基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法
【专利摘要】本发明涉及一种生物技术领域的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，包括如下步骤：构建表达免疫毒素中具有导向功能的多肽和具有毒性功能的多肽的载体DNA片段，将所述两种多肽的载体DNA片段与内含肽的N端或C端分别连接，形成融合表达载体；取步骤一所述的融合表达载体，表达，得到融合内含肽N端的融合多肽A以及融合内含肽C端的融合多肽B；取融合多肽A和融合多肽B，混合，在内含肽对应的反式剪接条件下，诱导，得到免疫毒素。本发明的方法只需要制备不同的导向部分多肽以及毒性部分多肽，就可以将其进行组合，进而产生可以针对不同靶点及拥有不同毒性机制的免疫毒素，具有显著的多样性及灵活性。
【专利说明】
基于内含化的药用重组蛋白的合成方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种生物技术领域的药用重组蛋白的合成方法，具体地讲，设及一种 基于内含肤的药用重组蛋白的合成方法。
【背景技术】
[0002] 免疫毒素是一种融合蛋白，包含导向多肤部分，毒性多肤部分，和/或接头多肤部 分。自从单克隆抗体于1957年被Kohlor应用杂交瘤技术首次制备出来，其就在医学研究W 及疾病的临床诊断和治疗领域展示出了广阔的应用前景。长期W来，人们致力于利用单克 隆抗体治疗多种疾病，例如肿瘤、自身免疫疾病等等，然而单独使用单克隆抗体的效果有时 并不理想。为了达到更有效的治疗效果，人们将一些具有细胞毒性的蛋白与单抗结合，形成 了具有选择性杀伤与之相结合的细胞的"免疫毒素"，为疾病的祀向治疗的弹药库装备了新 的弹药。
[0003] 免疫毒素Qmmunotoxins，ITs)是指将具有导向功能的蛋白与毒素蛋白相结合而 产生的一种蛋白分子。其中具有导向性功能的部分主要负责引导免疫毒素蛋白分子与祀细 胞的特异性结合，而毒素蛋白部分则主要是起到对细胞进行杀伤的作用。
[0004] 从免疫毒素发展演变的进程来看，免疫毒素的制备生产主要有化学偶联法和重组 表达法两大类。化学偶联法制备免疫毒素首先需要单独制备抗体和毒素，随后通过化学偶 联的方式将二者相连而制得免疫毒素。化学偶联法的偶联效率低，生产成本较高，且由于蛋 白上可能发生偶联反应的位点众多而导致产品均一性差，另外偶联的化学键在体内循环时 倾向于降解，使得裸毒素泄露而导致非特异性毒性，有较大的毒副作用风险，而降解产生的 裸抗体则可能封闭抗原，使得治疗效果不佳。而随着基因工程的发展，使得免疫毒素的制备 生产进入了新的时代。人们利用基因重组技术将编码导向功能多肤的基因与编码毒素多肤 的基因相融合并在适当的表达系统中进行表达。采用运一技术方案生产的免疫毒素我们可 W称之为基因工程免疫毒素，它相比化学偶联法制造的免疫毒素而言在产品均一性和稳定 性上有了大幅提高，并且使得大量生产免疫毒素成为可能。但基因工程法生产免疫毒素也 有其局限性:融合基因被限制在单一宿主中进行表达，而构成免疫毒素的导向部分和毒性 部分往往需要不同的宿主表达环境运一矛盾往往导致采用单一的宿主表达目的免疫毒素 不能获得很好的产量、收率、纯度W及随之而来的成本的提高。例如目前多采用大肠杆菌表 达系统表达单链抗体免疫毒素，由于免疫毒素的导向部分在大肠杆菌表达系统中不能很好 的折叠而往往形成包涵体，而包涵体的复性是一个非常复杂的过程，一般来说，蛋白质的复 性效率在20%左右;而毒素蛋白对真核细胞具有致命毒性，若采用真核表达系统则可能对 宿主细胞产生毒害，但是也有研究人员对利用真核表达系统表达免疫毒素做了大量的工 作，如专利CN1863921公开了一种在毕赤酵母W及EF-2突变型毕赤酵母中表达免疫毒素的 方法，虽然采用分泌表达的方式在毕赤酵母W及EF-2突变型(毒素免疫型)毕赤酵母表达系 统中成功表达了免疫毒素，较长的发酵周期获得的较低的产量相比于原核表达系统而言并 不具备竞争力，且毒素蛋白上的糖基化位点可能被宿主进行糖基化修饰，有可能引入产品 不均一性;文献披露了一种在EF-2突变型的C册细胞中表达免疫毒素的方法，该方法同样遭 遇了表达量低下、发酵周期长、成本高昂W及潜在的糖基化的风险（Protein expression and purification,2000,19(2):304-311)〇
[0005] 内含肤是指存在于前体蛋白当中的一段序列，在前体蛋白转化为成熟蛋白质的过 程中，依靠自剪接功能将内含肤两端的外显肤W肤键连接，同时将自身从前体蛋白中释放 出来。内含肤从结构和功能上可W分割为N端和C端，当N端或C端单独存在时不能发生剪接 反应，而只有当N端和C端在适合剪接的条件下接触时才能发生剪接反应。断裂内含肤可W 是人为地将连续内含肤从适当位置断开成两个多肤片段，也可W是天然存在的。天然断裂 内含肤是一类由两个分别转录和表达的基因编码的两个多肤片段，运些断裂内含肤在接触 时会自组合并W反式剪接方式催化外显肤的连接。内含肤在生物技术应用中应用广泛，包 括使用内含肤的剪接活性介导蛋白质连接（intein-mediated protein ligation, I化）、蛋 白质环化、蛋白质标记、毒性蛋白表达、引入非天然氨基酸、研究体内蛋白质互作等。利用内 含肤及其变体介导蛋白质纯化并在大规模蛋白质生产中应用也日益受到关注。因此，本领 域需要提供一种通用、易于操作、成本低廉获取融合免疫毒素的方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于内含肤的药用重组蛋白的 合成方法。本发明克服现有的利用化学偶联或融合表达方法制备免疫毒素技术中产品不均 一、操作步骤多、目的蛋白对表达宿主有毒性等等不足，提供一种分别制备具有导向功能的 多肤和具有细胞毒性的多肤并利用内含肤的反式剪接功能将其连接在一起，从而得到免疫 毒素的方法。
[0007] 本发明是通过W下的技术方案实现的，本发明设及一种基于内含肤的药用重组蛋 白的合成方法，所述方法包括如下步骤：
[0008] 步骤一，构建表达免疫毒素中具有导向功能的多肤和具有毒性功能的多肤的载体 DNA片段，将所述两种多肤的载体DNA片段与内含肤的N端或C端分别连接，形成融合表达载 体;其中，所述含有内含肤N端的融合表达载体与含有内含肤C端的融合表达载体所表达的 多肤需成对存在，W使得反式剪接反应能够发生；
[0009] 步骤二，取步骤一所述的融合表达载体，分别在合适的宿主细胞中进行表达，得到 融合内含肤N端的融合多肤AW及融合内含肤C端的融合多肤B;
[0010] 步骤=，取融合多肤A和融合多肤B，混合，在内含肤对应的反式剪接条件下，诱导 免疫毒素的导向功能的多肤W及具有毒性功能的多肤部分进行反式剪接，得到免疫毒素。
[0011] 优选地，步骤一中，所述内含肤为人工断裂内含肤、或天然断裂内含肤，或具有剪 接功能的内含肤突变体。
[0012] 优选地，步骤一中，所述内含肤为Ssp DnaB、Ssp化aE或化U DnaEo
[OOU]优选地，步骤一中，所述内含肤N端的C末端或C端的N末端还融合有功能性多肤。
[0014] 优选地，所述功能性多肤为MBP或化抓标签蛋白。
[0015] 优选地，步骤一中，所述融合表达载体的构成为导向功能多肤-内含肤N端、或内含 肤C端-毒性功能多肤，或毒性功能多肤-内含肤N端、或内含肤C端-导向功能多肤，或导向功 能多肤-内含肤N端-功能多肤、或功能多肤-内含肤C端-毒性功能多肤，或毒性功能多肤-内 含肤N端-功能多肤、功能多肤-内含肤C端-导向功能多肤。
[0016] 优选地，步骤一中，所述具有导向功能的多肤为抗体、单链抗体scFv、二硫键稳定 抗体dsFv、二硫键稳定单链抗体dsscFvJab抗体、细胞因子、或生长因子。
[0017] 优选地，步骤一中，所述具有毒性功能的多肤为RIP型毒素;具体为藍麻毒素、ADP 核糖基化免疫毒素，白喉毒素、或绿脈杆菌外毒素部分的融合蛋白，或具有毒素生物活性的 突变体。
[0018] 优选地，步骤二中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
[0019] 优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽抱杆菌、高扩酵母细胞、昆虫细胞、植物 细胞、哺乳动物细胞、酵母、中国仓鼠卵巢细胞、或人肾胚细胞。
[0020] 优选地，步骤=中，还包括分离纯化进而获得免疫毒素的步骤。
[0021] 优选地，所述分离纯化的方法为亲和层析方法、离子交换层析方法、或疏水作用层 析方法。
[0022] 优选地，步骤=中，所述反式剪接条件为能够触发指定内含肤完成自剪接的条件。
[0023] 优选地，当内含肤为化U Dn址时，反式剪接条件为：0-55°C，pH为3-11，接触时间 ls-60h，终浓度为0.0 SmM-I OOmM的亲核试剂。
[0024] 优选地，所述亲核试剂为DTT，DTE，CYSTEI肥，TCEP，或MESNA亲核性试剂。
[0025] 本领域技术人员进一步知晓，本发明的制备方法中，步骤一中，所述的内含肤是具 有自剪接功能的内含肤，可为野生型或可包含相对于野生型的变异，优选为具有反式剪接 功能的内含肤，如人工断裂内含肤、天然断裂内含肤，优选为天然断裂内含肤，如Ssp DnaB、 Ssp化aE或化U化址，优选为化U DnaE;在设及利用内含肤的剪接功能的实施方案中，内含 肤与目的蛋白之间的接头可W包含天然外显肤序列。本文中所用术语"外显肤"是指天然发 现的、与内含肤或内含肤结构域邻近的序列，例如对应野生型化U化址，C端外显肤可W是 CFNAS、CFNK，CFN，CF，C。步骤一中，所述的毒性功能多肤可W包括RIP型毒素如藍麻毒素、 ADP核糖基化免疫毒素，如白喉毒素、绿脈杆菌外毒素部分的融合蛋白等。毒素部分可W为 截短型（truncated)部分和/或可包含相对于野生型毒素的变异。步骤一中，所述的表达载 体是本领域技术人员已知的各种表达载体或其修改变体，本领域技术人员可根据常规手段 来获得编码目标多肤的DNA分子，并通过本领域熟知的各种方法，将其与所述的表达载体中 表达调控序列相连;步骤一中，所述的免疫毒素中具有导向功能的多肤可W是抗体、单链抗 体scFv、二硫键稳定抗体dsFv、二硫键稳定单链抗体dsscFv、Fab抗体、细胞因子、生长因子 等本领域技术人员所熟知的具有免疫亲和吸附能力的多肤，本领域技术人员可W根据祀细 胞，选择在免疫毒素中使用何种多肤。
[0026] 步骤二中，所述宿主细胞可W包括原核细胞和真核细胞，例如常用的原核宿主细 胞大肠杆菌、枯草芽抱杆菌等等，常用的真核宿主细胞高扩酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、 哺乳动物细胞等。本发明中所述的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、酵母、中国仓鼠卵巢细 胞、人肾胚细胞等。本领域技术人员熟知，用表达载体转化/转染宿主细胞的方法有很多种， 所用的转化方法和转化程序取决于待转化的宿主。例如原生质体融合、电穿孔、脂质体介导 转染、阳离子介导转染等;在适合目的多肤表达的条件下，培养转化/转染获得的宿主细胞， 随后根据目的多肤的性质W及定位，可W选择本领域技术人员熟知的各种蛋白纯化步骤， 如亲和层析（包括但不限于Protein AJroteinGProtein L、IMAC等）、疏水作用层析、离子 交换层析、透析等分离纯化手段。
[0027] 步骤=中，所述的分离纯化可采用常规的蛋白纯化步骤。步骤=中，混合是指将一 种物质置于与另一种物质发生物理关联的条件下接触。
[0028] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:传统生产免疫毒素的技术方法中 存在诸多不足之处，如化学偶联法中需要加入化学试剂，由于导向多肤部分中修饰位点较 多而导致的产品不均一，同时化学偶联键容易断裂而导致毒性渗漏等;而直接表达免疫毒 素融合蛋白的策略中，若采用原核表达系统，则目的蛋白往往W包涵体形式存在，复性效率 低且步骤繁琐过程复杂，若采用真核表达系统则免疫毒素的表达可能受限于其对宿主细胞 存在的天然毒性。本发明的方法则克服了在免疫毒素生产的传统策略中存在的不足，实现 了意想不到的技术效果：
[0029] 1、本发明的方法只需要制备不同的导向部分多肤W及毒性部分多肤，就可W将其 进行组合，进而产生可W针对不同祀点及拥有不同毒性机制的免疫毒素，具有显著的多样 性及灵活性；
[0030] 2、本发明的方法中，导向部分多肤和毒性部分多肤可W在适当的宿主细胞中分开 表达，如需要特殊的折叠环境，特别是高级的翻译后修饰，可W在哺乳动物细胞中进行表 达，而没有太多修饰需求的多肤可W在大肠杆菌中进行表达，在适合的表达系统中分别表 达目的多肤可W获得较高的产量、收率W及纯度；
[0031] 3、本发明的方法中，导向部分多肤和毒素部分多肤的连接是位点特异性的，不会 生产副产物，得到的产物产品均一性高；
[0032] 4、本发明的方法中，导向性部分多肤和毒素部分多肤经由内含肤的自剪接，是由 肤键连接在一起，相比于化学偶联法等连接方式具有良好的稳定性；
[0033] 5、本发明的方法中，自剪接反应条件溫和、反应高效，易于与其他工艺进行整合、 放大;反应过程无需加入有毒有害作用物质。
【附图说明】
[0034] 通过阅读参照W下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0035] 图1为本发明的利用内含肤制备免疫毒素的方法的实施例1中用SDS-PAGE检测经 过Ni-S巧harose层析柱纯化的融合蛋白化-PE3K呢L的结果示意图。
[0036] 图2为本发明的利用内含肤制备免疫毒素的方法的实施例1中用SDS-PAGE检测经 过Ni-Sepharose层析柱纯化的融合蛋白dsscFv CD22-Nn-Fc的结果示意图。
[0037] 图3为本发明的利用内含肤制备免疫毒素的方法的实施例1中用Western Blot检 测dsscFv CD22-Nn-Fc与化-PE38KDEL反式剪接生成dsscFv CD22-PE38K呢L的结果示意图。
[0038] 图4为本发明的利用内含肤制备免疫毒素的方法的实施例2中用SDS-PAGE检测经 过Protein L层析柱纯化的融合蛋白化b-化的结果示意图。
[0039] 图5为本发明的利用内含肤制备免疫毒素的方法的实施例2中用SDS-PAGE检测 化b-化与化-PE38KDEL反式剪接生成化b-PE38K呢L的结果示意图。
[0040] 图6为本发明的利用内含肤制备免疫毒素的方法的实施例3用Western Blot检测 Herceptin-化与化-PE38KDEL反式剪接生成Here巧tin-PE38K呢L的结果示意图。
[0041 ]图7为实施例中设及表达质粒的结构图。
【具体实施方式】
[0042]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条 件，例如萨姆布鲁克等分子克隆：实验手册第=版(科学出版社，2002)中所述的条件，或者 按照各制造商所建议的条件。
[00创 实施例1、利用化U DnaE的反式剪接功能制备免疫毒素 dsscFv CD22-PE38KDEL
[0044] 1、构建融合了断裂内含肤化U DnaE C端的毒性多肤表达载体pET-28a( + )-Nc- PE38KDEL
[0045] 利用表中引物分别克隆编码PE38KD化毒素的基因W及化U Dn址的C端基因，采用 I^KaRa公司的PrimerStar Max进行扩增，PCR条件为94°C IOs，55°C IOs，72°C IOs，30个循环， 将得到的片段琼脂糖凝胶电泳回收后利用重叠PCR将编码化U DnaE的C端基因与编码 PE38KD化的基因按化U Dn址的C端在融合多肤N端的顺序合成，PCR条件为94°C10s，55°C IOs，72°C 10s，30个循环，将此基因片段用NdeI和NotI处理，并与同样经过Nde巧日NotI处理 的祀T-28a( + )进行连接，质粒结构图如图7所示。将连接产物转化大肠杆菌D册a感受态细 胞，将转化细胞涂布于含50yg/mL卡那霉素的琼脂平板培养过夜。挑取平板上长出的单克 隆，于5mL含50iig/mL卡那霉素的LB培养基中震荡培养过夜，并提取质粒，对其进行测序，:J则 序结果表明所构建的化-PE38KD化序列正确。
[0046] 表 1
[0047]
[0048] 2、融合蛋白化-PE38K呢L的表达和纯化
[0049] 将测序正确的质粒转化进大肠杆菌表达菌株化21感受态中，37°C过夜培养出单菌 落后，挑单菌落于含50iig/mL卡那霉素的5ml LB培养基中37°C，180rmp，过夜培养。
[(K)加]取5ml培养液加入500ml含50iig/mL卡那霉素的新鲜LB培养基中，37°C培养至0D600 为0.6-0.8时加入终浓度为0.2mM的IPTG，在30 °C下诱导16h后，400化pm离屯、IOmin收集菌 体。
[0化1] 将收集的菌体用结合缓冲液(20mM PBS、500mM化ClJOmM咪挫、pH7.5,每Ig菌体 用20ml结合缓冲液)重悬，高压均质机破碎菌体，4 °C下1200化pm离屯、30min，收集上清，上清 用0.45皿过滤，准备用Ni化NTA进行纯化。
[0052]装填Ni2+重力柱，柱床体积1ml，用5倍柱体积水洗之后用10倍柱体积结合缓冲液 (20mM PBS、SOOmM化Cl、20mM咪挫、pH7.5)平衡，将收集到的上清上柱，流速为Iml/min，上 柱完毕后，用5倍柱体积的Binding Buffer冲洗，随后用10倍柱体积包含60mM咪挫的洗脱缓 冲液(20mM PBS、500mM NaCl、60mM咪挫、PH7.5)冲洗非特异性结合蛋白，随后用10倍柱体积 150mM咪挫的洗脱缓冲液(20mM PBS、SOOmM化Cl、150mM咪挫、pH7.5)洗脱，分管收集，每管 Iml，SDS-PAGE检测洗脱情况，合并目标蛋白，得到融合蛋白NC-PE38K呢L。图1为本发明的利 用内含肤制备免疫毒素的方法的实施例1中用SDS-PAGE检测经过Ni-Sepharose层析柱纯化 的融合蛋白化-PE3K呢L的结果示意图。
[0053] 3、构建融合了断裂内含肤化U DnaE N端的CD22抗体表达载体祀T-22b( + )-dsscFv CD22-Nn-Fc
[0054] 利用表2中引物分别克隆化U Dn址的N端基因W及人IgG的化片段，采用TaKaRa公 司的PrimerStar Max进行扩增，PCR条件为94°C 10s，55°C 10s，72°C 10s，30个循环，将得 到的片段琼脂糖凝胶电泳回收后利用重叠PC时尋按照化U DnaE N端-Fe片段的顺序将扩增 得到的片段进行合成，PCR条件为94°C 10s，55°C 10s，72°C10s，30个循环，将此基因片段用 BamHI和NotI处理，并与同样经过BamH巧日NotI处理的携带dsscFv CD22的祀T-22b( + )进行 连接，融合基因顺序为dsscFv CD22-Nn-Fc。
[0055] 将连接产物转化大肠杆菌D册a感受态细胞，将转化细胞涂布于含50iig/mL氨节青 霉素的琼脂平板培养过夜。挑取平板上长出的单克隆，于5mL含50yg/mL氨节青霉素的LB培 养基中震荡培养过夜，并提取质粒，对其进行测序，测序结果明所构建的dsscFv CD22-Nn- Fc序列正确。图2为本发明的利用内含肤制备免疫毒素的方法的实施例1中用SDS-PAGE检测 经过Ni-Sepharose层析柱纯化的融合蛋白dsscFv CD22-Nn-Fc的结果示意图。
[0化6] 表2
[0化7]
[0化引 4、融合蛋白dsscFv-Nn-Fc的表达与纯化
[0059] 将测序正确的质粒转化进大肠杆菌表达菌株化21感受态中，37°C过夜培养出单菌 落后，挑单菌落于含50iig/mL氨节西林的5ml LB培养基中37°C，180rmp，过夜培养。
[0060] 取5ml培养液加入500ml含50yg/mL氨节西林的新鲜LB培养基中，37°C培养至0D600 为0.6-0.8时加入终浓度为0.02111]\1的1?了6，在25°(：下诱导1611后，4000巧111离屯、10111111收集菌 体。
[0061 ] 将收集的菌体用结合缓冲液(20mM PBS、500mM化ClJOmM咪挫、PH7.5,每Ig菌体 用20ml结合缓冲液)重悬，高压均质机破碎菌体，4 °C下1200化pm离屯、30min，收集上清，上清 用0.45皿过滤，准备用Ni2+NTA进行纯化。
[0062] 装填Ni2+重力柱，柱床体积1ml，用5倍柱体积水洗之后用10倍柱体积结合缓冲液 (20mM PBS、SOOmM化Cl、20mM咪挫、pH7.5)平衡，将收集到的上清上柱，流速为Iml/min，上 柱完毕后，用5倍柱体积的Binding Buffer冲洗，随后用10倍柱体积包含60mM咪挫的洗脱缓 冲液(20mM PBS、500mM NaCl、60mM咪挫、PH7.5)冲洗非特异性结合蛋白，随后用10倍柱体积 150mM咪挫的洗脱缓冲液(20mM PBS、SOOmM化Cl、150mM咪挫、pH7.5)洗脱，分管收集，每管 Iml，SDS-PAGE检测洗脱情况，合并目标蛋白，得到融合蛋白dsscFv-Nn-Fc。
[0063] 5、利用化U DnaE的反式剪接制备dsscFv CD22-PE38KDEL
[0064] 将步骤2得到的融合多肤NC-PE38邸化与步骤4得到的融合多肤dsscFv CD22-Nn- Fc W摩尔比I: I进行混合，并加入终浓度为ImM的DTT，于25°C下保溫60min，取样品进行SDS- PAGEW及Western Blot检测。图3为本发明的利用内含肤制备免疫毒素的方法的实施例1中 用Western Blot检测dsscFv CD22-Nn-Fc与NC-PE38KDEL反式剪接生成dsscFv CD22- 阳38K呢L的结果示意图。
[0065] 6、经由化U DnaE反式剪接产生的dsscFv CD22-PE38邸化的分离纯化
[0066] 利用Ni2^NTA去除步骤5中为发生反式剪接反应的融合多肤W及反式剪接说产生的 副产物来纯化dsscFv CD22-PE38KDEL。
[0067] 装填Ni2+重力柱，柱床体积1ml，用5倍柱体积水洗之后用10倍柱体积结合缓冲液 (20mM PBS、SOOmM化Cl、20mM咪挫、pH7.5)平衡，将步骤5得到的反应体系上柱，流速为Iml/ min,收集流穿，上柱完毕后，用5倍柱体积包含40mM咪挫的洗脱缓冲液（20mM PBS、500mM 化Cl、40mM咪挫、pH7.5)冲洗，随后用IO倍柱体积包含150mM咪挫的洗脱缓冲液(20mM PBS、 SOOmM化Cl、150mM咪挫、pH7.5)冲洗，SDS-PAGE检测收集的蛋白样品，依需要，可冷冻和在- 20°C或-80°C保存，或者用于更高纯度的纯化，例如离子交换层析，疏水层析，W及分子排阻 层析等。
[006引 实施例2、利用化U化aE的反式剪接功能制备免疫毒素化r Fab-PE38KDEL
[0069] 1、构建融合了断裂内含肤化U DnaE N端的Her VH-CHl表达载体pCEP4-Her VH- CHl-Nn
[0070] 利用表3中引物分别克隆编码化rceptin重链VH-CHl部分的基因W及化U化aE的N 端基因，采用TaKaRa公司的PrimerStar Max进行扩增，PCR条件为94°C IOs，55° ClOs，72°C 10s，30个循环，将得到的片段琼脂糖凝胶电泳回收后利用重叠PCR将编码化rceptin重链 VH-CHl部分的基因与编码化U DnaE的N端基因化U化址的N端在融合多肤C端的顺序合成， PCR条件为94°C IOs，55 °C IOs，72 °C IOs，30个循环，将此基因片段用HindII I和BamHI处理，并 与同样经过化ndn I和BamHI处理的pCEP4进行连接，质粒结构图7如图所示。
[0071] 将连接产物转化大肠杆菌D册a感受态细胞，将转化细胞涂布于含50iig/mL氨节西 林的琼脂平板培养过夜。挑取平板上长出的单克隆，于5mL含50yg/mL氨节西林的LB培养基 中震荡培养过夜，并提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所构建的化r VH-CHl-Nn序列 正确。
[0072] 表 3
[0073]
[0074] 2、构建Herceptin轻链的表达载体pCEP4-Her LC
[00对利用表4中引物分别克隆编码Hercept in轻链的基因，采用TaKaRa公司的 PrimerStar Max进行扩增，PCR条件为94°C IOs，55°C IOs，72°C IOs，30个循环，将得到的片段 琼脂糖凝胶电泳回收后用HindHI和BamHI处理，并与同样经过化ndIII和BamHI处理的 PCEP4进行连接，质粒结构图7如图所示。
[0076]将连接产物转化大肠杆菌D册a感受态细胞，将转化细胞涂布于含50iig/mL氨节西 林的琼脂平板培养过夜。挑取平板上长出的单克隆，于5mL含50yg/mL氨节西林的LB培养基 中震荡培养过夜，并提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所构建的化r LC序列正确。 [0077]表 4 [007引
[0079] 3、融合多肤化r Fab-化的表达与纯化
[0080] 本实施例中利用HEK293-E系统中的瞬时表达系统表达融合多肤化r Fab-化。
[0081 ]用SFM4皿K293培养基化yClone)和Gibco Freestyle 293培养基（Gibco)Wl = I的 比例，添加10化g/ml遗传霉素(geneticinKGibco)培养皿K293-E细胞(表达邸病毒核抗原 的人胚肾细胞系293;美国典型培养物中屯、，保藏号ATCC#C化-10852，Lot.959218)，转染前 一天用新鲜培养基将细胞稀释至1.5-2.5 X IO6个细胞/ml，W37°C，120巧m，5%C02培养，W 待次日转染。
[0082] 转染当日，按照每106个细胞用0.化g DNA的用量，等质量比混合PCEP4-化r VH- CHl-化和pCEP4-Her LC，用Gibco Freestyle 293培养基稀释DNA至（40ngAiL)，DNA:PEI = 1:3加入混匀的DNA中室溫解育20min备用。同时1000巧m 5min离屯、收集细胞，经Gibco Freestyle 293培养基洗涂细胞1次，1000 rpm 5min离屯、收集细胞，用150ml Gibco Freestyle 293培养基重悬细胞至细胞密度为4 X IO6个细胞/ml置于新的IL摇瓶(Coming) 中。
[0083] 将解育的DNA-PEI复合物加入细胞中，37°C，110巧m，5%C02转染4小时，随后加入 等体积预热的SFX4皿K293培养基，添加100μg/ml遗传霉素(geneticinKGibco)继续37°C， 13化pm，5 % C02培养10天。直接收集上清纯化或者收集上清-80°C冷冻保存。
[0084] 所收集的上清用PBS(20mMPBS，150mM化Cl，pH6.8-7.4)l:l混合，上到预先用 PBS平衡完毕的Protein L(蛋白L)亲和层析柱，上样完毕用5倍柱体积的PBS洗涂，用P册.0 的IOOmM巧樣酸缓冲液洗除去杂组份，用pH3.0的IOOmM巧樣酸缓洗脱抗体，用PH9.0的IM tris-Hcl缓冲液立即中和收集到的洗脱样品。
[00化]取小样进行SDS-PAGG分析，非还原样品60邸左右出现组装好的化r化b-Nn，还原 样品中出现35KD的VH+CH1+化链和25KD的轻链。图4为本发明的利用内含肤制备免疫毒素的 方法的实施例2中用SDS-PAGE检测经过Protein L层析柱纯化的融合蛋白化b-Nn的结果示 意图。
[0086] 合并含有目的蛋白的样品，W用于下一步断裂intein介导的体外剪接。如果需要， 利用MIliJPORE Amicon叫tra(30MWC0)超滤离屯、管浓缩，冷冻和在-20°C或-80°C保存。
[0087] 4、利用化U DnaE反式剪接制备Her Fab-PE38KDEL
[0088] 将实施例1中所述步骤2得到之融合多肤化-阳38K呢L与步骤3得到的融合多肤化r 化b-化W摩尔比I: I进行混合，并加入终浓度为ImM的DTT，于25°C下保溫60min，取样品进行 SDS-PAGEW及Western Blot检测。图5为本发明的利用内含肤制备免疫毒素的方法的实施 例2中用SDS-PAGE检测化b-化与化-PE38K呢L反式剪接生成化b-PE38K呢L的结果示意图。
[0089] 5、经由化U化aE反式剪接产生的化r Fab-PE38K呢L的分离纯化
[0090] 利用Ni2^NTA捕获步骤4中未发生反式剪接反应的融合多肤W及反式剪接所产生的 副产物来纯化化r化b-PE38KDEL。
[0091] 装填Ni2+重力柱，柱床体积1ml，用5倍柱体积水洗之后用10倍柱体积结合缓冲液 (20mM PBS、SOOmM化Cl、20mM咪挫、pH7.5)平衡，将步骤4得到的反应体系上柱，流速为Iml/ min,收集流穿，上柱完毕后，用5倍柱体积包含40mM咪挫的洗脱缓冲液（20mM PBS、500mM NaCl、40mM咪挫、pH7.5)冲洗，收集冲洗液，随后用10倍柱体积包含150mM咪挫的洗脱缓冲液 (20mM PBS、500ml化Cl、150mM咪挫、pH7.5)冲洗，SDS-PAGE检测收集的蛋白样品，依需要， 可冷冻和在-20°C或-80°C保存，或者用于更高纯度的纯化，例如离子交换层析，疏水层析， W及分子排阻层析等。
[009。实施例3、利用化U DnaE的反式剪接功能制备免疫毒素!Ierceptin-PE38KDEL
[0093] 1、构建融合了断裂内含肤化U DnaE N端的化r肥表达载体pCEP4-Her肥-Nn
[0094] 利用下表5引物，W合成的包含编码信号肤基因的化rceptin重链核酸分子为模板 利用表中引物克隆编码化rceptin重链的基因W合成的包含化U DnaE的核酸分子为模板， 克隆化U Dn址的N端基因，采用TaKaRa公司的PrimerStar Max进行扩增，PCR条件为94°C 1〇3,55°(：1〇3,72°(：1〇3,30个循环，将得到的片段琼脂糖凝胶电泳回收后利用重叠?(：时尋编 码化rceptin重链的基因与编码化U化址的N端基因化U DnaE的N端在融合多肤C端的顺序 合成，PCR条件为94°(：1〇3,55°(：1〇3,72°(：1〇3,30个循环，将此基因片段用些旦(111巧邮曰抽11处 理，并与同样经过化ndn I和BamHI处理的PCEP4进行连接，质粒结构图如图7所示。
[00M]将连接产物转化大肠杆菌D册a感受态细胞，将转化细胞涂布于含50iig/mL氨节西 林的琼脂平板培养过夜。挑取平板上长出的单克隆，于5mL含50yg/mL氨节西林的LB培养基 中震荡培养过夜，并提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所构建的化r HC-化序列正确。
[0096] 表 5
[0097]
[0098] 2、融合多肤化rceptin-化的表达与纯化
[0099] 本实施例中利用HEK293-E系统中的瞬时表达系统表达融合肤化rceptin-化。
[0100] 用SFX4皿K293培养基化yClone)和Gibco Freestyle 293培养基（Gibco)Wl = I的 比例，添加10化g/ml遗传霉素(geneticinKGibco)培养皿K293-E细胞(表达邸病毒核抗原 的人胚肾细胞系293;美国典型培养物中屯、，保藏号ATCC#C化-10852，Lot.959218)，转染前 一天用新鲜培养基将细胞稀释至1.5-2.5 X IO6个细胞/ml，W37°C，120巧m，5%C〇2培养，W 待次日转染。
[0101] 转染当日，按照每IO6个细胞用0.扣g DNA的用量，等质量比混合PCEP4-化r肥-Nn 和实施例3步骤2中构建的Herceptin轻链表达载体pCEP4-Her LC，用Gibco Freestyle293 培养基稀释DNA至（40叫/化），0麻:？61 = 1:3加入混匀的0麻中室溫解育20111111备用。同时 1000 rpm离屯、5min收集细胞，经Gibco FYeestyle 293培养基洗涂细胞1次，1000 rpm离屯、 5min收集细胞，用150ml G化CO Freestyle 293培养基重悬细胞至细胞密度为4 X IO6个细 胞/ml置于新的IL摇瓶(Coming)中。
[0102] 将解育的DNA-PEI复合物加入细胞中，37°C，110rpm，5%C02转染4小时，随后加入 等体积预热的SFX4皿K293培养基，添加100μg/ml遗传霉素(geneticinKGibco)继续37°C， 130 巧m，5%C02 培养 10 天。
[0103] 直接收集上清纯化或者收集上清-8(TC冷冻保存。
[0104] 所收集的上清用PBS(20mMPBS，150mM化Cl，pH6.8-7.4)l:l混合，上到预先用 PBS平衡完毕的Protein A(蛋白A)亲和层析柱，上样完毕用10倍柱体积的PBS洗涂，用抑3.0 的IOOmM巧樣酸缓冲液洗脱抗体，用抑9.0的IM化is-Hcl缓冲液立即中和收集到的洗脱样 品。取小样进行SDS-PAGG分析，非还原样品于170kD左右出现组装好的Herceptin-Nn,还原 样品中出现约70kD的化r HC-Nn链和25KD的轻链。合并含有目的蛋白的样品，W用于下一步 断裂intein介导的体外剪接。如果需要，利用M比LIPORE Amicon叫tra(30MWC0)超滤离屯、 管浓缩，冷冻和在-20°C或-80°C保存。
[01化]3、利用化U DnaE反式剪接制备Herceptin-PE38KDEL
[0106] 将实施例1中所述步骤2得到之融合多肤NC-PE38KD化与步骤3得到的融合多肤 Here邱t in-Nn W摩尔比1:1进行混合，并加入终浓度为ImM的DTT，于25 °C下保溫60min，取样 品进行SDS-PAGEW及Western Blot检测。图6为本发明的利用内含肤制备免疫毒素的方法 的实施例3用Western Blot检测Herceptin-Nn与NC-PE38KDEL反式剪接生成Herceptin- 阳38K呢L的结果示意图。
[0107] 4、经由化U DnaE反式剪接产生的Herceptin-PE38K呢L的分离纯化
[0108] 利用Ni2^NTA捕获步骤3中未发生反式剪接反应的融合多肤W及反式剪接所产生的 副产物来纯化化rceptin-阳38KD化。装填Ni2+重力柱，柱床体积1ml，用5倍柱体积水洗之后 用10倍柱体积结合缓冲液(20mM PBS、SOOmM化Cl、20mM咪挫、pH7.5)平衡，将步骤3得到的 反应体系上柱，流速为Iml/min，收集流穿，上柱完毕后，用5倍柱体积包含40mM咪挫的洗脱 缓冲液(20mM PBS、SOOmM NaCl、40mM咪挫、pH7.5)冲洗，收集冲洗液，随后用10倍柱体积包 含150mM咪挫的洗脱缓冲液(20mM PBS、500mM NaCl、150mM咪挫、pH7.5)冲洗，SDS-PAGE检测 收集的蛋白样品，依需要，可冷冻和在-20° C或-8(TC保存，或者用于更高纯度的纯化，例如 离子交换层析，疏水层析，W及分子排阻层析等。
[0109] 可见，本发明的方法则克服了在免疫毒素生产的传统策略中存在的不足，实现了 改善了传统生产免疫毒素的技术方法中存在诸多不足之处，如化学偶联法中需要加入化学 试剂，由于导向多肤部分中修饰位点较多而导致的产品不均一，同时化学偶联键容易断裂 而导致毒性渗漏等;而直接表达免疫毒素融合蛋白的策略中，若采用原核表达系统，则目的 蛋白往往W包涵体形式存在，复性效率低且步骤繁琐过程复杂，若采用真核表达系统则免 疫毒素的表达可能受限于其对宿主细胞存在的天然毒性。本发明的方法改善了现有技术的 不足：1、本发明的方法只需要制备不同的导向部分多肤W及毒性部分多肤，就可W将其进 行组合，进而产生可W针对不同祀点及拥有不同毒性机制的免疫毒素，具有显著的多样性 及灵活性;2、本发明的方法中，导向部分多肤和毒性部分多肤可W在适当的宿主细胞中分 开表达，如需要特殊的折叠环境，特别是高级的翻译后修饰，可W在哺乳动物细胞中进行表 达，而没有太多修饰需求的多肤可W在大肠杆菌中进行表达，在适合的表达系统中分别表 达目的多肤可W获得较高的产量、收率W及纯度;3、本发明的方法中，导向部分多肤和毒素 部分多肤的连接是位点特异性的，不会生产副产物，得到的产物产品均一性高;4、本发明的 方法中，导向性部分多肤和毒素部分多肤经由内含肤的自剪接，是有肤键连接在一起，相比 于化学偶联法等连接方式具有良好的稳定性;5、本发明的方法中，自剪接反应条件溫和、反 应高效，易于与其他工艺进行整合、放大;反应过程无需加入有毒有害作用物质。
[0110] W上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可W在权利要求的范围内做出各种变形或修改，运并不影 响本发明的实质内容。
【主权项】
1. 一种基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： 步骤一，构建表达免疫毒素中具有导向功能的多肽和具有毒性功能的多肽的载体DNA 片段，将所述两种多肽的载体DNA片段与内含肽的N端或C端分别连接，形成融合表达载体； 其中，所述含有内含肽N端的融合表达载体与含有内含肽C端的融合表达载体所表达的多肽 需成对存在，以使得反式剪接反应能够发生； 步骤二，取步骤一所述的融合表达载体，分别在合适的宿主细胞中进行表达，得到融合 内含肽N端的融合多肽A以及融合内含肽C端的融合多肽B; 步骤三，取融合多肽A和融合多肽B，混合，在内含肽对应的反式剪接条件下，诱导免疫 毒素的导向功能的多肽以及具有毒性功能的多肽部分进行反式剪接，得到免疫毒素。2. 根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤一 中，所述内含肽为人工断裂内含肽、或天然断裂内含肽，或具有剪接功能的内含肽突变体。3. 根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤一 中，所述内含肽为Ssp DnaB、Ssp DnaE或Npu DnaE04. 根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤一 中，所述内含肽N端的C末端或C端的N末端还融合有功能性多肽。5. 根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，所述功能 性多肽为MBP或ChBD标签蛋白。6. 根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤一 中，所述融合表达载体的构成为导向功能多肽-内含肽N端、或内含肽C端-毒性功能多肽，或 毒性功能多肽-内含肽N端、或内含肽C端-导向功能多肽，或导向功能多肽-内含肽N端-功能 多肽、或功能多肽-内含肽C端-毒性功能多肽，或毒性功能多肽-内含肽N端-功能多肽、功能 多肽-内含肽C端-导向功能多肽。7. 根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤一 中，所述具有导向功能的多肽为抗体、单链抗体scFv、二硫键稳定抗体dsFv、二硫键稳定单 链抗体dsscFv、Fab抗体、细胞因子、或生长因子。8. 根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤一 中，所述具有毒性功能的多肽为RIP型毒素;具体为蓖麻毒素、ADP核糖基化免疫毒素，白喉 毒素、或绿脓杆菌外毒素部分的融合蛋白，或具有毒素生物活性的突变体。9. 根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤二 中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。10. 根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，所述宿 主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、高扩酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、酵 母、中国仓鼠卵巢细胞、或人肾胚细胞。11. 根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤三 中，还包括分离纯化进而获得免疫毒素的步骤。12. 根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，所述分 离纯化的方法为亲和层析方法、离子交换层析方法、或疏水作用层析方法。13. 根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤三 中，所述反式剪接条件为能够触发指定内含肽完成自剪接的条件。14. 根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，当内含 肽为Npu DnaE时，反式剪接条件为:0-55°C，pH为3-11，接触时间Is-60h，终浓度为0.05mM-IOOmM的亲核试剂。15. 根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，所述亲 核试剂为DTT，DTE，CYSTEINE，TCEP，或MESNA亲核性试剂。
【文档编号】C12N15/62GK105925596SQ201610099711
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年2月23日
【发明人】陈俊生, 朱建伟, 韩雷, 丁凯, 谢跃庆, 江华, 路慧丽, 张宝红, 张蕾
【申请人】上海交通大学, 美国杰科实验室有限公司, 杰科（天津）生物医药有限公司