一种与油脂含量相关的GhLPAAT5-like蛋白及其编码基因与应用
【专利摘要】本发明公开了一种与酵母菌油脂含量相关的GhLPAAT5?like蛋白及其编码基因与应用。本发明的GhLPAAT5?like蛋白，是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。通过实验说明：本发明的GhLPAAT5?like基因具有提高酵母菌株总脂肪含量、棕榈酸含量和硬脂酸含量的功能。
【专利说明】
-种与油脂含量相关的GhLPAATS-I ike蛋白及其编码基因与 应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种与油脂含量相关的化LPAATS-Iike蛋白 及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 棉花是世界上最重要的纤维作物和主要的油料作物，棉子是商品棉的主要副产 物，约占子棉总产量的60%，棉子含油量占15.0%~48.7% (刘明等，1994;王彦霞等， 2011)，棉子油中含有大量的人体所必需的脂肪酸，其中油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸的含 量接近80% (宋俊乔等，2010)，使得棉子油具有较强的抗氧化能力。另外，棉子油与菜巧油 和花生油相比含有较高的维生素 E(王延琴等，2014)，维生素 E是一种抗氧化剂，能提高人体 抗细胞衰老的能力W及降低人体屯、脑血管疾病发生几率等功效。此外，棉子发育时期的脂 肪酸组分不仅是决定其营养品质的关键因素而且对棉花纤维的发育也有重要影响，研究发 现亚麻酸、栋桐酸在棉花纤维发育阶段有重要调节作用(Wanjie et al. ,2005);超长链饱 和脂肪酸能促进棉花纤维伸长(Qin et al. ,2007);棉花种仁油分与纤维整齐度指数，伸长 率呈显著正相关(郭宝生等，2013)。上述研究结果表明棉子脂肪酸对棉纤维的发育具有促 进作用。棉子油作为生产生物能源燃料也具有广阔的应用前景，石化柴油的碳链长度一般 在C15~C18之间，而棉子油中有99%的脂肪酸碳链长度集中在C16~C18之间，和柴油成分 极其相似，棉子油适合转化生产为生物柴油，并且转化为生物柴油的效率高达95%，另外棉 子油转化而成的生物柴油富含氧而不含硫，因此可使生物柴油的燃烧更为彻底且不污染环 境(喻树迅等，2008)。
[0003] 由于我国近10年种植面积从2004年的569.287万公顷到2013年的434.563万公顷， 总体呈现逐年下降的趋势。因此通过利用基因工程手段提高单位面积上棉子的油脂含量， 是维持棉子油产量W至于提高棉花副产品利用效率的必由之路。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
[0005] 本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或C)的蛋白质：
[0006] a)氨基酸序列是序列表中序列2所不的蛋白质；
[0007] b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质； [000引C)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
[0009] 其中，序列2由263个氨基酸残基组成。
[0010] 为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或 簇基末端连接上如表1所示的标签。
[00川表1、标签的序列
[0012]
[0013] 上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不 超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0014] 上述C)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0015] 上述C)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1的第1-792位核巧酸序列中缺失一 个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5/端 和/或y端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0016] 本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。
[0017] 本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述Al)至A12)中的任一种：
[001引Al)编码上述蛋白质的核酸分子；
[0019] A2)含有Al)所述核酸分子的表达盒；
[0020] A3)含有Al)所述核酸分子的重组载体；
[0021] A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
[0022] A5)含有Al)所述核酸分子的重组微生物；
[0023] A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
[0024] A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
[00巧]A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
[0026] A9)含有Al)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0027] A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[00%] All)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0029] A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
[0030] 上述生物材料中，Al)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
[0031] 1)其编码序列为序列表中序列1的第1-792位核巧酸分子；
[0032] 2)与1)限定的核巧酸序列具有75%或75% W上同一性，且编码上述蛋白质的CDNA 分子或基因组DNA分子；
[0033] 3)在严格条件下与1)或2)限定的核巧酸序列杂交，且编码上述蛋白质的CDNA分子 或基因组DNA分子。
[0034] 其中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可 W 是 RNA，如 mRNA 或 hnRNA 等。
[0035] 本领域普通技术人员可W很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码上述蛋白质的核巧酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码上 述蛋白质的核巧酸序列75%或者更高同一性的核巧酸，只要编码上述蛋白质且具有相同功 能，均是衍生于本发明的核巧酸序列并且等同于本发明的序列。
[0036] 运里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本发 明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核巧酸序列具有75%或更高，或85%或 更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核巧酸序列。同一性可W用肉眼或计算机软件 进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可W用百分比（％)表示，其可W 用来评价相关序列之间的同一性。
[0037] 上述75%或75% W上同一性，可为80%、85%、90%或95% W上的同一性。
[0038] 上述生物材料中，所述严格条件是在2XSSC，0.1 %SDS的溶液中，在68°C下杂交并 洗膜2次，每次5min，又于0.5 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68 °C下杂交并洗膜2次，每次 15min;或，0.1 X SS阳(或0.1 X SSC)、0.1 % SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0039] 上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、隧菌体或病毒载体。
[0040] 上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
[0041] 上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均 不包括繁殖材料。
[0042] 本发明还有一个目的是提供上述蛋白质或上述相关生物材料的新用途。
[0043] 本发明提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在调控酵母菌总脂肪含量中的应 用。
[0044] 本发明还提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在调控酵母菌脂肪酸含量中的 应用。
[0045] 上述应用中，所述调控为提高。
[0046] 本发明还提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在培育总脂肪含量提高和/或脂 肪酸含量提高的转基因酵母中的应用。
[0047] 本发明的最后一个目的是提供一种培育总脂肪含量提高和/或脂肪酸含量提高的 转基因酵母的方法。
[0048] 本发明提供的培育总脂肪含量提高和/或脂肪酸含量提高的转基因酵母的方法包 括如下步骤:将上述蛋白质的编码基因导入受体酵母中，得到转基因酵母;所述转基因酵母 的总脂肪含量和/或脂肪酸含量高于受体酵母。
[0049] 上述方法中，所述上述蛋白质的编码基因为序列表中序列1的第1-792位核巧酸分 子。
[0050] 上述方法中，所述受体酵母为毕赤酵母;所述毕赤酵母具体为毕赤酵母GS115。
[0051 ]上述应用或上述方法中，所述脂肪酸为栋桐酸和/或硬脂酸。
[0052]本发明首先从棉花中克隆到了加 LPAATS-Iike基因，并在毕赤酵母中异源表达 GliLPAAT5-l ike基因，得到转(ihLPAAl'S-l ike酵母;分别用 BMGY 和BMMY 培养基对转(ihLPAATS- Iike酵母进行2地诱导培养，然后用组织细胞甘油=醋酶法对诱导培养24h后的酵母菌体进 行甘油S醋测定，发现转化LPAATS-Iike酵母的油脂含量明显高于野生型酵母菌株W及转 巧ic9K酵母菌株。用气相色谱法(Gas Qiromatogra地y，GC)测定转CihLPAATS-Iike酵母的脂 肪酸含量，发现转化LPAAT5-1化e酵母的栋桐酸(C16:0)含量和硬脂酸(C18:0)含量也明显 高于野生型酵母GS115菌株及转巧ic9K酵母菌株，说明本发明的趾LPAA巧-like基因具有提 高酵母菌株油脂含量的功能，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0化3] 图1为化LPAATS-Iike基因的克隆。
[0054] 图2为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，Ianel和lane 2为目的片段；M: DL2000Marke;r。
[0055] 图3为巧ic9K载体的结构示意图。
[0化6] 图4为巧ic9K-Aox: :(ihLPAAT5-like的PCR验证。其中Jane 1和lane 5有目的片段 (红色箭头标识）；M:DLSOOOMarker。
[0化7] 图5为化ic9K-Aox: :(ihLPAAT5-like的酶切验证。其中，lane 1和lane 5单克隆所 提质粒含有目的片段(红色箭头标识）;M:化2000Marker。
[005引图6为转趾LPAATS-Iike酵母单克隆的PCR检测结果。图6a为AOXl-F和AOXl-R引物 的鉴定结果，其中，M:DL2000Marker;lane 1:毕赤酵母GS115;lane 2~12:不同克隆。图6b 为a-factor-F和AOXl-R 3'引物的鉴定结果，其中，M:DL2000Marker;lane 1:毕赤酵母 GSl 15; lane 2~12:不同克隆。图6c为a-factor-F/AOXl-R 3 ' 引物和A0X1-F/A0X1-R引物对 转巧i c9K酵母菌株巧i C9K/GS115的鉴定结果，其中，M: DL2000Marker。
[00别图7为转(ihLPAAT5-like酵母的RNA检测。其中，M = MarkerIII ,lane 1:毕赤酵母 GS115，lane 2:转化ic9K酵母菌株，lane 3、lane 4和lane 5分别代表转(ihLPAAl'S-l化e酵 母阳性株5-2、5-11和5-12。
[0060]图8为转(ihLPAAT5-like酵母的RT-PCR检测。其中，M = MarkerIII ,lane 1:毕赤酵母 GS115，lane 2:转化ic9K酵母菌株，lane 3、lane 4和lane 5分别代表转(ihLPAAl'S-l化e酵 母阳性株5-2、5-11和5-12。
[0061 ]图 9 为(ihLPAAT5-like 纯化蛋白的 SDS-PAGE 检测。
[0062] 图 10为(ihLPAAT5-like纯化蛋白的Western Blot检测。
[0063] 图11为转GhLPAATS-Iike酵母的总脂肪含量的检测。其中，GS115为毕赤酵母 65115.65115- 91(为转巧^91(酵母菌株，5-2、5-11和5-12均为转(；化?4415-111?5酵母阳性株。
[0064] 图12为转GhLPAATS-Iike酵母的脂肪酸成分的检测。其中，GS115为毕赤酵母 65115.65115- 91(为转巧^91(酵母菌株，5-2、5-11和5-12均为转(；化?4415-111?5酵母阳性株。
【具体实施方式】
[0065] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0066] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0067] 下述实施例中的定量试验，均设置=次重复实验，结果取平均值。
[0068] 下述实施例中的KOD-Plus-Neo高保真PCR扩增酶、Target Clone-Plus平末端加 A 酶、T4DNA Ligase和SYBR?Green Realtime PCR qRT-PCR巧光定量酶均是TOYOBO生物公 司的产品。
[0069] 下述实施例中的Gel Extraction Kit胶回收试剂盒是Omega生物公司的产品。
[0070] 下述实施例中的DNA Purification Kit PCR产物纯化试剂盒、PrimeScriptTM ITTase RNA反转录试剂盒均是TaKaRa生物公司的产品。
[0071] 下述实施例中的DNA MarkerIII和GelStain邸替代物均是化ansGen生物公司的 产品。
[0072] 下述实施例中的RNApr邱pure植物总RNA提取试剂盒是Tiangen公司的产品。
[0073] 下述实施例中的RNApr邱pure酵母总RNA提取试剂盒是Promega公司的产品。
[0074] 下述实施例中所用的引物由北京GE肥WIZ生物公司合成。
[00巧]下述实施例中的大肠杆菌感受态菌体化scherichia coli)D册a是上海生工的产 品。
[0076] 下述实施例中的限制性内切酶EcoRI和NotI均是肥B公司的产品。
[0077] 下述实施例中的组织细胞甘油S醋酶是普利莱公司的产品。
[0078] 下述实施例中的琼脂糖是全式金生物公司的产品。
[0079] 下述实施例中的AGPAT2抗体是上海研生公司的产品。
[0080] 下述实施例中的蛋白腺、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钢等为国 产分析纯，5-漠-4-氯-3-吗I噪半乳糖巧(X-gal)、异丙基-P-D-硫代化喃半乳糖巧（IPTG)和 氨节青霉素等均是宝生物工程大连有限公司的产品。
[0081] 下述实施例中的溶液的配制:本文中提到的但未列出的各种试剂均按《分子克隆 实验指南》第=版上的方法配制，生化试剂为分析纯或W上级。
[0082] 下述实施例中的LB液体培养基：膜蛋白腺（化yptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钢(化Cl)10g/L;LB固体培养基:膜蛋白腺lOg/L、酵母提取物5g/L、氯化 钢lOg/L、琼脂粉15g/L，定容至1L; LB选择培养基:在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至 55°C时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板。
[0083] 下述实施例中的BMGY培养基：酵母提取物1 % (质量分数）、蛋白腺(Peptone)2 % (质量分数）、pH为6.0的憐酸钟缓冲液(将K2HP化与K此K)4按照5.1:1的质量比混匀得到的溶 液，其中，K2HPO4购买于aladdin公司，货号：G1522036;KH2P04购买于sigma公司，货号： P5655)、100mmol/L、YNB(购买于索莱宝公司，货号为：Y8040)l.：34% (质量分数）、生物素 (Biotin,购买于索莱宝公司，货号为:D8150)(4X1(T5)% (质量分数）、甘油(Glycerol)l% (体积分数）。
[0084] 下述实施例中的腿MY培养基：酵母提取物1 % (质量分数）、蛋白腺(Peptone)2 % (质量分数）、憐酸钟缓冲液(pH6.0)100mmol/L、YNB1.34%、生物素(Biotin)(4X10-5)%、 甲醇（Methanol)0.5%。
[00化]下述实施例中的主要仪器：PCR扩增仪（BIO-RAD)、高速离屯、机（Hettich MIKR0200R)、电泳设备(BIO-RAD)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、巧光定量PCR仪(ABI7500)、真 空冷冻干燥仪(ALPHA 1-5)、酶标仪(BI0-TEC KC4)。
[0086] 下述实施例中的棉花品种徐州142在文献"佚名.棉花新品种徐州142[J].农业科 技资料，1976(3)"中公开过，公众可从中国农业科学研究院棉花研究所获得。
[0087] 实施例1、棉花中(ihLPAAT5-like基因的克隆
[008引 URNA的提取
[0089] 取徐州142的根、茎、叶、花、蕾、下胚轴、不同发育时期的胚珠和纤维，并将所取材 料迅速投入液氮中冷冻，保存于-80°C冰箱备用。采用改良的CTAB法提取所取材料的总RNA， 总RNA提取采用TIANGEN公司试剂盒。
[0090] 2、CDNA 的获得
[0091] W200ng步骤I获得的总RNA为模板，采用TaKaRa的反转录试剂盒将其反转录为 CDNA，并将反转录产物CDNA溶液稀释4倍作为PCR反应模板。
[0092] 反转录反应体系见表1。反应过程在PCR仪器内先37°C溫育15min，然后85°C反应 5s，最后-20°C保存备用。
[0093] 亲1、掉异化累
[0094]
[00巧]3、PCR扩增
[0096] W步骤2获得的cDNA为模板，采用(ihLPAAT5-like-F和(ihLPAAT5-like-R引物进行 扩增，得到PCR扩增产物。引物序列如下：
[0097] (ihLPAAT5-l ike-F: 5^ATGTACCTGTGGGACCTTGC-3';
[009引（ihLPAAT5-like-R:5' -TTACAACAAAGTTGATATCTGAAAATAGC-3'。
[0099] PCR反应体系如表2所示;PCR反应条件如表3所示。
[0100] 表2、PCR反应扩增体系
[0104] 4、(ihLPAAT5-like 基因的获得[0105] PCR反应结束后，将PCR扩增产物4°C保存，用1 %的琼脂糖电泳进行检测，条带大小
[0101] 12 2 符合预期设计的电泳结果如图I所示。对目的片段运用胶回收试剂盒进行切胶回收，并将上 述胶回收的产物连接PMD18-T载体并转化大肠杆菌，37°C过夜培养从抗性LB培养基上挑取 单克隆到60化L含有Amp的LB培养基中，37°C摇菌培养4h后进行菌液PCR验证，送含有目的基 因片段大小条带的菌液测序。
[0106] 测序结果表明：PCR扩增得到大小为IOlSbp的条带，其核巧酸序列如序列1所示，将 序列1所示的基因命名为化LPAATS-Iike基因，自5'端1-792位为0RF，G化PAATS-Iike基因编 码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所不，将序列2所不的蛋白命名为化LPAATS-Iike 蛋白。
[0107] 实施例2、转化LPAAT5-1 ike酵母的获得及其功能验证
[0108] 一、转(ihLPAAT5-like 酵母的获得
[0109] 1、巧ic9K-Aox: :(ihLPAAT5-like毕赤酵母表达载体的构建
[0110] (1)目的基因 ORF序列的扩增
[0111] W实施例1中的步骤2获得的CDNA为模板，采用In-GhLPAATS-Iike-F和In- GliLPAAT5-like-R引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为目的基因 (ihLPAAT5-like的ORF 序列。引物序列如下：
[0112] In-(ihLPAAT5-like-F:5' -GGAATTCATGTACCTGTGGGACCTTGCAT-3'(含酶切位点 EcoRI);
[。…]In-GhLPAATS-Iike-R: 5'- ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAGACTAGTTTTGACAAAGT-3'(含酶切位点No。）。
[0114] PCR反应体系（50iil):2XPCR Buffer for KOD FX Neo 2化L、dNTP(2mM)10iiL、5' primer(lOiiM)化L、3'primer(10yM)化L、模板DNA IiiUKOD FX Neo(lU/ul)liiL、d地2〇 9化。
[0115] PCR反应程序：98°C预变性5min;循环为98。(：变性1〇3,60。(：退火3〇3,68。(：延伸 Imin,共30个循环；68°C延伸5min。
[0116] PCR产物在1.8%琼脂糖凝胶电泳，调节电压至90V，电泳化，照相记录电泳结果（图 2)，在紫外灯下观察，迅速切下目的条带。用胶回收试剂盒回收目的片段，具体方法按试剂 盒说明书进行。
[0117] (2)巧ic9K-Aox: :(ihLPAAT5-like的获得
[0118] 用限制性内切酶EcoRI和NotI对上述步骤（1)获得的PCR扩增产物进行双酶切，回 收大小为792bp的目的片段，用限制性内切酶EcoRI和NotI对化ic9K载体（图3,购买于 Invi化Ogen公司，货号:V175-20)进行双酶切，回收大小为9263bp的骨架载体，连接大小为 792bp的目的片段和大小为9263bp的骨架载体，16°C连接化(连接体系如表4)，得到巧ic9K- Aox::化LPAATS-Iike并对其进行测序。
[0119] 测序结果表明：Ppic9K-Aox: :(ihLPAAT5-like为将序列1自5'端第1-792位所示的 DNA分子插入巧ic9K载体的EcoRI和NotI酶切位点间，且保持化ic9K载体的其他序列不变得 到的载体。
[0120] 表4、目的基因与巧ic9K载体的连接体系
[0121]
[0122] (3)巧ic9K-Aox: :(ihLPAAT5-like的PCR验证
[0123] 将上述步骤(2)获得的连接产物巧ic9K-Aox::化LPAA巧-I化e转化感受态细胞，并 对其进行PC閲金证。具体步骤如下：
[0124] a.超净工作台灭菌30min，从-70°C超低溫冰箱中取出10化L的感受态细胞，放于冰 上，预冷IOmin;
[0125] b.取出一个化管，标上记号，置于冰上，加入SOiiL的感受态细胞(冰上操作）
[01 %] C.然后加入10化的连接产物，用移液枪吸打混匀后冰浴30min;
[0127] d.冰浴结束后，放在42°C的恒溫水浴锅中热激90s，然后迅速放入冰块中，冰浴 2min;
[012引 e.吸50化L不含Amp的LB液体培养液到Ep管中，混匀，置于摇床中16化pm，37°C摇 Ih;
[01巧]f.取出摇床结束的化管，2000~3000rmp离屯、5min，弃上清30化L，剩余的菌液轻柔 吸打混匀后加在含Amp的LB固体培养皿中，用玻璃涂棒涂匀，涂干；
[0130] g.37°C恒溫培养箱中培养16~20h。
[0131] h.随机挑取单克隆进行PC閲金证。结果如图4所示，从图中可W看出，1和5号单克隆 获得大小为989bp的条带。PC閲金证所用引物序列为：
[0132] 日-化。1〇尸尸引物：5'-14口'41760：46〔4176口'6(：-3'；
[0133] 3'40乂1-巧|物：5'-60〔444160〔41'1'押64〔410：1'-3'。
[0134] i.将1和5号单克隆在含有Amp的LB培养基进行20ml扩繁，37°C条件下19化mp的摇 床过夜，提取质粒后用EcoRI和NotI对质粒进行双酶切，得到酶切产物。酶切产物的电泳结 果如图5,从图中可W看出，1和5号单克隆的酶切产物均获得了大小为79化P和9263bp的条 带，证明得到阳性重组载体。
[0135] 2、转(ihLPAAT5-like 酵母的获得
[0136] (I)GS 115感受态细胞的制备
[0137] A、挑取活化后的毕赤酵母GS115(购买于Invitrogen公司，货号为：ST1030)单菌 落，接种至含有5mL YPDA培养基的SOmLS角瓶中，30°C、300r/min，过夜培养。
[0138] B、取Iml的培养物接种至含有IOOmL新鲜培养基的SOOmLS角摇瓶中，30°C、300r/ min培养过夜，至ODso日达到I. I~1.3。
[0139] C、将细胞培养物于4°C，5000g离屯、lOmin，用50mL的冰预冷的无菌水将菌体沉重 悬。
[0140] D、同步骤C，用25mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。
[0141] E、同步骤C，用20mL的冰预冷的Imol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。
[0142] F、同步骤C，用ImL的冰预冷的Imol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，制备成GS115 酵母感受态细胞。
[0143] (2)转(ihLPAAT5-l ike 酵母的获得
[0144] 将化ic9K-Aox::化LPAATS-Iike重组质粒通过电击转化至步骤（1)制备的新鲜的 GS115酵母感受态细胞中，得到重组菌巧ic9K-Aox: :(ihLPAAT5-like/GS115。具体过程如下：
[0145] A、将已构建好的化ic9K-Aox: :(ihLPAAT5-like重组质粒用限制性内切酶SacI酶切 后，得到线性化DNA片段，胶回收所需要的片段后备用。
[0146] B、将IOng的线性化DNA片段溶解在20化的TE溶液中，与80化的新鲜GSl 15毕赤酵母 感受态细胞混匀，转至0.2cm预冷的电转化杯中。
[0147] C、根据电转化仪说明书提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、 电流、电容、电阻等参数，按优化的参数进行电击。
[0148] D、电击完毕后，加入ImL冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5mL离屯、管中。
[0149] E、将I(K)化的菌体悬液涂布于MD平板上。
[0150] F、将平板置于3(TC培养箱静置培养2-3天，至单菌落出现。
[0151] 按照上述方法，将巧ic9K载体转化GS115酵母感受态细胞中，得到转化ic9K酵母菌 株巧 ic9K/GS115。
[0152] (3)转(ihLPAAT5-like 酵母的鉴定
[0153] 挑取酵母单克隆，在盛有ImL的YPDA培养基中30°C，300rmp/min过夜培养。分别用 A0X1-F、A0X1-R和日寸日(3*〇'斗、4(^-巧广增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，如果两 对引物在某一酵母单克隆中分别扩增得到约1302bp和IOOSbp的条带，说明化LPAATS-Iike 基因已整合到酵母基因组中，该酵母单克隆为转化LPAA巧-1化e酵母阳性株。酵母阳性株筛 选引物序列：
[0154] 40乂1斗引物：5'-64口'6617〇：441764〔446(：-3'；
[0155]
[0156] 酵母阳性株筛选引物序列：
[0157] 日-化。1〇尸尸引物：5'-14口'41760：46〔4176口'6(：-3'；
[0158] 3'40乂1-巧|物：5'-60〔444160〔41'1'押64〔410：1'-3'。
[0159] 鉴定结果如图6所示，图6a为AOXl-F和AOXl-R引物的鉴定的结果；图6b为a- factor-F和AOXl-R引物的鉴定结果，其中，M:DL2000Marker;l:对照酵母菌株（毕赤酵母 GS115); 2~12:不同克隆。从两图中可W看出，除4号单克隆外，其余11个转趾LPAA巧-like 酵母均为转化LPAAT5-1 ike 酵母阳性株系（5-2、5-3、5-5、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-11、5- 12)。
[0160] 转化ic9K酵母菌株化ic9K/GS115的PCR鉴定结果和质粒化ic9K对照的PCR鉴定结 果如图6c所示，从图中可W看出，两者无显著性差异。
[0161] 3、转(ihLPAAT5-like酵母的诱导表达及RT-PCR检测
[0162] (1)转(ihLPAAT5-like酵母的诱导表达
[0163] 随机选取S个阳性转(ihLPAAl'S-like酵母菌株(5-2、5-11和5-12)、对照酵母菌株 (毕赤酵母GS115)和转巧ic9K酵母菌株巧ic9K/GS115,分别接种至含20mL BMGY培养基的无 菌S角瓶。在摇床中30 °C，300巧m/min摇床生长至0〇6。。= 20-25(约24h)。室溫5000巧m离屯、 Smin，收集沉淀物，弃除上清，用50mL BMMY培养基重悬细胞，30°C，300巧m/min摇床继续培 养，隔12h加入甲醇至终浓度为0.5% (体积分数），继续诱导到24h，分别得到酵母菌体5-2、 5-11和5-12、对照酵母菌体和转巧ic9K酵母菌体。
[0164] (2)转(ihLPAAT5-like 酵母的 RT-PCR检测
[0165] 用promega公司的酵母RNA提取试剂盒分别对步骤（1)获得的酵母菌体5-2、5-11和 5-12、对照酵母菌体和转化i c9K酵母菌体进行总RNA的提取。将提取的RNA用浓度为1 %琼脂 糖凝胶进行电泳检测，结果如图7所示，表明RNA质量提取合格。将提取的各个酵母菌体的 RNA进行反转录，并把反转录产物最终稀释成化g/ul，W此为模版分别用巧光定量特异引物 RT-趾 LPAAl'5-likeF、RT-GliLPAAT5-likeRW 及内参基因 18S 引物 RT-18SF、RT-18SR 进行 PCR 扩增。引物序列如下：
[0166] RT-GhLPAAl'S-l ikeF: CGAGATCCCCTTTGGCTTGT;
[0167] RT-GhLPAAl'S-l ikeR: CAGGGTAACACGCCTGATGT;
[0168] RT-18SF:TTAGTTGGTGGAGTGATTTG;
[0169] RT-18SR:GGTGGCTCTGTCAGTGTAG。
[0170] 结果如图8所示，其中，1号为对照酵母菌株(GS115)，2号为转化ic9K酵母菌株，3、 4、5分别为转化LPAATS-Iike酵母菌株5-2、5-11和5-12。从图中可W看出：对照酵母菌株 GS115和转化ic9K酵母菌株均没有扩增得到大小为285bp的条带，说明对照菌株GS115和转 巧ic9K酵母菌株中均没有化LPAATS-Iike基因的表达，而转化LPAATS-Iike酵母菌株5-2、5- U和5-12中均扩增得到大小为28化P的条带，说明转化LPAATS-Iike酵母菌株5-2、5-U和5- 12中均表达了 (ihLPAAT5-like基因。
[0171 ]二、GhLP AATS-Iike 蛋白纯化及 Western-blot 检测
[0172] 1、酵母小量表达
[0173] A、挑取单克隆，接种至5ml BMGY中，28-30°C，250-300rpm摇至00600 = 2-6(对数生 长，大约16-18小时）。
[0174] B、室溫1500-3000g离屯、5min，收集细胞，去除上清，用BMMY重悬细胞至0D600 = 1.0,进行诱导表达(大约25ml)。
[0175] C、每24小时，加甲醇至终浓度为0.5 % W继续诱导。在诱导2地和4她时，取Iml培养 基至1.5ml离屯、管。室溫用水平离屯、机最大转速离屯、2-3min，收集菌体沉淀。
[0176] 2、酵母蛋白纯化
[0177] A、酸洗玻璃珠高速震荡破碎菌体。
[0178] B、按每克湿重菌体2~5ml平衡缓冲液的比例充分悬浮离屯、收集的菌体;600W功 率，每循环超声5s，冷却5s，循环99 X 3次，破碎菌体;4°C、ISOOOrpm离屯、15mim，收集上清液， 或用0.45]im滤膜过滤。
[0179] C、用10倍介质体积缓冲液A过柱，平衡介质(介质为Ni琼脂糖凝胶）；上样；
[0180] D、用5~10倍介质体积缓冲液A过柱，洗去层析柱中剩余上样液并重新平衡介质；
[0181] E、用5~10倍介质体积缓冲液B洗脱，收集洗脱液，得到纯化后的化LPAAT5-1 ike蛋 白，用SDS-PAGE检测洗脱液中(ihLPAAT5-like蛋白的纯度。
[0182] 结果如图9所示:GhLPAATS-Iike蛋白大小为35Kda左右，与预测大小基本一致。
[0183] 3、Weste;rn blot检测
[0184] 将LPAA邱兔抗体按照1: 200的比例稀释后，对纯化后的化LPAAT5-1 ike蛋白进行 Western blot检测。结果显示所获得的蛋白为化LPAAT5-like蛋白（图10)。
[0185] S、转化LPAATS-Iike酵母的总脂肪含量及脂肪酸成分含量的测定
[01化]1、转化LPAATS-Iike酵母的诱导表达
[0187] 将S个阳性转化LPAATS-Iike酵母菌株5-2、5-11和5-12、对照酵母菌株(毕赤酵母 GS115)和转巧ic9K酵母菌株巧iC9K/GS115 (GS115-9K)分别接种至含20mL BMGY培养基的无 菌S角瓶。在摇床中30 °C，300巧m/min摇床生长至0〇6。。= 20-25(约24h)。室溫5000巧m离屯、 Smin，收集沉淀物，弃除上清，用50mL BMMY培养基重悬细胞，30°C，300巧m/min摇床继续培 养，隔1化加入甲醇至终浓度为0.5% (体积分数），继续诱导到2地，用50ml离屯、管在5000g的 离屯、机中离屯、Imin,分别收集沉淀菌体。用O.lmol/L的PBS缓冲液洗涂两次菌体，最后放入 冷冻真空干燥仪进行24h干燥，分别得到转加 LPAATS-Iike酵母菌株5-2的菌体沉淀、转 化LPAA巧-1 ike酵母菌株5-11的菌体沉淀、转化LPAAT5-1 ike酵母菌株5-12的菌体沉淀、对 照酵母菌株的菌体沉淀和转巧ic9K酵母菌株的菌体沉淀。
[018引2、总脂肪含量检测
[0189] 采用组织细胞甘油S醋酶法测定试剂盒(购买于普利莱公司，货号:E1013-105)并 按照试剂盒中的说明分别对步骤1获得的转化LPAAT5-1 i ke酵母菌株5-2的菌体沉淀、转 化LPAA巧-1 ike酵母菌株5-11的菌体沉淀、转化LPAAT5-1 ike酵母菌株5-12的菌体沉淀、对 照酵母菌株的菌体沉淀和转巧ic9K酵母菌株的菌体沉淀中的脂肪含量进行测定。
[0190] 结果如图11所示:转化LPAATS-Iike酵母菌株5-2的菌体沉淀、转化LPAATS-Iike酵 母菌株5-11的菌体沉淀、转化LPAATS-Iike酵母菌株5-12的菌体沉淀中的总脂肪含量分别 为112.2皿〇1/1，151.0皿〇1/1和110.2皿〇1/1，对照酵母菌株65115和转化^91(酵母菌株的 菌体沉淀的总脂肪含量分别为74.3皿ol/L和96.0皿ol/L。转(ihLPAAT5-l ike酵母菌株5-2的 菌体沉淀、转化LPAATS-Iike酵母菌株5-11的菌体沉淀、转化LPAA巧-like酵母菌株5-12的 菌体沉淀中的总脂肪含量与对照酵母菌株GS115的菌体沉淀相比，分别提高了51.0%、 103.2%和48.3 % ;转(ihLPAAl'S-like酵母菌株5-2的菌体沉淀、转(ihLPAAT5-l ike酵母菌株 5-11的菌体沉淀、转化LPAATS-Iike酵母菌株5-12的菌体沉淀中的总脂肪含量与转化ic9K 酵母菌株的菌体沉淀相比分别提高了 16.9%、57.3%和14.8%。
[0191] 3、脂肪酸成分含量检测
[0192] 将步骤1获得的转化LPAA巧-1化e酵母菌株5-2的菌体沉淀、转化LPAATS-Iike酵母 菌株5-11的菌体沉淀、转化LPAAT5-1 ike酵母菌株5-12的菌体沉淀、对照酵母菌株的菌体沉 淀和转化ic9K酵母菌株的菌体沉淀分别用研鉢研磨成粉末状，取IOmg干菌体放入5mL具塞 离屯、管中，然后加入2(K)化的90~120°C的石油酸，在IOOW超声波45°C的条件下浸提1.化;然 后加入100化的0.5mol/L的KOH-C出OH溶液，高速振荡甲醋化;然后加入扣L饱和化Cl溶液， 400化pm离屯、IOmin后，将上清转入1.5血进样瓶用Agi Ien巧890A气相色谱仪对菌体中的脂 肪酸成分栋桐酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)的含量进行检测，检测步骤参照文献"张军平，= 角褐指藻LPAAT基因在酵母中表达对脂肪酸的影响，2012"中的方法。色谱分析的参数具体 如下：色谱柱:DB-23毛细管色谱柱(60mX0.25mmX 0.25皿），柱溫采用程序升溫：100°C保 持Imin, W25°C/min速率升溫到175°C，再W4°C/min的速率升溫到230°C，保持2min;FID检 测器溫度280°C ;进样口溫度250°C ;载气为高纯氮气(纯度99.999% )，流速30血/min;氨气 流速40mL/min;空气流速400mL/min;进样量1. 分流比60:1。其中，12.106保留时间对应 的峰为栋桐酸(Cl6:0); 14.357保留时间对应的峰为硬脂酸(Cl8:0)。
[0193] 结果如图12所示:转化LPAATS-Iike酵母菌株5-2的菌体沉淀、转化LPAATS-Iike酵 母菌株5-11的菌体沉淀、转化LPAATS-Iike酵母菌株5-12的菌体沉淀中的栋桐酸(C16:0)含 量分别为24.1%，18.6%和21.5%，对照酵母菌株GSl 15的菌体沉淀的栋桐酸含量为 15.6%，转(ihLPAAT5-like酵母菌株5-2的菌体沉淀、转(ihLPAAT5-like酵母菌株5-11的菌体 沉淀、转化LPAATS-Iike酵母菌株5-12的菌体沉淀与对照酵母菌株的菌体沉淀相比，分别提 高了54.5%、19.0%和38.0%;转(}化?4415-1146酵母菌株5-2的菌体沉淀、转(；化?4415- Iike酵母菌株5-11的菌体沉淀、转化LPAATS-Iike酵母菌株5-12的菌体沉淀中的硬脂酸 (C18:0)含量分别为44.6%，28.0%和27.9%，对照酵母菌株GSl 15的菌体沉淀中的硬脂酸 含量为20.6%，转化LPAAT5-1 ike酵母菌株5-2的菌体沉淀、转化LPAA巧-1化e酵母菌株5-11 的菌体沉淀、转化LPAAT5-1 ike酵母菌株5-12的菌体沉淀与对照酵母菌株的菌体沉淀相比， 分别提高了 117.0%、36.1 %和36.0%。
[0194] 转化ic9K酵母菌株的菌体沉淀中的栋桐酸含量和硬脂酸含量与对照酵母菌株的 菌体沉淀中的栋桐酸含量和硬脂酸含量无显著性差异。
[01M]上述结果说明：本发明的化LPAATS-Iike基因具有提高酵母菌株总脂肪含量、栋桐 酸含量和硬脂酸含量的功能。
【主权项】
1. 蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质： a) 氣基酸序列是序列表中序列2所不的蛋白质； b) 在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质； c) 将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。2. 与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述Al)至A12)中的任一种： Al)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子； A2)含有Al)所述核酸分子的表达盒； A3)含有Al)所述核酸分子的重组载体； A4)含有A2)所述表达盒的重组载体； A5)含有Al)所述核酸分子的重组微生物； A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物； A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物； A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物； A9)含有Al)所述核酸分子的转基因植物细胞系； A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系； Al 1)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系； A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。3. 根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于:A1)所述核酸分子为如下1)或2) 或3)所示的基因： 1) 其编码序列为序列表中序列1的第1-792位核苷酸分子； 2) 与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋白 质的cDNA分子或基因组DNA分子； 3) 在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的 cDNA分子或基因组DNA分子。4. 权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在调控酵母菌总脂肪 含量中的应用。5. 权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在调控酵母菌脂肪酸 含量中的应用。6. 权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在培育总脂肪含量提 高和/或脂肪酸含量提高的转基因酵母中的应用。7. -种培育总脂肪含量提高和/或脂肪酸含量提高的转基因酵母的方法，包括如下步 骤:将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体酵母中，得到转基因酵母;所述转基因 酵母的总脂肪含量和/或脂肪酸含量高于受体酵母。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述蛋白质的编码基因为序列表中序列1 的第1-792位核苷酸分子。9. 根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于:所述受体酵母为毕赤酵母。10. 根据权利要求4-6中任一所述的应用或权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在 于:所述脂肪酸为棕榈酸和/或硬脂酸。
【文档编号】C12R1/84GK105924512SQ201610545294
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】于霁雯, 马建江, 王诺菡, 吴嫚, 裴文锋, 翟红红, 李兴丽, 张金发, 喻树迅
【申请人】中国农业科学院棉花研究所