
[0007] 然而传统酶法制备ACE抑制肽存在酶利用率不高、底物过度降解，以及操作不具备 连续性等问题，而采用混合酶法-膜过滤使反应尽可能向产物方向进行，因而得到比传统制 取工艺更高的转化率，从而制备中华鳖降压肽。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是:针对现有技术的上述不足，提供一种混合酶解-膜 过滤制备中华鳖降压肽的方法，该方法酶利用率高，混合酶有效提高了中华鳖降压肽转化 率，同时制备出的中华鳖降压肽抑制作用也得到了提高。
[0009] 本发明所采取的技术方案是:一种混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法，该 方法包括以下步骤：
[0010] (1)原料预处理:将中华鳖肉绞成肉糜，并加肉糜质量1-10倍的水匀浆，得到以中 华鳖肉泥作为底物的底物溶液备用；
[0011] (2)混合酶水解:将步骤(1)制得的底物溶液置于温度50-60°C水浴中，调节底物溶 液PH8-9.5，加混合酶搅拌酶解2-3小时，得酶解液；
[0012] (3)灭酶:将步骤(2)中的酶解液在95-100°C下持续15-20min灭酶处理，得到灭酶 后的混合液体；
[0013] (4)离心过滤：将上述步骤（3)得到的液体，采用4500-5000r/min转速离心10- 30min，得上清液；
[0014] (5)膜过滤：调步骤(4)的上清液pH 7-7 ? 5，并在压力0 ? 2-0 ? 25MPa、温度20-30 °C条 件下，经超滤膜或纳滤膜超滤，收集分子量小于l〇〇〇Da的超滤液；
[0015] (6)冻干:将步骤(5)中的超滤液进行冷冻干燥，即得到中华鳖降压肽。
[0016] 所述混合酶水解和膜过滤过程可以同时连续进行的，连续操作的具体装置设计如 图2所示，其中膜过滤组件包括调节pH、纳滤脱盐等步骤，同时在产品出口处截留的分子量 大的部分还可以回到原料液进行再次酶解，提高生产效率。
[0017] 作为优选，步骤(2)中混合酶的各配方质量百分数如下:木瓜蛋白酶39-44%、中性 蛋白酶28-33%、胰蛋白酶24-28%，因为ACE是小分子肽，通过混合酶的酶解作用更有利于 获得小分子的短肽，混合酶的同时加入起到加快水解长链得到短肽的目的，同时混合酶生 产出来的ACE抑制酶的活性较高。
[0018]作为优选，步骤(2)中将底物溶液加水调节质量分数为4-8%，混合酶加入量为底 物总质量的1-3 %，单个酶只能水解底物的某一部位，所以对于水解来说利用率不高，而混 合酶同时切入的位点多，有利于得到较多的小片段肽，此时酶的水解作用最充分，水解能力 最高，而且三种酶的利用率因其相互促进和协调也得到提升。
[0019] 步骤(3)中酶解液在95-100 °C下持续15-20min进行灭酶处理，使灭酶过程更彻底。
[0020] 作为优选，在所述步骤(5)膜过滤之前，将步骤(4)得到的上清液中加水使其多肽 浓度为2-3%，因为随着酶解作用的进行，溶液中多肽浓度逐渐升高，稀释上清液有利于在 膜过滤中减小膜承受的压力，防止膜通道的堵塞，有利于后续的膜分离。
[0021] 作为优选，所述步骤(5)得到超滤液后还包括纳滤脱盐:将步骤(5)得到的超滤液 加水调节使其多肽浓度为2-3%，并在压力0.5-0.6MPa、温度20-30°C的条件下纳滤脱盐。因 为在调整pH过程加入酸或碱导致溶液中有盐类物质残留，且酶解后有部分离子产生，纳滤 脱盐步骤能够将脱盐和短肽的过滤浓缩同步进行，对低分子量降压肽和盐的分离有很好效 果。优选当分子量5000Da左右的物质较多时，采用超滤膜过滤，然后再经过纳滤膜超滤；当 分子量在l〇〇〇Da左右的物质较多时，直接采用纳滤膜超滤。
[0022] 采用以上制备方法后，本发明的一种混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法 与现有技术相比具有以下优点：
[0023] 1.本发明采用混合酶水解的制备方法，提高了中华鳖降压肽的抑制率，混合酶水 解方法制备的降压肽转化率也较高，利用混合酶可生产大量短肽，反应条件温和、易于控 制，所得广品品质好；
[0024] 2.膜过滤组件的过滤过程兼具分离、浓缩、纯化和精制的功能，通过膜过滤的方法 有效分离出小分子物质中华鳖降压肽，同时纳滤脱盐步骤提高最终降压肽产品的纯度，不 仅使得降压肽品质更好，而且最终产品的得率也有所提高；
[0025] 3.所述混合酶水解和膜过滤过程可以同时连续进行，连续操作的具体装置设计如 图2所示，截留的分子量大的部分还可以回到原料液进行再次酶解。将混合酶水解和膜过滤 两个过程可以采用连续的方式进行，达到连续化的操作，易于工业化生产，提高生产效率， 采用混合酶水解-膜过滤连续进行，由于产物也是连续采出，而使反应尽可能向产物方向进 行，因而得到比传统制取工艺更高的转化率。同时可以回收部分原料继续水解，有利于节约 材料。
【附图说明】
[0026] 图1是本发明的ACE在肾素-血管紧张素和舒缓激肽-激肽系统中的作用示意图。
[0027] 图2是本发明的混和酶-膜过滤连续操作的示意图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步说明。
[0029] 实施例1
[0030] -种中华鳖降压肽的制备方法，具体步骤如下：
[0031] (1)原料预处理：先将中华鳖宰杀后，除去脂肪，再用开水烫15秒，去除中华鳖皮 膜，去除中华鳖的内脏、骨、壳清洗干净;将得到的中华鳖肉组织采用高速组织捣碎机进行 搅碎处理，并加5倍的水匀浆后备用；
[0032] (2)混合酶解:加水调节（1)中底物溶液的质量分数为4%，在50°C的水浴锅中，调 节pH为8，加入底物总质量1 %的混合酶，搅拌酶解2小时，得酶解液，其中混合酶各配方质量 百分数:木瓜蛋白酶39 %、中性蛋白酶33 %、胰蛋白酶28 % ;
[0033] (3)灭酶:95°C下持续20分钟进行灭酶处理；
[0034] (4)离心过滤：将灭酶后的液体，4500r/min转速离心30分钟，得到的上清液，加水 调节使酶解液中的多肽浓度为2%，待膜过滤；
[0035] (5)膜过滤：上述调整多肽浓度后的酶解液在压力0.2MPa、pH 7、温度20°C条件下 微滤膜过滤，收集超滤液，加水调节超滤后的酶解液中多肽浓度为2 %，并在压力0.5MPa、温 度20°C的条件下纳滤脱盐，得到分子质量在lOOODa以下的产物；
[0036] (6)冻干:将(5)最后得到的液体进行冷冻干燥，即可得到降压肽的产品。
[0037] 实施例2
[0038] -种中华鳖降压肽的制备方法，具体步骤如下：
[0039] (1)原料预处理：先将中华鳖宰杀后，除去脂肪，再用开水烫20秒，去除中华鳖皮 膜，去除中华鳖的内脏、骨、壳清洗干净;将得到的中华鳖肉组织采用高速组织捣碎机进行 搅碎处理，并加10倍的水匀浆后备用；
[0040] (2)混合酶解:加水调节（1)中底物溶液的质量分数为6%，在55°C的水浴锅中，调 节pH为9，加入底物总质量2 %的混合酶，搅拌酶解2小时，得酶解液，其中混合酶各配方质 量百分数:木瓜蛋白酶42 %、中性蛋白酶30 %、胰蛋白酶28 % ;
[0041 ] (3)灭酶：100°C下持续15分钟进行灭酶处理；
[0042] (4)离心过滤:将灭酶后的液体，5000r/min转速离心10分钟，得到的上清液，加水 调节使酶解液中的多肽浓度为2.5%，待膜过滤；
[0043] (5)膜过滤:上述调整多肽浓度后的酶解液在压力0? 25MPa、pH 7? 5、温度25°C条件 下微滤膜过滤，收集超滤液，加水调节超滤后的酶解液中多肽浓度为2.5%，并在压力 0.6MPa、温度25°C的条件下纳滤脱盐，得到分子质量在lOOODa以下的产物；
[0044] (6)冻干:将(5)最后得到的液体进行冷冻干燥，即可得到降压肽的产品。
[0045] 实施例3
[0046] -种中华鳖降压肽的制备方法，具体步骤如下：
[0047] (1)原料预处理：先将中华鳖宰杀后，除去脂肪，再用开水烫30秒，去除中华鳖皮 膜，去除中华鳖的内脏、骨、壳清洗干净;将得到的中华鳖肉组织采用高速组织捣碎机进行 搅碎处理，并加3倍的水匀浆后备用；
[0048] (2)混合酶解:加水调节（1)中底物溶液的质量分数为8%，在60°C的水浴锅中，调 节pH为9.5，加入底物总质量3 %的混合酶，搅拌酶解3小时，得酶解液，其中混合酶各配方质 量百分数:木瓜蛋白酶44 %、中性蛋白酶32 %、胰蛋白酶24 % ;
[0049] (3)灭酶：100°C下持续15分钟进行灭酶处理；
[0050] (4)离心过滤：将灭酶后的液体，5000r/min转速离心30分钟，得到的上清液，加水 调节使酶解液中的多肽浓度为3%，待膜过滤；
[00511 (5)膜过滤:上述调整多肽浓度后的酶解液在压力0? 25MPa、pH 7? 5、温度30°C条件 下微滤膜过滤，收集超滤液，加水调节超滤后的酶解液中多肽浓度为3 %，并在压力0.6MPa、 温度30°C的条件下纳滤脱盐，得到分子质量在lOOODa以下的产物；
[0052] (6)冻干:将(5)最后得到的液体进行冷冻干燥，即可得到降压肽的产品。
[0053] 实施例4
[0054] (1)原料预处理：先将中华鳖宰杀后，除去脂肪，再用开水烫30秒，去除中华鳖皮 膜，去除中华鳖的内脏、骨、壳清洗干净;将得到的中华鳖肉组织采用高速组织捣碎机进行 搅碎处理，并加6倍的水匀浆后备用；
[0055] (2)混合酶解:加水调节（1)中底物溶液的质量分数为5%，在55°C的水浴锅中，调 节pH为9，加入底物总质量3 %的混合酶，搅拌酶解3小时，得酶解液，其中混合酶各配方质量 百分数:木瓜蛋白酶44 %、中性蛋白酶28 %、胰蛋白酶28 % ;
[0056] (3)灭酶：100°C下持续20分钟进行灭酶处理；
[0057] (4)离心过滤：将灭酶后的液体，4500r/min转速离心25分钟，得到的上清液，加水 调节使酶解液中的多肽浓度为2%，待膜过滤；
[0058] (5)膜过滤:上述调整多肽浓度后的酶解液在压力0? 25MPa、pH 7? 5、温度28°C条件 下微滤膜过滤，收集超滤液，加水调节超滤后的酶解液中多肽浓度为2 %，并在压力0.6MPa、 温度25°C的条件下纳滤脱盐，得到分子质量在lOOODa以下的产物；
[0059] (6)冻干:将(5)最后得到的液体进行冷冻干燥，即可得到降压肽的产品。
[0060] 下面通过相关的试验验证本发明混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法的效 果。
[0061] 1.混合酶的优化实验
[0062]为了进一步说明混合酶的效果，混合酶比采用scheffe多项式模型建立混料的配 比得回归方程的方法:表1列出了采用混料设计进行混合酶研究的试验方案、试验结果及其 预测值，如表1所示，对响应值进行Scheffe多项式(不完全三次式)拟合分析，得回归模型方 程：I = 0 ? 43Xi+0 ? 33X2+0 ? 31X3+0 ? 39XiX2+0 ? 35XiX2+0 ? 36X2X3+3 ? 02X1X2X3，其中Xi表示木瓜蛋 白酶的质量百分比，X2表示中性蛋白酶的质量百分比，X3表示胰蛋白酶的质量百分比。经分 析，得到最优的配方为:Xi = 39%、X2 = 33%、X3 = 28%，即实施例1中的混合酶配方。
[0063] 表1混合酶的scheffe多项式模型分析表
[0065] 2 ?对照试验
[0066] 混合酶法连续制备的降压肽与单一酶(试剂推荐条件:木瓜蛋白酶，60°C，pH 7.0; 中性蛋白酶45 °C，pH 7.0;胰蛋白酶pH 7.5，45 °C )方法制备的降压肽对血管紧张素转换酶 抑制作用的对照试验:本发明混合酶法采用上述实施例1中的试验条件，单一酶法除pH和温 度采用酶推荐条件外，其它条件与采用混合酶水解法相同。对照试验结果如表2所示，很明 显，混合酶比单一酶生产出的降压肽抑制率提高4.43-20.86%。
[0067] 表2采用不同酶水解方法制备的降压肽抑制率
[0069]以上就本发明较佳的实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发 明不仅局限于以上实施例，其具体方案允许有变化，凡在本发明独立要求的保护范围内所 作的各种变化均在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法，该方法包括以下步骤： (1) 原料预处理:将中华鳖肉绞成肉糜，并加肉糜质量1-10倍的水匀浆，得到以中华鳖 肉糜作为底物的底物溶液备用； (2) 混合酶水解:将步骤（1)制得的底物溶液置于温度50-60°C水浴中，调节底物溶液 PH8-9.5，加混合酶搅拌酶解2-3小时，得酶解液； (3) 灭酶:将步骤(2)中的酶解液在95-100 °C下持续15-20分钟灭酶处理，得到灭酶后的 混合液体； (4) 离心过滤：将上述步骤(3)得到的液体，采用4500-5000r/min转速离心10-30分钟， 得上清液； (5) 膜过滤:调步骤(4)的上清液pH 7-7 · 5，并在压力0 · 2-0 · 25MPa、温度20-30 °C条件下 经超滤膜或纳滤膜超滤，收集分子量小于l〇〇〇Da的超滤液； (6) 冻干:将步骤(5)中的超滤液进行冷冻干燥，即得到中华鳖降压肽。2. 根据权利要求1所述的混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法，其特征在于:所 述步骤(2)中混合酶的各配方质量百分数如下：木瓜蛋白酶39-44%、中性蛋白酶28-33%、 胰蛋白酶24-28 %。3. 根据权利要求1所述的混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法，其特征在于:所 述步骤(2)中底物溶液加水调节使底物的质量分数为4-8 %，混合酶加入量为底物总质量的 卜3%〇4. 根据权利要求1所述的混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法，其特征在于:在 所述步骤(5)膜过滤之前，将步骤(4)得到的上清液中加水使其多肽浓度为2-3%。5. 根据权利要求1所述的混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法，其特征在于:所 述步骤(5)得到超滤液后还包括纳滤脱盐:将步骤(5)得到的超滤液加水调节使其多肽浓度 为2-3%，并在压力0.5-0.6MPa、温度20-30°C的条件下纳滤脱盐。
【文档编号】C07K1/34GK105821108SQ201610298693
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】杨华, 张慧恩, 戚向阳, 陈世达
【申请人】浙江万里学院