调节种子内油脂含量的突变基因、种子内油脂含量的调节方法

专利名称：调节种子内油脂含量的突变基因、种子内油脂含量的调节方法
技术领域：
本发明涉及调节种子内油脂含量的突变基因，该突变基因是以种子内所存在的油 体的变化为指标而被鉴定的，本发明还涉及通过使特定基因突变来调节种子内油脂含量的 方法。
背景技术：
油体(Oil body，也有时称为类脂体(lipid body))是一种在植物、尤其是在粮油 作物的种子细胞中大量存在的细胞器。油体是由一层含有被称为油质蛋白(oleosin)、油 体固醇蛋白(steroleosin)、油体钙蛋白(caleosin)等特异性蛋白质的磷脂膜形成的，其 内部的植物油脂以三酰甘油(TAG、中性脂肪、中性脂质)的形式存在，油体尤其在植物种子 中大量蓄积。一直以来，作为油体中所蓄积的油脂的分析方法，一般是破坏种子提取油脂成 分，再利用气相色谱或液相色谱等进行分析的方法。在这些分析方法过程中，需要加入脂质 分解抑制剂，和/或处理温度需要低温条件，而且，在处理过程中油脂成分可能会分解。另一方面，非专利文献1中公开了油体的大小受油质蛋白的存在量影响。另外， 非专利文献2中公开了通过使油质蛋白基因与GFP(绿色荧光蛋白，green fluorescent protein)基因融合，可以利用来自GFP的荧光来观察油体。但是，即使能观察油体，关于油 体的数目和/或形状、以及油体中蓄积的油脂量和/或与油脂种类的关系仍然不明。非专利文献1 :Siloto，R. M. P.等，Plant Cell 18,1961-1974, (2006)非专利文献2 :Wahlroos 等，GENESIS，35(2) :125_132，(2003)

发明内容
因此，本发明的目的在于，确立能够测定植物细胞中的油体的数量和大小等各种 性状的体系，利用该体系阐明油体性状与油脂含量的相关关系，提供具有调节种子内油脂 含量的功能的突变基因以及种子内油脂含量的调节方法。为了实现上述目的，本发明者们进行了深入研究，表达了油质蛋白-GFP融合蛋白 质，发现GFP荧光强度总和与油脂含量之间存在正相关。基于该见解，发明者们发现具有影 响种子中油脂含量的功能的基因以及该基因中氨基酸置换突变会影响种子中油脂含量的 事实，从而完成了本发明。SP，本发明的突变基因包括以下(1) (7)。(1)突变基因，编码突变蛋白质，所述突变蛋白质具有在序列号1所示氨基酸序列 中N末端第12位氨基酸残基被其他氨基酸取代而得的共有序列，且所述突变蛋白质具有调 节植物种子内油脂含量的功能。(2)根据(1)所述的突变基因，其特征在于，上述其他氨基酸是选自异亮氨酸、缬 氨酸、亮氨酸和蛋氨酸中的一种氨基酸。(3)根据(1)所述的突变基因，其特征在于，上述其他氨基酸是异亮氨酸。
3
(4)根据(1)所述的突变基因，其特征在于，上述突变蛋白质是在序列号4 17的 氨基酸序列中的任一个所示氨基酸序列中所包含的上述共有序列中，N末端第12位氨基酸 残基被其他氨基酸取代而得的蛋白质。(5)根据(1)所述的突变基因，其特征在于，是使来自植物的基因发生突变而得 的。(6)根据(1)所述的突变基因，其特征在于，是使来自属于选自禾本科、十字花科 和杨柳科中的一科的植物的基因发生突变而得的。(7)根据⑴所述的突变基因，其特征在于，是使来自属于选自大麦、稻、拟南芥、 芜青(Brassica rapa)和白杨中的一种的植物的基因发生突变而得的。此外，本发明包含由上述突变基因编码的突变蛋白质、导入上述突变基因而形成 的转化细胞、导入上述突变基因而形成的转化植物。另一方面，本发明的种子内油脂含量的调节方法包括以下⑶ (13)。(8)种子内油脂含量的调节方法，对编码具有由序列号1所示氨基酸序列构成的 共有序列的蛋白质的基因引入变异，所述变异是将序列号1所示氨基酸序列的N末端第12 位氨基酸残基置换成其他氨基酸。(9)根据⑶所述的种子内油脂含量的调节方法，其特征在于，上述其他氨基酸是 选自异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸和蛋氨酸中的一种氨基酸。(10)根据(8)所述的种子内油脂含量的调节方法，其特征在于，上述其他氨基酸
是异亮氨酸。(11)根据(8)所述的种子内油脂含量的调节方法，其特征在于，使变异蛋白质表 达，所述变异蛋白质是在序列号4 17的氨基酸序列中的任一个所示氨基酸序列中所包含 的上述共有序列中，N末端的第12位氨基酸残基被其他氨基酸取代而得的蛋白质。(12)根据(8)所述的种子内油脂含量的调节方法，其特征在于，使来自属于选自 禾本科、十字花科和杨柳科中的一科的植物的基因发生突变。(13)根据(8)所述的种子内油脂含量的调节方法，其特征在于，使来自属于选自 大麦、稻、拟南芥、芜青和白杨中的一种的植物的基因发生突变。本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2008-048612号的说明 书及/或附图中所记载的内容。


图1是显示氨基酸残基的置换突变的得分矩阵(BLOSUM)的示意图。图2-1是显示对14种氨基酸序列进行比对分析的结果的比对图。图2-2是显示对14种氨基酸序列进行比对分析的结果的比对图。图2-3是显示对14种氨基酸序列进行比对分析的结果的比对图。图2-4是显示对14种氨基酸序列进行比对分析的结果的比对图。图3是显示由图2所示比对图获得的分子进化系统树的图。图4中，A是显示油质蛋白-GFP融合基因的构成示意图，B D分别是OleG、突变 体A和突变体B在暗处发芽第6天时子叶的荧光照片。图5是显示GFP荧光总和％与种子的脂质含量的关系的特性图。
图6是显示OleG、突变体A和突变体B中的种子贮藏脂质的脂肪酸组成分析的结 果的特性图。图7是显示使用从野生型拟南芥、OleG、突变体A和突变体B的种子中提取出的蛋 白质样品的SDS-PAGE结果，使用抗油质蛋白抗体的免疫印迹分析结果，以及使用抗GFP抗 体(C)的免疫印迹分析的照片。图8是显示用电子显微镜观察OleG、突变体A和突变体B的种子细胞的结果的照 片。图9中，A是显示用于鉴定突变体A中原因基因的高精度图谱的结果的特性图，B 是显示存在于所定位的位置的基因Atlg54570的结构的示意图。
具体实施例方式以下，参照附图对本发明进行详细说明。本发明中，通过油体特异性蛋白质与荧光蛋白质而使油体可视化，具体地说，使用 油质蛋白-GFP融合基因转化作为模型植物的拟南芥，通过荧光使从转化拟南芥中采摘的 子叶中所含的油体可视化。诱发该转化拟南芥进行突变，在观察油体的形状和数量等各种 性状变化的同时，测定油脂含量和/或油脂组成的变化。令人惊讶的是，明确了在油体的各 种性状中，子叶中荧光总和(换言之，即每单位面积的荧光强度)与种子中所含的油脂含量 之间存在正相关。基于以上见解，特定了植物中的油脂含量、油脂量和/或油脂中的脂肪酸 组成发生了变化的突变体的原因基因以及作为原因的突变。S卩，本发明的突变基因编码具有调节植物中油脂含量和/或油脂量的功能的蛋白 质，在该蛋白质中，被称为二酰甘油酰基转移酶结构域的进化上保守的氨基酸序列中的规 定氨基酸被置换成了其他氨基酸。本发明的突变基因编码具有被称为二酰甘油酰基转移酶 结构域的进化上保守的氨基酸序列的蛋白质，且所述氨基酸序列包含规定氨基酸被置换成 了其他氨基酸的氨基酸序列。在以下说明中，将构成被称为二酰甘油酰基转移酶结构域的 进化上保守的区域的氨基酸序列称为共有序列。序列号1显示共有序列。具体地说，序列号1所示共有序列可改写成以下的氨基酸序列(用氨基酸单字母 缩写表示)(D/E) xxxxxGxxxx (T/S) xxxx (Y/F) (R/K/N/Q) L (F/L) xxxx (F/H) VxL (Y/F) PGGxRE(A/S)LHx(K/R)(G/D)Ex(Y/H)(K/R/Q)L(F/I)WP(D/E)(Q/H/R)xEFVRxA(A/S)(R/K/Q) F(G/N)(A/V/T)(T/K)(I/V)(I/V)PFGxVGEDD(V/F/I/L/M)χ(E/D/H)(L/V/M/I)x上述氨基酸序列中，括号内的多个氨基酸表示该位置上可取的氨基酸残基的变 异。此外，下述氨基酸序列中，X代表该位置上可以取任意的氨基酸残基。规定位置上可取 的氨基酸残基的变异基于以下理由。即，上述共有序列如后面所述，可以通过对来自植物种 的多个同源蛋白质的氨基酸序列进行多重比对分析来规定。其中如参考文献(1)(《7 , ^ 一生化学》第3版第5章7 S 7酸·《f K ·夕> /、1質5. 1 7 S 7酸、主编市川厚、 主译福R伸一、出版人曾根良介、出版社(株)化学同人、ISBN4-7598-0944-9)所记载 的那样，氨基酸可以按照具有同样性质(化学性质和/或物理大小)侧链来分类已经为人 们所熟知。此外，在保持蛋白质活性的条件下分类于规定组的氨基酸残基之间的分子进化 上的置换高频率地发生也已经为人们所熟知。以该想法为基础，在参考文献(2) =HenikofTS. , Henikoff J. G. , Amino—acid substitution matrices from protein blocks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,10915-10919 (1992)中的图2中，提出氨基酸残基的置换突变的得 分矩阵(BLOSUM)，该得分矩阵已被广泛应用(见本说明书的图1)。在参考文献(2)中，具 有侧链的化学性质相似的氨基酸彼此的置换，是基于给蛋白质整体带来的结构和/或功能 变化少这样的见解而进行的。根据上述参考文献(1)以及(2)，在多重比对中考虑的氨基酸 的侧链的组，可以基于化学性质和/或物理大小等指标来思考。这可以显示为图1所示的 具有得分为0以上的值的氨基酸的组，优选为具有得分为1以上的值的氨基酸的组。作为 代表性的组，可列举下述8个组。至于其他细致的分组，只要是如图1中彼此值为0以上的 氨基酸组即可，优选彼此值为1以上的氨基酸组，更优选彼此值为2以上的氨基酸组。1)脂肪族疏水性氨基酸组(ILMV组)该组是上述参考文献(1)所示的中性非极性氨基酸中具有脂肪属性的疏水性侧 链的氨基酸的组，包括V(Val、缬氨酸)、L(Leu、亮氨酸)、I (He、异亮氨酸)和M(Met、蛋氨 酸)。参考文献(1)中被分类为中性非极性氨基酸的氨基酸中，FGACffP由于以下原因而不 包含在该“脂肪族疏水性氨基酸组”中。G(Gly、甘氨酸)、A(Ala、丙氨酸)是因为由于大小 为甲基以下而非极性效应弱的原因。C(Cys、半胱氨酸)是因为有时S-S键发挥重要作用、 且有时具有与氧原子和/或氮原子形成氢键的特性的原因。F(Phe、苯丙氨酸)和W(Trp、色 氨酸)是因为侧链具有特别大的分子量，且芳香族效应强的缘故。而P (Pro、脯氨酸)是因 为亚氨基酸效应强、会固定多肽主链的角度的缘故。2)具有羟基亚甲基的氨基酸组(ST组)该组是中性极性氨基酸中的侧链具有羟基亚甲基的氨基酸的组，包括S(Ser、丝氨 酸)和T(Thr、苏氨酸)。存在于S和T侧链的羟基是糖的结合部位，因此很多情况下是使 某些多肽(蛋白质)具有特定活性的重要部位。3)酸性氨基酸(DE组)该组是侧链具有酸性羧基的氨基酸的组，包括D (Asp、天冬氨酸)和E(Glu、谷氨 酸)。4)碱性氨基酸(KR组)该组是碱性氨基酸的组，包括K(Lys、赖氨酸)和R(Arg、精氨酸)。该K和R具有 在较宽的PH范围内带正电且显碱性的性质。另一方面，被分类为碱性氨基酸的H(His、组氨 酸)在PH7时几乎不离子化，因此不将其分类至该类组。5)亚甲基=极性基团(DHN组)该组全部具有α位碳原子上作为侧链结合了亚甲基、且该亚甲基前端具有极性 基团这样的特征。包括具有与作为非极性基团的亚甲基的物理大小极其相近的特征的 N(Asn、天冬酰胺、极性基团为酰胺基)、D(Asp、天冬氨酸、极性基团为羧基)和H(His、组氨 酸、极性基团为咪唑基)。6) 二亚甲基=极性基团(EKQR组)该组全部具有α位碳原子上作为侧链结合了二亚甲基以上的直链烃、且该直链 烃前端具有极性基团这样的特征。包括具有与作为非极性基团的二亚甲基的物理大小极其 相近的特征的E(Glu、谷氨酸、极性基团为羧基)、K(Lys、赖氨酸、极性基团为氨基)、Q(Gln、 谷氨酰胺、极性基团为酰胺基)和R(Arg、精氨酸、极性基团为亚氨基和氨基)。
7)芳香族(FYW 组)该组是侧链具有苯核的芳香族氨基酸的组，以芳香族特有的化学性质为特征。包 括F(Phe、苯丙氨酸)、Y(Tyr、酪氨酸)和W(Trp、色氨酸)。8)环状和极性(HY组)该组是侧链具有环状结构同时具有极性的氨基酸的组，包括H(His、组氨酸、环状 结构和极性基团均为咪唑基)、Y (Tyr、酪氨酸、环状结构为苯核，极性基团为羟基)。本发明的突变基因编码上述共有序列中的N末端第12位氨基酸残基(苏氨酸(T) 或丝氨酸(S))被置换成了其他氨基酸、并具有调节植物中油脂量的功能的蛋白质。这里， 上述共有序列中的N末端第12位氨基酸残基(苏氨酸(T)或丝氨酸(S))是被苏氨酸激 酶或丝氨酸激酶磷酸化的可能性高的氨基酸残基，且作为对二酰甘油酰基转移酶活性贡献 较大的氨基酸残基的概率较高。因此，通过将上述共有序列中的N末端第12位氨基酸残基 (苏氨酸(T)或丝氨酸(S))置换成其他氨基酸，可以使本发明的突变基因所编码的蛋白质 的活性变化。所谓该基因编码的蛋白质活性变化，是指提高酶活性、抑制酶活性、改变底物 特异性以及改变与底物和/或辅酶等其他因子的亲和性。此处作为置换后的其他氨基酸，可列举异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸和蛋氨酸，特别 优选为异亮氨酸。在将上述共有序列中N末端第12位氨基酸残基(苏氨酸(T)或丝氨酸 (S))置换为异亮氨酸的情况下，会呈现每一粒种子所含油脂量比野生型增加、但每一粒种 子的油脂含量％比野生型减少这样的特征表型。此外，上述共有序列可以是在序列号1所示氨基酸序列的C末端添加了由10个 氨基酸残基构成的序列(XXX(N/H/E/D) (D/E)xx(N/K)xP)而形成的序列(示于序列号2)。 即，本发明的突变基因包括编码在序列号1所示的氨基酸序列的C末端侧添加了规定序列 (xxx(N/H/E/D) (D/E)xx(N/K)xP)而得的共有序列中N末端第12位氨基酸残基(苏氨酸(T) 或丝氨酸(S))被置换成其他氨基酸、且具有调节植物内油脂量的功能的蛋白质的基因。作为编码具有上述共有序列的蛋白质的基因，可以从广泛种类植物种中鉴定、分 离，而不限制特定的植物种。具体来说，编码具有上述共有序列蛋白质的基因，可以从属 于十字花科的拟南芥(Arabidopsis thaliana)、属于禾本科的大麦(Hordeum vulgare)、 属于禾本科的稻(Oryza sativa)、属于十字花科的芜青以及属于杨柳科的白杨(Populus trichocarpa、也有时称为美国黑杨或三叶杨)中鉴定、分离。此处，芜青包括分类于同种 中的亚种，例如油菜籽、油菜、油菜花、大白菜、青菜(★4 )、芜青、野泽菜、日本芜 青、小松菜和小白菜(m f 3 4 )。作为拟南芥中编码具有上述共有序列的蛋白质的基因，可列举GenBank登录号 BT005958.所特定的 Atlg54570 基因、GenBank 登录号 NM_123478. 3 所特定的 At5g41130 基因、GenBank登录号AY09638. 1所特定的At5g41120基因和GenBank登录号AF360145. 1 所特定的At3g26840基因。此外，作为大麦中编码具有上述共有序列的蛋白质的基因，可 列举GenBank登录号AK251457. 1所特定的FLbaf 127k09基因。作为稻中编码具有上述共 有序列的蛋白质的基因，可列举GenBank登录号NM_001049558. 1所特定的0s01g0361500 基因、GenBank登录号NM_001049562. 1所特定的0s01g0362100基因、GenBank登录号 NM_001049559. 1 所特定的 0s01g0361700 基因和 GenBank 登录号 NM_001070165. 1 所特定 的0s09g0509500基因。芜青(例如油菜籽、油菜、油菜花、大白菜、青菜(f >少‘ > 寸4 )、芜青、野泽菜、日本芜青、小松菜和小白菜(〃々★ 3 4 ))中编码具有上述共有序列的蛋白 质的基因，可列举GenBank登录号AC189616. 1所特定的KBrH099I08基因。作为白杨中编 码具有上述共有序列的蛋白质的基因，可列举以GenBank登录号AC213081. 1注册的克隆名 P0P002-D20的全碱基序列中，存在于第41811位碱基 第50309位碱基区域的基因、存在于 第62687位碱基 第71216位碱基区域的基因、存在于第89072位碱基 第97258位碱基 区域的基因和存在于第75984位碱基 第83278位碱基区域的基因。上述Atlg54570基因的碱基序列和由Atlg54570基因所编码的蛋白质的氨基酸序 列分别示于序列号3和4。由上述At5g41130基因所编码的蛋白质的氨基酸序列示于序列号 5。由上述At5g41120基因所编码的蛋白质的氨基酸序列示于序列号6。由上述At3g26840 基因所编码的蛋白质的氨基酸序列示于序列号7。由上述FLbafl27k09基因所编码的蛋白 质的氨基酸序列示于序列号8。由上述0s01g0361500基因所编码的蛋白质的氨基酸序列示 于序列号9。由上述0s01g0362100基因所编码的蛋白质的氨基酸序列示于序列号10。由上 述0s01g0361700基因所编码的蛋白质的氨基酸序列示于序列号11。由上述0s09g0509500 基因所编码的蛋白质的氨基酸序列示于序列号12。由上述KBrH099I08基因所编码的蛋白 质的氨基酸序列示于序列号13。以AC213081. 1注册的克隆名P0P002-D20的全碱基序列中 存在于第41811位碱基 第50309位碱基区域的基因所编码的蛋白质的氨基酸序列示于序 列号14。克隆名P0P002-D20的全碱基序列中存在于第62687位碱基 第71216位碱基区 域的基因所编码的蛋白质的氨基酸序列示于序列号15。克隆名P0P002-D20的全碱基序列 中存在于第89072位碱基 第97258位碱基区域的基因所编码的蛋白质的氨基酸序列示于 序列号16。克隆名P0P002-D20的全碱基序列中存在于第75984位碱基 第83278位碱基 区域的基因所编码的蛋白质的氨基酸序列示于序列号17。对于序列号4 17所示氨基酸序列，使用CLUSTAL ff(l. 83)multiple sequence alignment程序(可以通过国立遗传学研究所的DDBJ使用(http//clustalw. ddbj. nig. ac. jp/top-j.html))进行比对分析，结果示于图2 (所使用的氨基酸序列置换行列表采用 默认值的BLOSUM矩阵)。如图2所示，判定这14种蛋白质具有上述共有序列(下划线部 分)。此外，本发明的突变基因是将图2所示多重比对中箭头所示位置的苏氨酸(T)或丝氨 酸(S)置换成其他氨基酸而得的。另外，图3显示由图2所示14种氨基酸序列的比对结果 获得的分子进化系统树。作为将图2所示14种蛋白质中箭头所示位置的苏氨酸(T)或丝氨酸(S)置换成 其他氨基酸的方法，可以适当使用历来公知的基因工程学方法。总之，特定编码突变引入对 象蛋白质的野生型基因的碱基序列，使用定点突变导入试剂盒等引入突变，使其编码上述 置换后的蛋白质。此外，对于已引入突变的基因，可按照常规方法回收，例如以重组到表达 载体中的状态回收。此外，可以采用Kunkel法或缺口双链体(Gapped duplex)法等公知方 法或依据这些方法的方法在基因中引入突变，例如，使用利用了定点突变诱发法的突变导 入试剂盒(例如Mutant-K (TAKARA Bio社制)、Mutan-G (TAKARA Bio社制)等)，或者使用 TAKARA Bio社的LA PCR in vitro Mutagenesis系列试剂盒来引入突变。另外，本发明的突变基因并不限于编码含有序列号4 17所示的氨基酸序列中上 述共有序列中N末端第12位氨基酸残基(苏氨酸(T)或丝氨酸(S))被置换成其他氨基 酸而得的氨基酸序列的蛋白质的基因。本发明的突变基因还可以产生下述突变在序列号4 17所示的氨基酸序列中序列号1所示共有序列中N末端第12位氨基酸残基(苏氨酸 (T)或丝氨酸(S))被置换成其他氨基酸而得的氨基酸序列中，多个、优选为1个或几个氨基 酸发生缺失、置换、添加等突变。例如，在序列号4 17所示氨基酸序列中，可以缺失、添加 或置换1 10个、1 8个，优选1 5个氨基酸。此外，本发明的突变基因是编码与序列号4 17所示氨基酸序列具有70%以上的 同源性的蛋白质的基因，可以是编码具有上述共有序列中N末端侧第12位氨基酸残基(苏 氨酸(T)或丝氨酸(S))被置换成其他氨基酸而得的氨基酸序列的蛋白质的基因。上述同 源性优选为80%以上，更优选为85%以上，进一步优选为90%以上，最优选为95%以上。上述氨基酸的缺失、添加和置换可以通过采用本技术领域公知的方法改变编码上 述蛋白质的基因来进行。可以采用Kunkel法或缺口双链体(Gapped duplex)法等公知方 法或依据这些方法的方法在基因中引入突变，例如，使用利用了定点突变诱发法的突变导 入试剂盒(例如Mutant-K (TAKARA Bio社制)、Mutan-G (TAKARA Bio社制)等)，或者使用 TAKARA Bio社的LA PCR in vitro Mutagenesis系列试剂盒来引入突变。作为本发明的 在突变基因中引入突变的方法，可以是使用以EMS(甲磺酸乙酯)、5_溴尿嘧啶、2-氨基嘌 呤、羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍以及其他致癌性化合物为代表的化学诱变剂的 方法，也可以是利用以X射线、α射线、β射线、Υ射线、离子束为代表的放射处理和/或 紫外线处理的方法。而且，本发明的突变基因包含编码与含有由序列号3所示碱基序列构成的DNA的 互补碱基序列的DNA在严格条件下杂交、且编码具有调节种子内油脂含量的功能的突变蛋 白质的DNA。此处所谓严格条件，是指能形成特异性杂种、而不能形成非特异性杂种的条件。 例如，可列举在45°C、6XSSC(氯化钠/柠檬酸钠)的条件下进行杂交、然后在50 65°C、 0. 2 1 X SSC、0. 1 % SDS的条件下洗涤，或者作为这样的条件，可列举在65 70°C、1 X SSC 的条件下进行杂交、然后在65 70°C、0. 3XSSC的条件下洗涤。另外，如果确定了本发明的突变基因的碱基序列，然后就可以通过化学合成，或通 过以克隆cDNA为模板进行PCR，或通过以含有该碱基序列的DNA片段为探针进行杂交，从而 从各种植物中获得该基因。以上所说明的本发明的突变基因，通过将植物基因中野生型基因进行如下改变从 而在所需的植物内进行功能性表达将上述共有序列中N末端第12位氨基酸残基(苏氨酸 (T)或丝氨酸(S))置换成其他氨基酸。即，具有本发明的突变基因的植物可以通过如上所 述的定点突变诱发法来制成，也可以通过事先准备好的突变基因与基因组中的野生型基因 之间的同源重组来制成。或者，具有本发明的突变基因的植物也可以通过在使植物基因组 内的野生型基因缺失的同时将该突变基因导入使其能表达来制成。另外，具有本发明的突 变基因的植物也可以通过在不使植物基因组内的野生型基因缺失的条件下将该突变基因 导入使其过量表达来制成。另外，作为将本发明的突变基因导入植物内的方法，可以适当采用历来公知的方 法。例如，作为用于将本发明的突变基因导入植物细胞使其表达的载体，优选使用PBI系 载体、pUC系载体、pTRA系载体。pBI系载体和pTRA系载体可以介由农杆菌将目标基因导 入植物中。优选使用PBI系的双元载体或使用中间载体系，可列举例如，ρΒΙ121、ρΒΙΙΟΙ、 ρΒΙΙΟΙ. 2、ρΒΙΙΟΙ. 3等。而pUC系载体可以将基因直接导入植物中，可列举例如，pUC18、pUC19、pUC9等。此外还可以使用花椰菜花叶病毒(CaMV)、菜豆金色花叶病毒(BGMV)、烟草 花叶病毒(TMV)等植物病毒载体。此外，本发明的突变基因也可以不与具有载体功能的DNA —起导入，而采用基因 枪法直接导入植物细胞。本发明的突变基因优选包含在能发挥该基因功能那样地构建的DNA中。因此，基 因导入用的DNA上除了启动子之外，还可以根据需要连接增强子、剪接信号、加poly-A信 号、选择标记、5’ -UTR序列等。此外，作为选择标记，可列举例如，二氢叶酸还原酶基因、氨 苄青霉素抗药性基因、新霉素抗药性基因、潮霉素抗药性基因和双丙氨磷抗药性基因等。作为“启动子”，只要是能够在植物细胞中发挥功能、在植物特定组织内或特定发 育阶段诱导表达的DNA即可，也可以不是植物来源的DNA。作为具体例，可列举例如，花椰菜 花叶病毒(CaMV) 35S启动子、胭脂碱合成酶基因的启动子(Pnos)、来自玉米或稻的遍在蛋 白启动子、来自玉米或稻的肌动蛋白质启动子、来自烟草的I3R蛋白质启动子等。“终止子”只要是能终止被上述启动子转录的基因的转录的序列即可。作为具体 例，可列举胭脂碱合成酶基因的终止子(Tnos)、花椰菜花叶病毒poly-A终止子等。“增强子”用于提高目的基因的表达效率，例如，优选含有CaMV 35S启动子的上游 侧的序列的增强子区域。此外，可以使用含有本发明的突变基因的表达载体，按照常规方法制备转化植物。 转化植物可以通过将上述表达载体导入宿主中使得导入的突变基因能够表达来获得。另 外，只要是包含在使本发明的突变基因的功能能够发挥那样地构建的DNA片段中即可，也 可以在缺乏具有载体功能的DNA的状态下通过基因枪法来制备出转化植物。转化植物(转 基因植物)可以如下获得。转化的对象是植物组织(包括例如，表皮、韧皮部、薄壁组织、木 质部、维管束等、以及植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等))或植物细胞。另一方面，作为具有本发明的突变基因的植物，可列举双子叶植物、单子叶植物， 例如，属于十字花科、禾本科、茄科、豆科、杨柳科等的植物(参考下述)，但并不限于这些植 物。
lt^f (Arabidopsis thaliana)>^^| (Brassica rapa、Brassica napus) λ^- ι^ (Brassica oleracea var. cap it at a)、 胃 ff (Brassica r&p&、Brassica napus) λ ^ (Brassica r&p&、Brassica napus)、力白胃(Brassica rapa var. pekinensis)、冑胃(Brassica rapa var. chinensis)、胃冑(Brassica rapa var. rapa)、
(Brassica rapa var. hakabura) Λ(Brassica rapa var. lancinifolia) Λ
小松菜(Brassica rapa var. peruviridis)、小白菜('、。夕子 3 彳，Brassica rapa var. chinensis)、萝卜(Brassica Raphanus sativus)、山葵(Wasabia japonica)等。前禾斗烟草(Nicotiana tabacum)、前子(Solanum melongena)、马铃薯(Solaneum tuberosum)、番前(Lycopersicon lycopersicum)、辣椒(Capsicum annuum)、矮牵牛 (Petunia)等。豆科大豆(Glycine max)、豌豆(Pisum sativum)、蚕豆(Vicia faba)、多花紫 藤(Wisteria floribunda)、花生(Arachis· hypogaea)、日本百脉根(Lotus corniculatus var. japonicus)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、赤小豆(Vign a angular is)、金合欢 (Acacia)等。
菊禾斗菊(Chrysanthemum morifolium)、向曰葵(Helianthus annuus)等。禾斗油掠(Elaeis guineensis> Elaeis oleifera)、才耶子(Cocos nucifera) > 海枣(Phoenix dactyl if era)、巴西棕榈(Copernicia)■ M 禾斗里予■ W (Rhus succedanea)、月要胃(Anacardium occidentale)、■ W (Toxicodendron vernicifluum)、芒果(Mangifera indica)、P可月t军子(Pistacia vera) (Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbitapepo)、 (Cucumis sativus) > ΞΕ/R (Trichosanthes cucumeroides) > (Lagenaria siceraria var. gourda)蔷薇科扁桃(Amygdaluscommunis)、玫瑰(Rosa)、草莓(Fragaria)、樱 (Prunus)、苹果(Malus pumila var. domestica)等。石竹科康乃馨(Dianthuscaryophyllus)等。杨柳禾斗白杨(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula)禾本禾斗玉米(Zea mays)、稻(Oryza sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、小麦 (Triticum aestivum)、毛竹属(Phyllostachys)、甘蔴(Saccharum officinarum)等。百合科郁金香属(Tulipa)、百合属(Lilium)等。作为具有本发明的突变基因的表达载体或DNA片段导入植物中的方法，可列举农 杆菌法、PEG-磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法、基因枪法(轰击法)、微注射法等。例如，在使 用农杆菌法时，有使用原生质体的情况和使用组织片的情况。在使用原生质体的情况下，可 以通过与具有Ti质粒的农杆菌共培养的方法、与原生质球化后的农杆菌融合的方法(原生 质球法)等来进行；在使用组织片的情况下，可以通过利用叶盘转化来感染对象植物的无 菌培养叶片的方法(叶盘转化法)、感染愈伤组织(未分化的培养细胞)的方法、直接浸透 到花组织的方法等来进行。此外，在利用农杆菌法转化单子叶植物时，为了提高转化率，可 以加入乙酰丁香酮。可以通过PCR法、Southern杂交法、Northern杂交法等来确认突变基因是否重组 到了植物内。例如，从转化植物中制备DNA，设计DNA特异性引物进行PCR。PCR之后，对扩增 产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳等，再用溴乙锭、SYBR Green 液等染色，然后通过扩增产物作为1条带被检测出，可以确认该植物已被转化。此外，也可 以使用事先已用荧光色素等标记的引物进行PCR来检测扩增产物。另外，还可以采用使扩 增产物结合在微板等固相上，通过荧光或酶反应等来确认扩增产物的方法。可以将转化所得肿瘤组织、芽、毛状根、种子等直接在细胞培养、组织培养或器官 培养中使用，还可以使用历来公知的植物组织培养法，通过施与适当浓度的植物激素(生 长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯、芸苔素内酯等)而使植物体再生。由培养细胞再 生植物体一般如下进行在混合有适当种类的生长素和细胞分裂素的培养基上分化出根， 然后移植至含有大量细胞分裂素的培养基上分化出芽，再移植至不含激素的土壤中。这样，导入了上述突变基因的转化植物显示如下特征表型与导入突变基因前的 植物相比，特定组织中所含的油脂总量相比野生型的特定组织中所含的油脂总量增加，但 特定组织中的油脂含量％比野生型的特定组织所含的油脂含量％减少。这时作为特定组 织，可以是叶、子叶、根、根毛、毛状体、花、种子、果实、花茎、块根、块茎和球茎等，优选是子 叶、种子、果实，更优选是种子。此外，可以通过历来公知的方法对从植物采摘的种子中所含
11的油脂成分进行定量检测。作为特定组织中所含油脂成分的测定方法，可列举使用脉冲NMR 装置的方法作为一个例子。此外，可以通过利用荧光使从导入了油质蛋白-GFP融合基因的转化拟南芥采摘 的子叶中所含的油体可视化，从而鉴定本发明的突变基因。然而，在本发明中，作为油体特 异性蛋白质，并不仅限于油质蛋白，可以广泛使用在油体中特异性存在的蛋白质。作为油体 特异性蛋白质，可列举例如，油质蛋白、油体固醇蛋白和/或油体钙蛋白。此外，在本发明 中，作为使子叶中的油体可视化的荧光蛋白质，只要是具有荧光能力的蛋白质即可，例如， 可以使用GFP(绿色荧光蛋白，green fluorescent protein)、YFP(黄色荧光蛋白，yellow fluorescent protein)、RFP (红色焚光蛋白，red fluorescent protein)、OFP (橙色焚光 蛋白，orange fluorescent protein)禾口 BFP(蓝色焚光蛋白，blue fluorescent protein) 等。但是，只要能将子叶中的油体可视化即可，并不限于荧光蛋白质，可以广泛使用能利用 可见光检测出的蛋白质。即，作为能利用可见光检测出的蛋白质，例如，可以使用萤光素酶 等发光蛋白质。以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术范围并不限于以下实施 例。[实施例1]本实施例中，对作为模型植物被广泛应用的拟南芥进行转化，使其表达油质蛋 白-GFP融合基因，制作出能通过荧光观察而观察到油体的转化植物。然后，对得到的转化 植物实施突变处理，以油体的性状变化为指标，鉴定出种子内油脂量发生了变化的突变体。 然后特定鉴定出的突变体中的原因基因，并在鉴定具有改变种子内油脂量的功能的基因的 同时，鉴定改变植物内油脂量的氨基酸置换突变。以下详细叙述具体的实验流程和实验结^ ο材料和方法〈植物材料〉使用拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚生态型。将植物按照常规方法，经 种子灭菌，再在无菌琼脂培养基(1/2MS培养基、0.8%琼脂)中于22°C光照条件下培养7 天，使其发芽。然后，移入放有蛭石珍珠岩=1 1的盆中，于22°C、16小时光照、8小时 避光的条件下培育。<制备油质蛋白-GFP基因>使用Qiagen社的RNeasy plant mini kit从拟南芥的鞘中分离RNA，再使用 Invitrogen 社的 SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR 进行逆 转录反应。使用得到的 cDNA、引物 1 (5’ AAAAAGCAGGCTCAATGGCGGATACAGCTAGAGGA3'序列号 18)和引物 2(5'CTCGCCCTTGCTCACCATAGTAGTGTGCTGGCCACC3’:序列号 19)进行 PCR，扩增出在 油质蛋白S3 cDNA的两端具有attBl序列的一部分和GFP基因的一部分的DNA片段A。同 时，使用编码维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白GFP的cDNA、 引物 3(5’GGTGGCCAGCACACTACTATGGTGAGCAAGGGCGAG3’ 序列号 20)和引物 4(5’AGAAAGCTGGG TCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3’ 序列号21)进行PCR反应，从而扩增出在GFP cDNA的两端添 加了油质蛋白S3cDNA的一部分和attB2序列的一部分的DNA片段B。接着，将DNA片段A 和 DNA 片段 B、引物 5 (5’ GGGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC Τ3’ 序列号 22)和引物6 (5’ GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG G3'序列号 23)混合，再进行 PCR 反应，从而 制成两端具有attBl和attB2序列的油质蛋白-GFP融合基因。油质蛋白-GFP融合基因的 碱基序列和该基因产物的氨基酸序列分别示于序列号24和25。按照Invitrogen公司的Gateway system方案，将所得融合基因介由pD0NR221 载体克隆到Ti载体中，该Ti载体在CaMV 35S启动子的下游具有attRl和attR2序列， 且含有卡那霉素抗药性标记。通过电穿孔法将所得质粒导入农杆菌(Agrobacterium tumefacience C58C1 rifR)中，将该产物称为 Ti-OleG。〈转化拟南芥〉通过农杆菌法将油质蛋白-GFP融合基因导入拟南芥的基因组中。首先，使 Ti-OleG在YEB培养基(5g/l多聚蛋白胨、5g/l牛肉提取物、lg/1酵母提取物、5g/l蔗糖、 0. 5g/l MgSO4)中在28°C增殖至A600 = 0. 8-1. 0，然后离心分离收集菌体。将所得菌体悬 浮于渗透液(IOmM MgCl2、5%蔗糖、0. 05% Silwet L-77)中使得A600 = 0.8。将处于开花 状态的拟南芥的花茎置于该悬浮液中浸润1分钟，然后采摘已经结果的种子。将采摘的种 子经种子灭菌处理后播种到含25mg/l卡那霉素的无菌琼脂培养基上，以卡那霉素抗药性 为指标，分离出基因组中插入了油质蛋白-GFP融合基因的转化拟南芥。从所得的转化拟南 芥采摘种子，选择出后代中均质地具有卡那霉素抗药性标记的转化体，将其命名为OleG。〈转化体的突变原处理〉将OleG的种子用0. 2%甲磺酸乙酯处理16小时后，播种到放有蛭石珍珠岩= 1 1的盆中。在22°C、16小时光照、8小时避光的条件下培育，采摘后代的种子，将其称为 M2种子。<GFP荧光观察〉使用荧光实体显微镜(Carl Zeiss SteREO Lumar V12)对突变体进行筛选。将 OleG和M2种子置于垂直放置的无菌琼脂培养基中，于暗处使其发芽6天，然后在荧光实体 显微镜(Carl Zeiss)下观察黄化子叶、胚轴和根的各细胞中的油质蛋白-GFP融合蛋白质 的GFP荧光。将与OleG的GFP荧光强度和/或分布不同的鉴定为突变体。使用共聚焦激光显微镜(Carl Zeiss LSM 510)比较OleG和突变体中的油质蛋 白-GFP融合蛋白质的GFP荧光。从在暗处发芽6天的OleG和突变体上分别切取黄化子叶、 胚轴、根，置于载玻片上。在相同条件下拍摄各细胞中GFP荧光图像，并使用显微镜附带的 图像分析软件进行分析，计算出同一面积内荧光强度相对于像素的度数分布，并计算出荧 光总和a = sum(荧光强度X像素数)。〈种子蛋白质的电泳和免疫印迹分析〉将20粒种子在40μ 1的SDS样品缓冲液中破碎后离心，将上清液作为种子蛋白 质的样品。按照常规方法，将15 μ 1样品用于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后的凝胶用 0.2%考马斯亮蓝R250溶液(含25%甲醇、10%乙酸)进行染色。为了进行免疫印迹分析，将5μ 1样品用SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后使用 半干转印法将凝胶中的蛋白质转印至硝酸纤维素膜上。使用转印至硝酸纤维素膜上的蛋白 质的抗蛋白质抗体的检测，是按照GE Healthcare BioScience的方案，使用ECL Western 印迹检测试剂进行的。检测时，一次抗体(抗油质蛋白抗体或抗GFP抗体)和二次抗体均 使用1/5000稀释的溶液。使用富士 7 O A制的发光图像分析仪LAS-1000 plus来检测发光。<种子细胞的电子显微镜观察>将切成一半的种子用固定液(4%多聚甲醛、戊二醛、10% DMS0、0.05M卡可 基酸缓冲液PH7.4)固定。将固定后的样品用Epon812树脂包埋，并使用Leica制切片机 Ultracut UCT制成超薄切片。将超薄切片用4%乙酸双氧铀和0. 4%柠檬酸铅进行电子染 色，然后用电子显微镜(日立制作所H-7600)观察。〈种子的油脂量测定〉一边进行除静电处理一边使用硫酸纸将种子在精密电子天平上称重，称取种子重 量为10 12mg。将种子放入脉冲NMR用的试管中，使用Resonance制MARAN-23脉冲NMR 由1H-脉冲NMR的弛豫时间值求出种子中的油脂含量(重量％ )。具体测定步骤可参考脉 冲NMR测定手册。<种子油脂中所含的脂肪酸组成的分析>称取重量为lmg-5mg左右的种子样品后，将其放入1. 5ml微量试管中。在微量试 管中加入1粒3mm 0的碳化钨珠后，再加入450 μ 1甲醇、与甲醇溶剂以0. 2 % (w/v)的浓 度混合的丁基羟基甲苯溶液50 μ 1、以及作为内标物的0. 2% C15:0脂肪酸10 μ 1。然后加 入了这些各种试剂和样品的微量试管使用Retsch制的ΜΜ301型混磨机以l/20s的频率振 动1分钟，使种子粉碎。然后将样品转移至IOml的带螺旋盖的试管中。再将微量试管内部 用甲醇250 μ 1洗涤2次，洗涤而得的甲醇溶液加入到上述试管中，使样品液约为Iml左右。 再向其中加入Iml的10%盐酸/甲醇溶液，在80°C处理1小时，然后加入1. 5ml正己烷，用 涡旋混合器搅拌，再将正己烷层移至IOml的Spitz管中。用Iml正己烷进一步洗涤用于甲 醇分解作用的试管内部，将洗涤而得的正己烷层加入上述Spitz管中。将所得正己烷溶剂 溶液在40°C进行氮气吹洗，使脂肪酸甲酯干燥凝固。将干燥凝固的脂肪酸甲酯用500μ1正 己烷溶解，通过GC-FID分离、定量各种脂肪酸甲酯。定量时参照内标物(C15:0脂肪酸)的 面积值。〈突变基因的鉴定〉突变原处理后，为了对种子中的油脂量发生了变化的突变体中原因基因进行 高精度基因图谱定位，将具有哥伦比亚生态型背景的突变体与野生型拟南芥兰兹贝格 (Landsberg erecta)生态型进行杂交，从而获得均质地带有突变基因的310系统F2代。 使用多种分子标记，按照常规方法，对这些310系统、共计620条染色体的遗传背景进行得 分分析。使用PCR方法扩增由OleG和突变体基因组DNA推断为原因基因的基因，并使用 Applied Biosystem制的3130x1遗传分析仪确定碱基序列。结果与讨论<油体形成不全突变体的筛选方法的确立>制备编码油质蛋白与GFP (绿色荧光蛋白，green fluorescent protein)的融合 蛋白质的融合基因(Oleosin-GFP)，并将其连接到来自花椰菜花叶病毒的35S启动子DNA的 下游(图4A)。使用农杆菌法将该DNA构建体导入拟南芥(Arabidopsis thaliana)的基因 组DNA中，制备转化拟南芥，并将其命名为oleG。使用荧光显微镜观察在黑暗条件下发芽6 天后的oleG子叶，将结果示于图4B。由图4B可知，油体膜被GFP荧光所标记，以大量的小 的油体聚集成凝集体的状态存在。另外还得知，除了在黑暗条件下发芽的子叶中存在油体以外，在胚和/或光照条件下发芽的绿色子叶中和/或母叶中、花瓣中也存在油体。为了确定与油体中的植物油脂蓄积机理相关的基因，将OleG种子用甲磺酸乙酯 进行突变处理，得到后代M2种子。对在黑暗条件下发芽6天后的M2植物进行荧光显微镜 观察，获得荧光强度与oleG不同的突变体A(图4C)和突变体B(图4D)。这些突变体的已 发芽的子叶中的GFP荧光强度低于oleG。<GFP荧光总和与种子脂质含量的关系>对于OleG、突变体A和突变体B，其在黑暗条件下发芽6天后的子叶的GFP荧光 以相同条件、相同面积、相同像素数下的共聚焦激光显微镜图像获得，并根据各图像的像素 数相对于GFP荧光强度的度数分布求出GFP荧光总和a(a = sum(荧光强度X像素数))。 如果设OleG的荧光总和为100%，则突变体A的荧光总和为37. 9 %，突变体B的荧光总和 为85. 1%。另一方面，测定OleG、突变体A和突变体B的种子中所含的脂质含量，结果分别 % 34. 66% ±0. 43%,26. 91% 士0. 34%和 32. 34% 士0. 49%，由此确认 GFP 荧光总和与种 子的脂质含量存在正相关(图5)。此外，分析这些突变体的种子中所积累的脂质所含的脂 肪酸组成(图6)。其结果是突变体A和突变体B与OleG相比C20 :l(ll)cis的含量均降 低。本说明书中所述脂肪酸如下表记。C碳原子数碳原子彼此间的不饱和键数(存在不 饱和键的碳原子从羧基侧起的编号)不饱和键的顺反几何异构(cis-trans)。在顺反几何 异构不明确的情况下，不进行顺反几何异构的表记。例如，硬脂酸表记为C18 0，一般的油酸 表记为C:18:l(9)ciS。另一方面，在突变体A中发现C18:3 (9，12，15)增加，在突变体B中 C18:1(9) cis增加。以上结果表明，通过测定油质蛋白-GFP融合蛋白质的GFP荧光总和，可 以在生存状态下对植物油脂的蓄积机理发生异常的突变体进行鉴定。此外，在图6中，显示各脂肪酸的柱状图从左边起依次代表OleG、突变体A和突变 体B。〈种子蛋白质的分析〉图7是野生型拟南芥、OleG、突变体A和突变体B的种子所含的蛋白质的分析结 果。由考马斯亮蓝染色(图7A)、利用抗油质蛋白抗体的免疫印迹分析(图7B)以及利用抗 GFP抗体的免疫印迹分析(图7C)可明确在突变体A、突变体B的种子中，内在性油质蛋白 量和油质蛋白-GFP量均比OleG减少。此外，在图7A C中，泳道1表示来自野生型拟南 芥的样品，泳道2表示来自OleG的样品，泳道3表示来自突变体A的样品，泳道4表示来自 突变体B的样品。〈油体的电子显微镜观察〉图8显示将OleG、突变体A和突变体B的种子细胞在电子显微镜下的观察结果。 与野生型拟南芥同样地，OleG的种子细胞中也塞满了小的油体。另一方面，在突变体A和 突变体B中，油体彼此之间存在被认为是胞质溶胶的间隙，每个油体均呈球形。认为这是由 于种子的贮藏脂肪量减少的缘故。另外，种子中的若干个油体巨大化。认为这是由于油体 膜中的油质蛋白量的减少的缘故。〈原因基因的鉴定〉将具有哥伦比亚生态型背景的突变体A与兰兹贝格(Landsberg erecta)生态型 的野生型拟南芥进行杂交，并对原因基因进行高精度基因图谱定位。使用分子标记对620 条染色体遗传背景的得分分析，结果示于图9A。来自兰兹贝格(Landsberg erecta)的染色体数目显示突变体A原因基因的基因座与分子标记之间发生了重组。如图9A所示，由 高精度基因图谱定位可知，突变体A原因基因的基因座极其靠近第1染色体的Atlg54560， 且位于Atlg54150与Atlg54970之间。这暗示了在该区域存在包含功能尚未被鉴定的基因 Atlg54570(图 9B)的 87 基因。Atlg54570编码包含被认为是二酰甘油酰基转移酶(DAGAT)结构域的部分的多 肽。尽管DAGAT结构域是一种被认为与作为一种参与三酰甘油合成的酶的二酰甘油酰基转 移酶共同存在的氨基酸序列，但这是基于碱基序列信息的推测，因此具有DAGAT结构域的 多肽未必全都具有DAGAT活性。此外，对于DAGAT的研究目前主要集中在出芽酵母中进行， 判定植物种子中的特定多肽是DAGAT的例子尚未被人们所知。确定了存在于突变体A的基因组DNA中的Atlg54570基因区域的碱基序列，结果 是Atlg54570中的碱基序列存在C3252T的点突变(C3252T的表记表示以相对于mRNA的 cDNA的起始密码子5’ ATG3'中的A作为1时，第3252位的C置换突变成T)。该点突变位于 第10个外显子中，引发Atlg54570基因产物氨基酸序列的DAGAT结构域内T508I的错义突 变(T508I的表记表示自多肽的N末端起第508个氨基酸残基T (Thr)置换突变成I(Ile))。 由以上结果可以得出结论突变体A的原因基因是Atlg54570，Atlg54570基因产物中的 T508I突变是改变植物内油脂量的氨基酸置换突变。产业可利用性根据本发明的突变基因，可以调节种子内的油脂含量和/或油脂组成等。此外，根 据本发明的种子内油脂含量的调节方法，可以提供油脂含量和/或油脂组成得到了调节的 植物。本说明书中所引用的所有出版物、专利和专利申请均直接作为参考而包含在本说 明的内容中。
权利要求
突变基因，编码突变蛋白质，所述突变蛋白质具有在序列号1所示的氨基酸序列中N末端第12位氨基酸残基被其他氨基酸取代而得的共有序列，且所述突变蛋白质具有调节植物种子内的油脂含量的功能。
2.根据权利要求1所述的突变基因，其特征在于，上述其他氨基酸是选自异亮氨酸、缬 氨酸、亮氨酸和蛋氨酸中的一种氨基酸。
3.根据权利要求1所述的突变基因，其特征在于，上述其他氨基酸是异亮氨酸。
4.根据权利要求1所述的突变基因，其特征在于，上述突变蛋白质是在序列号4 17 的氨基酸序列中的任一个所示氨基酸序列中所包含的上述共有序列中，N末端第12位氨基 酸残基被其他氨基酸取代而得的蛋白质。
5.根据权利要求1所述的突变基因，其特征在于，是使来自植物的基因发生突变而得的。
6.根据权利要求1所述的突变基因，其特征在于，是使来自属于选自禾本科、十字花科 和杨柳科中的一科的植物的基因发生突变而得的。
7.根据权利要求1所述的突变基因，其特征在于，是使来自属于选自大麦、稻、拟南芥、 芜青和白杨中的一种的植物的基因发生突变而得的。
8.由权利要求1 7的任一项所述的突变基因编码的突变蛋白质。
9.导入权利要求1 7的任一项所述的突变基因而形成的转化细胞。
10.导入权利要求1 7的任一项所述的突变基因而形成的转化植物。
11.种子内油脂含量的调节方法，对编码具有由序列号1所示氨基酸序列构成的共有 序列的蛋白质的基因引入变异，所述变异是将序列号1所示氨基酸序列的N末端第12位氨 基酸残基置换成其他氨基酸。
12.根据权利要求11所述的种子内油脂含量的调节方法，其特征在于，上述其他氨基 酸是选自异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸和蛋氨酸中的一种氨基酸。
13.根据权利要求11所述的种子内油脂含量的调节方法，其特征在于，上述其他氨基 酸是异亮氨酸。
14.根据权利要求11所述的种子内油脂含量的调节方法，其特征在于，使变异蛋白质 表达，所述变异蛋白质是在序列号4 17的氨基酸序列中的任一个所示氨基酸序列中所包 含的上述共有序列中，N末端的第12位氨基酸残基被其他氨基酸取代而得的蛋白质。
15.根据权利要求11所述的种子内油脂含量的调节方法，其特征在于，使来自属于选 自禾本科、十字花科和杨柳科中的一科的植物的基因发生突变。
16.根据权利要求11所述的种子内油脂含量的调节方法，使来自属于选自大麦、稻、拟 南芥、芜青和白杨中的一种的植物的基因发生突变。
全文摘要
本发明提供具有调节种子内油脂含量的功能的突变基因以及种子内油脂含量的调节方法。作为本发明的解决问题的方法是，提供一种突变基因，编码突变蛋白质，所述突变蛋白质具有在序列号1所示的氨基酸序列中N末端第12位氨基酸残基被其他氨基酸取代而得的共有序列，且所述突变蛋白质具有调节植物种子内的油脂含量的功能。
文档编号C12N5/10GK101960010SQ200980106810
公开日2011年1月26日 申请日期2009年2月23日 优先权日2008年2月28日
发明者光川典宏, 大音德, 林诚 申请人:丰田自动车株式会社