一种酶法生产大元环糊精的方法
【专利摘要】本发明公开了一种酶法生产大元环糊精的方法，属于环糊精生产技术领域。本发明是利用4?α?糖基转移酶以天然淀粉为底物生产大元环糊精，填补了该技术领域内的空白，为大元环糊精大规模的生物法生产奠定了基础；本发明方法总的反应周期短，只需要12小时；具有生产成本低、产品纯度高、工艺流程简单、生产周期短等诸多优点。
【专利说明】
一种酶法生产大元环糊精的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种酶法生产大元环糊精的方法，属于环糊精生产技术领域。
【背景技术】
[0002] 环糊精(cyclodextrin，CD)是由不同数量的α-l，4糖苷键连接而成的环状糊精，常 见的是α-环糊精、β-环糊精和γ -环糊精，其聚合度分别为6、7、8;而大元环糊精 (Cycloamylose，大元环糊精），是指聚合度从9至几百不等的环状糊精，也被称为大环-环糊 精。
[0003] 由于大元环糊精的聚合度较高，且粘度低、水溶性好、并不易回生，其在结构与性 质上区别于低聚合度的α-、β_和γ-环糊精。常见的环糊精形成类似于桶状的空腔结构，聚 合度较小的大元环糊精形成一个独立的环；当大元环糊精聚合度较大时，成环的情况复杂， 其大小和结构差异较大，当大元环糊精聚合度上升到一定程度时，会形成两个环状的疏水 空腔结构。大元环糊精具有大小不一、结构各异的疏水空腔，这些疏水通道类似于直链淀粉 分子的V-型螺旋通道。大元环糊精的环状结构可以随着客体分子、溶剂的变化发生改变，存 在不稳定性和多变性，可用于包合成分复杂、分子大小各异的混合物。常见的α-、β_和γ-环 糊精在大量使用时具有一定的毒性，使其在相关领域的应用受到限制。而目前的研究报道， 还没有发现大元环糊精的毒性。因此，大元环糊精在生物、食品、医药、化学工业等领域前景 可观。
[0004] 大元环糊精制作成本高，价格昂贵，其制备方法主要包括酶法合成和化学合成。 Wakao等以麦芽三糖为初始反应底物，通过邻二酰桥分子固定技术，经过26步，合成聚合度 为9的大元环糊精，但是糖类物质的结构复杂性抑制了化学法合成大元环糊精的发展。目前 尚未有利用4-α-糖基转移酶酶法合成单一聚合度大元环糊精的报道，也没有能与大元环糊 精混合物中的单一聚合度大元环糊精特异性结晶沉淀的有机溶剂。Terada Υ等成功重组表 达了来自Thermus aquaticus ATCC 33923的4-α-糖基转移酶基因，证并以〇.〇2%(w/v)的 合成直链淀粉为底物制备大元环糊精，转化率在90%左右;许燕等利用该酶并以1 % (w/v) 的高直链玉米淀粉为底物，经异淀粉酶脱支预处理后，将大元环糊精转化率由24.6%提高 到45.6%。目前酶法制备大元环糊精主要问题在于:一、用于制备大元环糊精的4-α-糖基转 移酶的报道并不多，主要集中在重组表达新的基因，并研究其酶学性质和晶体结构方面，关 于其应用研究较少，且酶的重组表达量有待提高；二、缺少大元环糊精相应的生产工艺，底 物直链淀粉价格昂贵，天然淀粉为底物制备大元环糊精转化率较低。
【发明内容】
[0005] 本发明所解决的技术问题是提供了一种生物法生产大元环糊精的工艺，降低了大 元环糊精的生产成本。
[0006] 本发明采用4-α-糖基转移酶生产大元环糊精，（1)按照1 %-1〇%的浓度进行淀粉 调浆，在70°C条件下搅拌10-15分钟；（2)设定反应温度65-70°C，调ρΗ5.0-7.0，以每克淀粉 计，分别加入30-70个单位的4-α-糖基转移酶、30-70个单位的普鲁兰酶，反应12小时左右； (3)采用无水乙醇沉淀方法得到大元环糊精。所述淀粉为马铃薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述4-α-糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，步骤（1)按照的浓度进行淀粉调浆，并按照 每克淀粉〇. 25个单位的比例加入4-α-糖基转移酶，在70 °C条件下搅拌10-15分钟。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，步骤(1)按照1%的浓度进行淀粉调浆。
[0010]在本发明的一种实施方式中，步骤(2)设定反应温度65°C。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，步骤(2)调pH5.5。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，步骤(2)以每克淀粉计，分别加入50个单位的4-α-糖 基转移酶、50个单位的普鲁兰酶。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，步骤(3)采用无水乙醇沉淀方法得到大元环糊精的 步骤是待反应结束后，取酶反应液上清，加入8-10倍体积的无水乙醇，离心得到无水乙醇与 大元环糊精形成的络合物沉淀，将得到的沉淀于60°C烘箱中放置过夜，即得大元环糊精结 晶。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述4-α-糖基转移酶的制备是在一定培养条件下， 通过微生物发酵一定时间，得到发酵液，发酵液经过离心得到菌体，菌体复溶后经超声破碎 得到4-α-糖基转移酶粗酶液。
[0015] 本发明是根据4-α-糖基转移酶以及产物大元环糊精的特点生产大元环糊精的工 艺，相对于现有技术，具有以下优点：
[0016] 1)提供一种低成本的以天然淀粉为底物的大元环糊精的生产方法，填补了该技术 领域内的空白，为大元环糊精大规模的生物法生产奠定了基础；
[0017] 2)本反应总的反应周期短，只需要12小时；
[0018] 总体来讲，本发明具有生产成本低、产品纯度高、工艺流程简单、生产周期短等诸 多优点。
【具体实施方式】
[0019] 4-α-糖基转移酶活力的测定法:分别取0 · 25mL的0 · 5 %的可溶性淀粉溶液、0 · 05mL 的1%麦芽糖溶液和〇.6mL 50mM pH 5.5的Na2HP〇4_柠檬酸缓冲液于试管中，70°C水浴预热 lOmin。加入0. lmL稀释的酶液，震荡混勾，70°C反应lOmin，沸水浴15min终止反应。向上述反 应体系中加入10mL碘液(0.2%ΚΙ+0.02% 12)，混匀，在620nm下测量其吸光值。酶活单位定 义:在酶活测量体系下，每分钟降解lmg/ml淀粉所需的酶量。
[0020]大元环糊精的分析采用高效液相色谱法色谱条件：日立Hitachi色谱仪， SuperMultipore Pff-N(6.0mm X 150臟)凝胶色谱柱，日立1^-2490不差检测器，流动相0.05111]\1 pH 7. ONa2HP〇4_柠檬酸缓冲液，流速0.3mL/min;柱温设定为50 °C。处理样品时，沸水浴30min 灭酶，在反应液中按照每克淀粉50个单位的比例加入Rhizopus sp .来源的糖化酶、 Thermobifida fusca来源的异淀粉酶和Bacillus deramificans来源的普鲁兰酶，充分混 匀后在40°C水浴摇床中反应10h;反应结束后，沸水浴30min灭酶，将反应液12000r/min离心 1 Omin，取上清，经过滤膜过滤(0.45μπι)后用HPLC分析。
[0021]实施例1 4-α-糖基转移酶突变体的制备及表达
[0022] 根据NCBI上的TaAM氨基酸序列（NCBI编号：GI:6225654)，设计引物，以购买的 Thermus aquaticus ATCC 33923基因组为模板，通过PCR扩增获得TaAM基因片段。
[0023] 正向引物：5' -GGGTTTCATATGGAGCTTCCCCGCGCTTTC-37，
[0024] 反向引物：5' -CGGCCGGAATTCCTAGAGCCGTTCCGTGGC-37，
[0025] PCR反应体系均为：5XPS buffer 10yL，dNTPs Mix(2.5mM)4yL，正向引物（ΙΟμΜ) 〇.5yL，反向引物（10μΜ)0·5μL，模板DNA lyL，DNA Polymerase 0.5yL，加入双蒸水至50yL〇
[0026] PCR 扩增条件为：94°C 预变性 4min;随后 30 个循环(98°C10s，55°C5s，72°C120s);72 °〇继续延伸lOmin。
[0027] 用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET24a( + )。将pET24a( + )质粒和TaAM基因分 别进行Nde I和Hind III双酶切，酶切产物经胶回收后，用T4连接酶连接过夜，连接产物转 化至大肠杆菌JM109感受态细胞，转化产物涂布于含lOOmg/l卡那霉素的LB平板，经37°C培 养过夜，平板上挑取3个单菌落，接入LB液体培养基，8h后抽提质粒验证，结果正确，得到富 集的TaAM/pET24a( + )质粒。
[0028] 根据Thermus aquaticus ATCC 33923的4-α-糖基转移酶的基因序列，设计并合成 引入Υ54突变的引物，对4-α-糖基转移酶基因进行定点突变，测定DNA编码序列。将突变体基 因置于适当的表达载体并导入大肠杆菌中进行表达，得到氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示 单突变4-α-糖基转移酶。单突变Y54G的定点突变：利用快速PCR技术，以表达载体TaAM/ pET24a( + )为模板。
[0029]引入Y54突变的定点突变引物为：
[0030]正向引物：57 -GGCCCCACGGGCGGTGGCGACTCCCCCTAC-37 (下划线为突变碱基），
[0031] 反向引物 W -GGGGGAGTCGCCACCGCCCGTGGGGCCCAA-37 (下划线为突变碱基），
[0032] PCR反应体系为：5XPS buffer 10yL，dNTPs Mix(2.5mM)4yL，正向引物（10μΜ)0·5 yL，反向引物（10μΜ)0·5μL，模板DNA 0.5yL，DNA Ploymerase 0.5yL，加入双蒸水至50yL〇
[0033] PCR 扩增条件为:94°C 预变性 4min;随后 30 个循环(98°C10s，55°C5s，72°C7min);72 °〇继续延伸10min。
[0034] PCR产物经Dpnl消化，转化大肠杆菌JM109感受态，感受态细胞在LB固体培养基(含 100mg/L氨节青霉素)培养过夜后，挑克隆于LB液体培养基(含100mg/L氨节青霉素）中培养 后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
[0035]将重组菌接种于LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)生长8h，按5 %接种量将种子 接入TB液体发酵培养基(含100mg/L卡那霉素）。大肠杆菌在37°C培养2h后，加入0.2mM终浓 度的IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)进行诱导，并在30°C摇床继续培养发酵24h后，将一定 体积发酵液于4°C、12000r · mirT1离心10min去上清液，收集菌体，菌体沉淀用50mmol · L一 bH 7. ONa2HP〇4_NaH2P〇4缓冲液重新悬浮，混匀。用超声波细胞粉碎机破碎菌体悬浮液的细 胞壁(超声细胞破碎机的工作条件：φ6工作探头，工作时间5min，工作3s停3s，工作功率为 20 % )，然后12000r · mirT1离心10min，离心后上清即为发酵胞内粗酶液，经测定，酶活为 120U/mL〇 [0036] 实施例2 [0037] (1)原料预处理：
[0038]按照1%的浓度进行马铃薯淀粉调浆，在70°C条件下搅拌10-15分钟，使淀粉颗粒 充分溶胀；
[0039] (2)酶法生产工艺：
[0040]预处理后将温度设定为65°C，调pH5.5后，按照每克淀粉50个单位的比例分别加入 4-α-糖基转移酶和普鲁兰酶，充分反应12小时。沸水浴30min灭酶，在反应液中按照每克淀 粉50个单位的比例加入Rhizopus sp.来源的糖化酶、Thermobifida fusca来源的异淀粉酶 和Bacillus (^瓜1111;1^〇3118来源的普鲁兰酶，充分混勾后在40<€水浴摇床中反应1011;反应 结束后，沸水浴30min灭酶，将反应液12000r/min离心10min，取上清，经过滤膜过滤(0.45μ m)后用HPLC分析。结果表明，大元环糊精的转化率(生成的大元环糊精质量/淀粉底物质量 X 100%)达到43.2%。
[00411 待反应结束后，取酶反应上清，加入10倍体积无水乙醇，12000r/min离心10min得 到无水乙醇与大元环糊精形成的络合物沉淀，弃上清后将得到的沉淀于60°C烘箱中放置过 夜，即得大元环糊精结晶，纯度达到94%。
[0042] 实施例3 [0043] (1)原料预处理：
[0044]按照5%的浓度进行马铃薯淀粉调浆，按照每克淀粉0.25个单位的比例加入4-α-糖基转移酶在70°C条件下搅拌10-15分钟，使淀粉颗粒充分溶胀；
[0045] (2)酶法生产工艺：同实施例2
[0046] 结果表明，大元环糊精的转化率达到29.6%。
[0047] 实施例4
[0048] (2)原料预处理：
[0049] 按照5%的浓度进行马铃薯淀粉调浆，按照每克淀粉1个单位的比例加入4-α-糖基 转移酶在70°C条件下搅拌10-15分钟，使淀粉颗粒充分溶胀；
[0050] (2)酶法生产工艺：同实施例2
[0051 ]结果表明，大元环糊精的转化率达到22.3%。
[0052] 实施例5
[0053]在实施例2的基础上，将步骤(2)体系pH调为7-9时，大元环糊精的转化率下降32.5 ~70%〇
[0054] 实施例6
[0055] 在实施例2的基础上，将步骤(2)中4-α-糖基转移酶的用量调整为每克淀粉80个单 位的4-α-糖基转移酶，大元环糊精的转化率下降12%。
[0056] 实施例7
[0057]在实施例2的基础上，将步骤(2)中反应温度调整为55°C时，大元环糊精的转化率 下降47.2%。
[0058]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种生产大元环糊精的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)按照的浓度进行淀粉调浆，在70°C条件下搅拌10-15分钟；（2)设定反应温 度65-70°C，调pH5.0-7.0，以每克淀粉计，分别加入30-70个单位的4-α-糖基转移酶、30-70 个单位的普鲁兰酶，反应12小时左右；（3)采用无水乙醇沉淀方法得到大元环糊精;所述淀 粉为马铃薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉;所述4-α-糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)按照的浓度进行淀粉调 浆，并按照每克淀粉0.25个单位的比例加入4-α-糖基转移酶，在70°C条件下搅拌10-15分 钟。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)按照1 %的浓度进行淀粉调浆。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)设定反应温度65°C。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)调pH5.5。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)以每克淀粉计，分别加入50个单位 的4-α-糖基转移酶、50个单位的普鲁兰酶。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)采用无水乙醇沉淀方法得到大元 环糊精的步骤是待反应结束后，取酶反应液上清，加入8-10倍体积的无水乙醇，离心得到无 水乙醇与大元环糊精形成的络合物沉淀，将得到的沉淀于60°C烘箱中放置过夜，即得大元 环糊精结晶。
【文档编号】C12P19/04GK105907816SQ201610438468
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月20日
【发明人】吴敬, 宿玲恰, 朱荣
【申请人】江南大学