专利名称：利用反义基因调控籽粒蛋白质/油脂含量的方法
技术领域：
本发明属于植物育种领域，特别是利用反义基因定向地调控植物籽粒蛋白质、油脂含量，以获得高油或高蛋白的品种(系)。
目前，已知的提高籽粒蛋白质、油脂含量，一般是常规育种和正向调节的基因工程操作。常规育种只能在既定的变异范围内选育，由于遗传种质资源的限制，最多只能提高2～3个百分点含油量，且育种方向具随机性，育种周期长，遗传稳定慢。正向操作方式的基因工程技术，在理论上解决了定向提高籽粒蛋白质或油脂含量的可能，但在应用中由于技术难度大，含量增幅不大，目的基因在活体中表达样式复杂，农业性状难以综合优良，迄今未有品种(系)问世，离生产应用仍有较大距离。
早在50年代就发现，种子蛋白质与油脂含量之间呈高度负相关。至80年代又发现，大豆的蛋白质含量与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenopyruvate carboxylase，简称PEPCase)活性正相关(Agri.Bio.Chem1989，53(3)885～887)。其实蛋白质、油脂的合成均以葡萄糖酵解产物--磷酸烯醇式丙酮酸PEP为底物。磷酸烯醇式丙酮酸在PEPCase催化下合成草酰乙酸进入蛋白质代谢；同时磷酸烯醇式内酮酸经丙酮酸激酶催化形成丙酮酸，丙酮酸在丙酸脱氢酶复合体催化下形成乙酰Co-A，而后在脂肪酸合成限速酶乙酰Co-A羧化酶(acety-CoA carbixlase，简称ACCase)催化下合成丙二酰Co-A进入脂肪代谢。因此，所说的底物(磷酸烯醇式丙酮酸)其流向应当是由PEPCase、ACCase两类酶的相对活性决定，控制着作物籽粒蛋白质/油脂含量比率。
本发明的目的在于提供一种便于控制与操作，育种周期相对短，遗传稳定性好的利用反义基因调控作物籽粒蛋白质/油脂含量的方法，并以此提高油料作物籽粒的油脂含量。
本发明的技术解决方案其特殊之处在于包括步骤(1)克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEP)、乙酰辅酶A羧化酶基因(ACC)之一的部分片段，并将其构建成反义基因Anti-PEP、Anti-ACC之一；(2)用转基因方法将所述的反义基因导入油料作物细胞，由此改变蛋白质合成的关键酶--磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)、脂肪酸合成限速酶--乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)之一的活性，调节其生物合成的共同底物PEP的流向，从而定向改变油料作物籽粒蛋白质、油脂含量。
本发明经定向改变籽粒蛋白质、油脂含量的油料作物，经3-4世代选育，得到含纯合Anti-PEP或Anti-ACC基因的新品种(系)。
所述的克隆PEP或ACC基因片断，是根据不同油料作物的PEP或ACC序列设计引物，采用PCR法扩增其PEP或ACC基因片段，经亚克隆、转化后筛选出重组子，酶切、电泳鉴定后测序。
所述的构建反义PEP或反义ACC基因，是将所述克隆后的基因片段酶切出，电泳回收后与超级双元载体pIG121连接，连接产物转化E.coliHB101感受态细胞。
本发明所述的转基因方法，是采用农杆菌介导法、基因枪法或花粉管引入法。
本发明所述的调节蛋白质、油脂合成的共同底物--PEP的流向，是指导入反义PEP基因，抑制PEPCase的活性，相对提高ACCase的活性，使PEP更多地流向脂肪代谢，提高含油量；反之，导入反义ACC基因，则提高蛋白质含量。
本发明所述的油料作物，可以是大豆、油菜、花生等。
本发明由于在克隆PEP或ACC基因片段的基础上，构建其反义基因，用转基因方法将该反义基因导入油料作物体内从而改变蛋白质合成的关键酶--PEPCase或脂肪酸合成的限速酶--ACCase的活性，由此调节蛋白质、油脂合成的共同底物--PEP的流向，定向改变油料作物籽粒蛋白质、油脂含量。故本发明具有育种定向性好，可克服常规育种方向随机性大、育种周期长的缺陷。与正向操作方式的基因工程技术相比，本发明可克服正向方式技术难度大，目的基因在活体中表达样式复杂，农业性状难以综合优良的缺陷。本发明构建PEP反义基因--Anti-PEP，将其导入油料作物体内，可抑制PEPCase活性，相对提高ACCase活性，使PEP更多地流向脂肪代谢，从而能较大幅度地提高作物籽粒的油脂含量。
下面以油菜为例说明本发明的实施方式。
1所用材料1.1植物材料甘蓝型油菜浙油758、浙优油1号，由浙江省农科院作物研究所提供，均为当地主栽品种。
1.2菌株和质粒E.coli HB101、E.eoli JMl09、A.tumefaciensEHA101、质粒pBs SK+、超级双元载体pIGl21为浙江省农科院原子能研究所保存；1.3酶和化学试剂限制性内切酶、小牛肠碱性磷酸酶、T4-DNA连接酶购自MBI公司，Taq DNA聚合酶购自Sangon生物技术公司，DNA分子量标记λDNA/HindⅢ、DL2000分别购自华美生物技术公司及TaKaRa公司，PCR引物由Sangon生物技术公司合成，X-gal、IPTG、X-glue购自Sigma公司，随机引物标记试剂盒购自TaKaRa公司，[a-32p]dCTP购自亚辉生物工程公司。
2方法2.1基本技术菌体的培养、质粒DNA的提取、酶切、回收、连接及转化均按文献(Sambrook T，Tanaka K，Monma T.MolecularCloningA Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory apress，NewYork，1989)方法进行，油菜DNA提取采用CTAB法(汪关林，方宏筠植物基因工程原理和技术北京科学技术出版社1998，600～601)。
2.2 PEP基因片段克隆根据Yanai等(Biosci BiotechBiochem，58(5)147-159)报道的油菜PEP序列设计内外两组引物，采用PCR法扩增油菜PEP基因片段。
Primerl(5′引物)5′-GGAATCTAAAGTAAACCGGC-3′(20-mer)Primer2(5′引物)5′-CTCTCTGAATCCTTCTGTAG-3′(20-mer)Primer3(5′引物)5′-AACCGACGGCCGTGACTGTA-3′(20-mer)RCR产物经T4 DNA聚合酶补平3′末端，与经SmaI切开、小牛肠碱性磷酸酶脱磷的载体pBS SK+平端连接，连接产物用CaCl2法转化E.coli JMl09感受态细胞，在含X-gal/IPTG的Amp平板上筛选重组子。重组子经酶切、电泳鉴定，并用Sanger的末端终止法在ABI公司370测序仪上进行测序。
2.3反义PEP基因的构建成选择Xbal位点来定向。将克隆在pBSSK+上的PEP基因片段用EcoRⅠ和Xbal双酶切出，用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收所需片段，与SmaⅠ和Xbal完全酶解的超级双元载体pIG121连接，连接产物转化E.coli HB101感受态细胞，同样进行筛选。
2.4油菜的转化及植株再生油菜的转化采用农杆菌介导法，在甘蓝型油菜两个品种浙油758、浙优油1号上进行重复试验。从E.coliHB101提取构建好的带反义PEP基因的超级双元载体pIG121，用电击法导入根癌农杆菌EHA 101，用该农杆菌感染经8～10天培养的油菜无菌苗下胚轴，共培养2天后，转至含500mg/L羧苄青霉素(Cb)的MS培养基上，一周后转到含500ml/L Cb和10ml/L潮霉素(hgr)的MS分化培养基上进行抗性筛选。分化的抗性芽在含相同抗生素的生根培养基中生根并长成完整小植株，转入自行设计的专利产品“吸水式组合水培罐”炼苗，移栽至土壤成为正常植株。
2.5转基因油菜的鉴定PCR检测提取再生植株总DNA，以此为模板，用GUS基因5′、3′端引物进行PCR反应。Primer4(5′引物)5′-CGTAAGGGATGACGCACAAT-3′(20-mer)，Primer5(3′引物)5′-CGCAAGACCGGCAACAGG-3′(18-mer)。
Southern杂交再生植株总DNA经EcoRⅠ完全酶解后进行Southern杂交。DNA探针为超级双元载体pIG121中只带GUS基因的DNA片段，按TaKaRa公司随机引物标记试剂盒说明书进行标记。
GUS检测按Jefferson方法(Jefferson R A.Assaying Chimeric Genesin Plantsthe GUS Gene Fusion System.Plant Mol.Rep.，1987，5387～405)进行。
2.6转基因油菜种子蛋白质、油脂含量的测定及蛋白质SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)
T1代种子油脂含量测定采用索氏抽提(残余法)。1998年浙油758转基因油菜T1代种子含油量由浙江省粮油产品质量监督站测定。第二年度浙油758转基因油菜T2代种子含油量由浙江省农科院农作物品质改良基因工程实验室自行测定。1999年浙优油1号转基因油菜T1代种子含油量由农业部油料及制品质量监督检验测试中心测定。
T1代种子蛋白质含量测定采用凯氏定氮法(张龙翔，张庭芳，李令媛，生化实验方法和技术，北京高等教育出版社，1981，55～59)。由农业部油料及制品质量监督检验测试中心测定。
T1代种子蛋白质SDS-PAGE(1)样品制备种子磨碎，称取100mg，加入100μl抽出液(1％SDS，5％β-巯基乙醇水容液)，提取10′，10000rpm离心15′，取上清液，加同量的试液(4％SDS，10％β-巯基乙醇，20％甘油，0.01％溴酚兰，0.004MpH 6.8Tris-HCL)，100℃，1′。(2)电泳按文献(朱广廉，杨中汉，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量，植物生理学通讯，1982(2)，43～47)方法，采用10％浓度凝胶。
3、步骤与结果3.1 PEP基因片段的克隆根据上述Yanai等公布的油菜PEP基因序列，设计内外两组引物，先用外侧引物(Primer，Primer3)扩增到了约610bp的DNA片段，再以此为模板，用内侧引物(Primer2，Primer3)扩增到了一个530bp的DNA片段，与预期片段长度相符。扩增片段经T4DNA聚合酶补平3′端，用平端克隆法克隆至载体pBS SK+，转化E.coli JM 109感受态细胞。重组子在含Amp、X-gal/IPTG的选择平板上37℃生长过夜，挑取白色菌落提取质粒，经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，并电泳检测。选择克隆片段长度正确的重组子进行DNA测序，其中重组子pPEP8的外源DNA片段序列与报道的油菜PEP基因相应的序列完全一致，作为进一步工作之用。
3.2反义PEP基因超级双元载体的构建选择Xbal位点定向。在从pPEP8质粒中分离PEP基因片段时，先用内切酶EcoRⅠ进行酶切，将酶切产物的5′粘性末端用T4-DNA聚合酶补平，再用Xbal酶切3′末端。同理，用内切酶SmaⅠ切开载体pIG121产生平端，然后用Xbal酶切其3′末端。用T4DNA聚合酶将这两个片段连接。这样构建的重组质粒保证了PEP基因片段位于CaMV 35S启动子下游、GUS报告基因下游，并与35S启动子反向连接。
重组质粒转化E.coli HB101感受态细胞，筛选出阳性重组子，碱法提取质粒，用酶切法鉴定，得到含反义PEP基因超级双元载体pPEPA5。用电击法导入根癌农杆菌EHA101。
3.3油菜的转化及植株再生载体pIG121带有由35S启动子驱动的GUS基因和潮霉素抗性基因及NOS启动子驱动的NPTⅡ基因，因此转基因油菜植株可用潮霉素进行筛选，并可通过GUS基因的检测来判断外源基因的整合。以生长8天的油菜无菌苗下胚轴为转化反义PEP基因的受体，用生长至对数期的农杆菌EHA101/pPEPA5感染外植体，共培养2d后，转至含500mg/L羧苄青霉素(Cb)的MS培养基上，一周后转到含500mg/L Cb和10mg/L潮霉素(hgr)的MS分化培养基上进行抗性筛选。经3～4周的培养，下胚轴两端长出小愈伤，并逐渐产生绿色的抗性芽和白色的非抗性芽。待芽长至1cm高，转入含相同抗生素的生根培养基，2周后出根长成完整小植株。将小植株移至自行设计的专利产品“吸水式组合水培罐”炼苗后，移栽入土中，植株可进一步生长，发育并产生种子。
利用农杆菌介导的方法将反义PEP基因导入油菜基因组，已两年在两个当地主栽品种浙油758和浙优油1号上获得了成功，得到了若干批转化植株，具有良好的重演性，已建立起高效油菜转基因体系。
3.4转基因油菜的鉴定转基因油菜的PCR检测PCR方法可以快速地测定外源基因在转化再生植株中的整合。由于油菜本身带有内源PEP基因，因此，在用PCR或Southern方法检测转基因植株时，不能用PEP基因本身的序列来设计引物或探针。本发明采用GUS报告基因的两端引物来进行PCR扩增，转基因植株扩增出了与含反义PEP基因的重组质粒PEPA5扩增片段相同分子量的条带，而对照植株未扩增出相应条带。
转基因油菜的Southern杂交分析用超级双元载体pPEPA5的SalⅠ2.0kb片段(GUS基因片段)作探针与转基因再生植株的DNA杂交，得到一条大小约8.8kb的杂交带。
转基因油菜的GUS活性检测取转基因油菜的叶片、根尖进行GUS组织化学测定，转基因菜的叶片和根尖呈GUS兰色反应，而对照无兰色反应。
以上分子鉴定结果表明，外源基因已整合至油菜基因组并稳定表达。由于反义PEP基因位于35S启动子与GUS基因之间，因此，证明反义PEP基因已导入油菜且得到了稳定表达。
3.5转基因油菜种子蛋白质、油脂含量的测定及蛋白质SDS-PAGE电泳浙油758含油量测定1998年经浙江省粮油产品质量监督检验站测定，转基因油菜T1代单株种子含油量平均比对照提高6.4％，其中一单株含油量比对照提高15.15％。1999年转基因油菜T2代种子含油量产生分离，其分布情况呈现出明显的剂量效应。双剂量、单剂量及空白剂量的单株分别为8株、29株和13株，其比例基本符合孟得尔遗传1∶2∶1的分离规律。
浙优油1号油脂及蛋白质含量测定1999年从75份转基因油菜T1代种子中选取9个单株的种子及其亲本对照的4个单株的种子，经农业部油料及制品质量监督检验测试中心测定，结果见表1。转基因植株种子含油量平均为48.63％±1％，蛋白质含量平均为22.80％±0.64％，对照平均含油量为41.67％±0.95％，蛋白质含量平均为24.11％±0.08％。转基因植株含油量平均比对照提高16.7％，其中一株含油量达49.54％，比对照平均值提高18.89％。对种子的油脂、蛋白质含量进行回归分析，得直线回归方程y=32.36-0.2x(x为油脂含量，y为蛋白质含量)，r=0.82**，表明种子油脂含量与蛋白质含量呈显著负相关。
表1浙优油1号转基因油菜种子蛋白质、油脂含量
(注以上数据由农业部油料及制品质量监督检验测试中心检测)浙优油1号T1代种子蛋白质SDS-PAGE SDS-PAGE结果显示，转基因植株与对照之间种子贮藏蛋白质种类无明显差异；随着各单株种子蛋白质含量高低的不同，其主要贮藏蛋白质条带浓度差异有较显著，而非主要贮藏蛋白质之间无显著差别。
权利要求
1.利用反义基因调控籽粒蛋白质/油脂含量的方法，其特征是包括步骤(1)克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEP)、乙酰辅酶A羧化酶基因(ACC)之一的部分片段，并将其构建成反义基因Anti-PEP、Anti-ACC之一；(2)用转基因方法将所述的反义基因导入油料作物细胞，由此改变蛋白质合成的关键酶--磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)、脂肪酸合成限速酶--乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)之一的活性，调节其生物合成的共同底物PEP的流向，从而定向改变油料作物籽粒蛋白质、油脂含量。
2.如权利要求1所述的利用反义基因调控籽粒蛋白质/油脂含量的方法，其特征是所述的经定向改变籽粒蛋白质、油脂含量的油料作物经3-4世代选育，得到含纯合Anti-PEP或Anti-ACC基因的新品种(系)。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征是克隆PEP或ACC基因片段，是根据不同油料作物的PEP或ACC序列设计引物，采用PCR法扩增其PEP或ACC基因片段，经亚克隆、转化后筛选出重组子，并经酶切、电泳和DNA序列测定验证。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征是构建反义PEP或反义ACC基因是将所述克隆后的基因片段酶切出，电泳回收后与超级双元载体pIG121连接，连接产物转化E.coli HB101感受态细胞。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征是所述的转基因方法，采用农杆菌介导法、基因枪法或花粉管导入法。
全文摘要
利用反义基因调控籽粒蛋白质/油脂含量的方法,包括:(1)克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因或乙酰辅酶A羧化酶基因的部分片段,并将其构建成反义基因;(2)用转基因法将所述反义基因导入油料作物细胞,改变蛋白质合成的关键酶—磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或脂肪酸合成限速酶—乙酰辅酶A羧化酶的活性,调节其生物合成的共同底物PEP的流向,从而定向改变籽粒蛋白质、油脂含量。本发明可用来定向调控油料作物籽粒蛋白质/油脂含量。
文档编号C12N15/82GK1295130SQ9912451
公开日2001年5月16日 申请日期1999年11月9日 优先权日1999年11月9日
发明者陈锦清, 朗春秀, 黄锐之, 胡张华, 刘智宏 申请人:浙江省农业科学院