一种利用槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其修饰方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种利用槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其制备方法和应用，该修饰方法包括以下步骤：(1)将槐糖脂衍生物的N?羟基琥珀酰亚胺酯溶解在DMSO中，然后加入天然溶菌酶的NaHCO3水溶液，搅拌条件下进行反应，反应结束后得到共价修饰反应混合物；所述的槐糖脂衍生物为羧酸型全酰基槐糖脂；(2)依次采用去离子水和磷酸盐缓冲液对步骤(1)得到的混合液进行透析，得到的透析物经过离心分离得到共价修饰后的溶菌酶。槐糖脂衍生物共价修饰溶菌酶不仅能有效抑制革兰氏阳性菌活性，同时也能显著抑制革兰氏阴性菌活性，从而扩展天然溶菌酶的抑菌谱，可作为多功能食品保鲜剂。
【专利说明】
-种利用槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其修饰方法和 应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及利用生物表面活性剂槐糖脂衍生物共价修饰 蛋清溶菌酶，从而扩展天然溶菌酶的抗菌谱，进一步拓宽溶菌酶的应用范围，特别是在食品 保鲜领域的应用。
【背景技术】
[0002] 溶菌酶是一种碱性酶，可W水解黏多糖。其分子由129个氨基酸组成，2200个原子， 分子量14388-18000( 14388、14500、18000)，等电点为10.7-11.0，存在于动植物体内和人的 外分泌液中，目前可W从牛、羊、马等乳汁中分离出溶菌酶，其中蛋清溶菌酶含量最丰富，约 为0.3%~0.4%。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种，129个氨基酸残基构成的单一肤 链。它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。可分解溶 壁微球菌、巨大芽抱杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。化学性质非常稳定，对热也极为稳 定。溶菌酶的最适溫度为50°C，最适抑为6,溶菌酶具有热稳定性，100摄氏度保持十分钟仍 具有活性。溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的N-乙酷胞壁酸和N-乙酷氨基葡糖间的β-1，4糖 巧键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肤，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶 解。它作为一种小分子蛋白质，具有对组织无刺激无毒性等优点。在《关于批准溶菌酶等物 质为食品添加剂及部分食品添加剂和营养强化剂扩大使用范围、用量的公告（2010年第23 号）中》，溶菌酶已经可W在干酪和发酵酒中作为防腐剂使用。
[0003] 溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐， 使病毒失活。因此，该酶亦具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。溶菌酶的应用过程中的优点：（1) 溶菌酶是很稳定的蛋白质，有较强的抗热性。蛋清溶菌酶是C型，是已知的最耐热的酶；（2) 溶菌酶不会因为有机溶剂的处理而失活，当转移到水溶液中时，溶菌酶的活力可全部恢复；
[3] 溶菌酶可被冷冻或干燥处理，且活力稳定；（4)溶菌酶适宜pH5.3-6.4,可用于低酸性食 品防腐；（5)溶菌酶生产成本较低；（6)溶菌酶作为防腐剂安全性高。溶菌酶是一种天然蛋白 质，1992年FA0/WT0的食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的。
[0004] 但由于革兰氏阴性菌的细胞膜外壁存在一层脂多糖LPS，天然的溶菌酶很难溶解 该膜层，所W无法有效抑制该类菌的活性，限制了溶菌酶的应用范围。目前，为了提高溶菌 酶对大肠杆菌等革兰氏阴性细菌的抑菌效果，国内外已经做了一些相关研究，可W通过热 处理、利用还原剂还原溶菌酶的二硫键添加其它化学物质与溶菌酶协同作用等改变酶的构 象。溶菌酶的化学修饰研究主要集中在：利用化学小分子（small molecule)或多糖 (poly saccharides)与溶菌酶结合（conjugation)进而修饰溶菌酶，或利用蛋白水解酶 (proteol^ic enzymes)修饰的溶菌酶。
[0005] 此外，槐糖脂（sophorolipids)是一类无毒、可生物降解的生物表面活性剂。槐糖 脂亦可用作食品乳化剂和发泡剂。近年来，研究者们还发现一些槐糖脂还表现出良好的抑 菌活性，可用作多功能食品保鲜剂。我们利用槐糖脂衍生物共价修饰天然蛋清溶菌酶，改善 其对革兰氏阴性菌的抑菌效果，从而扩增溶菌酶的抗菌谱，进一步拓宽溶菌酶的应用范围， 特别是在食品保鲜领域的应用。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种利用生物表面活性剂槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其制 备方法和应用，通过该修饰过程，可W改善溶菌酶对革兰氏阴性菌的抑菌效果，并扩展溶菌 酶的抗菌谱，拓宽溶菌酶的应用范围。
[0007] 本发明提供了一种利用槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶，由槐糖脂衍生物与天然 溶菌酶通过共价结合得到，其中，所述的槐糖脂衍生物的簇基与天然溶菌酶的氨基酸残基 形成酷胺键；
[000引所述的槐糖脂衍生物为簇酸型全乙酷化槐糖脂，结构如下式所示：
[0009]
[0010] 本发明中，使簇酸型全乙酷化槐糖脂衍生物(P化-C18)与溶菌酶的氨基酸残基通 过共价结合得到修饰后的溶菌酶，从而将槐糖脂结构引入到溶菌酶的表面，经过活性测试， 发现其对革兰氏阴性菌具有更好的抑菌效果，同时，也不会损失溶菌酶对于革兰氏阳性菌 的抑制效果，有效的扩增了其抗菌谱范围。
[0011] 本发明还提供了一种溶菌酶的修饰方法，包括W下步骤：
[0012] (1)将槐糖脂衍生物的活性醋溶解在DMS0中，然后加入溶菌酶的化肥化水溶液，揽 拌条件下进行缩合反应，反应结束后，加入甘氨酸溶液得到反应混合物；
[0013] 所述的槐糖脂衍生物为簇酸型全乙酷化槐糖脂；
[0014] (2)依次采用去离子水和憐酸盐缓冲液对步骤(1)得到的缓冲液进行透析，得到的 透析物经过离屯、分离得到修饰后的溶菌酶。
[0015] 所述的簇酸型全乙酷化槐糖脂衍生物具有如下结构：
[0016]
[0017] 形成活性醋的目的是为了活化簇基，使得槐糖脂衍生物能够与溶菌酶的氨基成 键，完成修饰过程，作为优选，所述的活性醋为N-径基班巧酷亚胺醋。
[0018] 作为优选，所述的溶菌酶为蛋清溶菌酶。采用盐提法制备的蛋清溶菌酶的成本较 低。
[0019] 作为优选，所述的簇酸型全乙酷化槐糖脂的添加量为1.0-2.Og/L。所述的溶菌酶 的添加量为1.5-2.0邑凡。所述的甘氨酸溶液浓度为50-10011^。溶菌酶与簇酸型全乙酷化槐 糖脂(P化-C18)的混合溫度为30°C -35 °C。
[0020] 该修饰方法的具体操作步骤如下：将簇酸型全乙酷化槐糖脂(P化-C18)的N-径基 班巧酷亚胺醋溶解在5mL DMS0，逐滴滴加入25mL NaHO)3的蛋清溶菌酶溶液，继续缓慢揽拌 30°C下反应化。反应结束后，向体系内加入25mL的甘氨酸溶液，30°C恒溫lOmin。反应体系室 溫下利用去离子水透析，再利用20mM pH 7.0憐酸盐缓冲液4°C透析1天左右。
[0021] 本发明还提供了一种所述的簇酸型全乙酷化槐糖脂衍生物（P化-C18)的制备方 法，包括：
[0022] (1)在隔绝水汽的条件下，向槐糖脂中加入绝干甲醇和甲醇钢，然后加热回流进行 反应，反应结束后，酸化得到水解中间体；
[0023] (2)将步骤（1)得到的水解中间体与乙酸酢在THF中经DMAP催化进行乙酷化反应， 反应结束后经过后处理得到酷化中间体；
[0024] (3)将步骤(2)酷化中间体置于憐酸盐缓冲液中，经脂肪酶选择性催化水解，得到 所述的簇酸型全乙酷化槐糖脂。
[0025] 作为优选，步骤（1)中所述槐糖脂与甲醇钢的初始添加量之摩尔比为1:0.15:-1: 0.2。且反应回流时间控制在3-化。所用的酸的浓度无特别严格的要求。
[0026] 步骤(2)中，步骤(1)产物与乙酸酢的初始添加量摩尔比为1:6-1:10,步骤(1)产物 与DMAP的初始添加量摩尔比为1:0.3-1:0.6。所述反应溫度为25-30°C，反应时间为1-化。
[0027] 步骤(3)中，所述的脂肪酶用于选择性地水解侧链的醋基并保留其他的醋基，所述 脂肪酶可选择W下所述，PS-30(f;rom P.cepacia),P化（from porcine pancreas)和AYS (from C.rugosa)和Novozym-435(f;rom C.an1:a;rctica)。反应溫度为25-30°C，反应时间为 24-7 化。
[00%]具体可W通过W下步骤得到：
[0029] (1)向圆底烧瓶中顺序加入槐糖脂，绝干甲醇和甲醇钢，CaCb保护，加热回流化， 降至室溫，酸调抑至中性，减压除溶剂后溶解在去离子水中，并置于〇°C冰浴至粉末沉淀析 出，过滤，水洗，减压干燥得产物。
[0030] (2)向圆底烧瓶中顺序加入步骤（1)产物、50mL绝干有机溶剂THF、乙酸酢和DMAP， 室溫下揽拌lh，CaCl2保护，减压除溶剂后溶解于乙酸乙醋中，并利用饱和N址C〇3溶液洗涂混 合物3次，回收有机相，MgS〇4干燥，过滤，减压干燥，得无色油状物。
[0031] (3)分别向装有pH 7.4憐酸盐缓冲液的锥形瓶中顺序加入，步骤(2)产物和脂肪 酶。室溫下置于恒溫震荡水浴中维持72h，反应结束后，用乙酸乙醋萃取反应液，回收有机 相，无水硫酸钢干燥，减压除溶剂。
[0032] 本发明还提供了一种所述的槐糖脂的发酵法制备方法，包括如下步骤：
[0033] (1)将购置的冻干假丝酵母菌C.bombicola ATCC 22214均匀分散至ImL灭菌后的 YM培养基中（YM培养基组成包括，单位1 L酵母粉3. Og，麦芽粉3. Og，蛋白腺5 . Og，葡萄糖 10.Og，用蒸馈水定容至1 L)。随后画线接种到YM琼脂培养基斜面上(YM琼脂培养基组成包 括:酵母粉3. Og/L，麦芽粉3. Og/L，蛋白腺5. Og/L，葡萄糖10.0 g/L，琼脂20.0 g/L)，于25°C恒 溫2天，挑单菌落接种至灭菌后的液体培养基中，25°C，200巧m培养24h(液体培养基组成包 括，单位1L:酵母粉3.0g，麦芽粉3.0g，蛋白腺5.0g，葡萄糖lO.Og，用蒸馈水定容至1 L)，并 分装于甘油管中，-80°C保存备用。
[0034] (2)将上述步骤(1)菌悬液按照体积百分比5%的接种量将菌悬液接入上述冷却的 液体种子培养基中，2500-mL规格的摇瓶装，液量为500mL，摇瓶于25°C、转速为20化pm的摇 床上培养2地，得到液体种子；
[0035] (3)将上述步骤(2)液体种子培养基接种至灭菌后的装配有电子数控与揽拌装置 的10-L发酵罐培养基中，发酵溫度25°C，转速不超过1200rpm，溶氧控制在30%，利用6M氨氧 化钢溶液调控体系抑3.5。当细胞生长进入静止期时，将葡萄糖(50%，v/v)及菜巧油W适 宜的速率添加入发酵罐中，发酵过程中每隔化监测发酵液中的葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度 低于150mM时，补加葡萄糖。
[0036] (4)发酵72h结束后，将发酵液于8000巧m下离屯、lOmin，离屯、后，发酵液体系呈Ξ 相，最上层为培养基液体层，中间层主要含槐糖脂产物，而最下层固体相为细胞层。回收最 底层细胞W备循环复用。同时利用等体积乙酸乙醋洗涂Ξ次底层，用与等体积的有机溶剂 正己烧回收发酵液中未反应的油脂(洗3次）。合并乙酸乙醋，减压除溶剂得槐糖脂粗产品， 得到槐糖脂产量为200-220g/L。
[0037] 本发明还提供了一种所述的溶菌酶的应用，所述的溶菌酶用于制备多功能食品保 鲜剂或者抑菌剂。
[0038] 同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0039] (1)本发明利用生物表面活性剂槐糖脂衍生物对天然蛋清溶菌酶实施了有效化学 修饰，酶在修饰过程中的酶活损失小，调整酶活性中屯、的空间结构，强化了溶菌酶的抑菌效 果，开发了一种新颖的溶菌酶修饰剂及修饰过程，方式简单，是一种颇具实用价值的生物工 程技术。
[0040] (2)本发明提供的一种扩展溶菌酶抗菌谱的方法，较之天然溶菌酶，不仅对革兰氏 阳性菌具有抑菌活性，而且对革兰氏阴性菌的抑菌活性大幅提高，有效拓展了溶菌酶的抑 菌谱。
【附图说明】
[0041 ]图1是簇酸型全乙酷化槐糖脂衍生物的核磁碳谱图；
[0042] 图2是天然溶菌酶与槐糖脂衍生物共价修饰溶菌酶的酶活力对比；
[0043] 图3是槐糖脂衍生物共价修饰溶菌酶对常见食源性致病菌的抑菌圈直径。
【具体实施方式】
[0044] 实施例1
[0045] 槐糖脂衍生物-簇酸型全乙酷化槐糖脂的制备方法：
[0046] (1)向lOOmL的圆底烧瓶中顺序加入29.80g(43.27mmol，leq)槐糖脂，50mL绝干甲 醇和1.62血(6.49mmol，0.15eq)甲醇钢，CaCb保护，加热回流化，降至室溫，酸调抑至中性， 减压除溶剂后溶解在去离子水中，并置于〇°C冰浴至粉末沉淀析出，过滤，水洗，减压干燥， 得产物 22.5g(82%)。
[0047] (2)向lOOmL的圆底烧瓶中顺序加入21.56邑(33.86111111〇1，169)步骤（1)产物，50血绝 干有机溶剂THF，25.4mL(270.84mmol，8eq)乙酸酢和 1.654g( 13.54mmol，0.4eq)DMAP，室溫 下揽拌化，化Cl2保护，减压除溶剂后溶解于乙酸乙醋，并利用饱和化肥化溶液洗涂混合物3 次，回收有机相，MgS〇4干燥，过滤，减压干燥，得无色油状物33.8g。
[0048] IR V 2936,1740,1450,1351,1165,1053,1012,813cm21；HRESIMS m/z:1028.5571 [M+Na] + (for C52H84〇2〇, 1028.55)。
[0049] (3)分别向装有20血，pH= 7.4，0.2M憐酸盐缓冲液的50血锥形瓶中顺序加入，0.8g 步骤(2)产物(溶解在5mL丙酬中），0.4g脂肪酶Novozyme 435。室溫下置于恒溫震荡水浴中 维持72h，反应结束后，用乙酸乙醋萃取反应液，回收有机相，无水硫酸钢干燥，减压除溶剂， 产物产率88%，产物C谱见图 1JR V 2925,2854，1746，1366，1218，1019cm21;HRESIMS m/z: 916.4308 [M+Na ] + (f or C55H90O20，916.43)。
[00加]实施例2
[0051]槐糖脂衍生物-簇酸型全乙酷化槐糖脂的制备方法，与实施例2的区别在于使用的 脂肪酶为AYS(打om C.rugosa):
[0化2] (1)向lOOmL的圆底烧瓶中顺序加入29.80g(43.27mmol，leq)槐糖脂，50mL绝干甲 醇和1.62血(6.49mmol，0.15eq)甲醇钢，CaCb保护，加热回流化，降至室溫，酸调抑至中性， 减压除溶剂后溶解在去离子水中，并置于〇°C冰浴至粉末沉淀析出，过滤，水洗，减压干燥， 得产物 22.5g(82%)。
[0053] (2)向lOOmL的圆底烧瓶中顺序加入21.56邑(33.86111111〇1，169)步骤（1)产物，50血绝 干有机溶剂THF，25.4mL(270.84mmol，8eq)乙酸酢和 1.654g( 13.54mmol，0.4eq)DMAP，室溫 下揽拌化，化Cl2保护，减压除溶剂后溶解于乙酸乙醋，并利用饱和化肥化溶液洗涂混合物3 次，回收有机相，MgS〇4干燥，过滤，减压干燥，得无色油状物33.8g。
[0054] (3)分别向装有20mL憐酸盐缓冲液（pH = 7.4，0.2M)的50mL锥形瓶中顺序加入， 0.8g步骤（2)产物（溶解在5mL丙酬中），0.4g脂肪酶AYS(from C.rugosa)。室溫下置于恒溫 震荡水浴中维持72h，反应结束后，用乙酸乙醋萃取反应液，回收有机相，无水硫酸钢干燥， 减压除溶剂，产物产率80 %。
[0化5] 实施例3
[0056] 利用簇酸型全乙酷化槐糖脂(P化-C18)共价修饰天然蛋清溶菌酶：
[0057] 1)将簇酸型全乙酷化槐糖脂(实施例1制备得到的产物)的N-径基班巧酷亚胺醋溶 解在5mL DMS0中，形成溶液的最终浓度为0.7mM，揽拌情况下，逐滴滴加入25mL，0.2mM，1 % 化肥化的蛋清溶菌酶水溶液，继续缓慢揽拌30°C下反应化。反应结束后，向体系内加入25mL lOOmM的甘氨酸溶液，30°C恒溫lOmin，室溫下利用去离子水透析，再20mM pH 7.0憐酸盐缓 冲液4 °C透析1天左右。为了除去未反应的酸型全乙酷化槐糖脂，透析物在5°C 12000巧m离 屯、lOmin，做种收集悬浮物。
[005引2)溶菌酶酶活测定：
[0059]将待测酶液和底物悬液分别置于25°C水浴中保溫20min，吸取底物悬液2.8mL，置 于1 cm比色皿中比色测定450nm下的0D值，此为零时读数，然后加入酶液0.2mL，迅速摇均，从 加入酶液起计时，每隔Imin测定1次450nm下的0D值，共测定3次。本实验的酶活力单位定义 为:每分钟0D值下降0.001为1个活力单位(25°C、pH值6.2)，即每毫克活力单位化/111旨）=^ 0D45/min)X10シ样品的质量(mg)。槐糖脂衍生物修饰溶菌酶酶活是天然酶活92.5%。同时， 对天然溶菌酶的活性进行了测定，得到的结果见图2。
[0060] 实施例4
[0061] 抑菌圈的测定：采用杯碟法。取20mL溶化的固体培养基于培养皿中，凝固后，取 0.2mL浓度为106-107C即/血的各菌悬液均匀涂布于固体培养基中，lOmin后，将牛津杯放置 于培养皿表面，加入样品液，盖好培养基，置于37Γ恒溫培养2地，测抑菌圈直径。每个样品 液实验重复3次，取平均值，结果见图3。
【主权项】
1. 一种利用槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶，其特征在于，由槐糖脂衍生物与天然溶 菌酶通过共价结合得到，其中，所述的槐糖脂衍生物的羧基与天然溶菌酶的氨基酸残基形 成酰胺键； 所述的槐糖脂衍生物为羧酸型全乙酰化槐糖脂，结构如下式所示：2. -种如权利要求1所述的溶菌酶的修饰方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将所述的槐糖脂衍生物的活性酯溶解在DMSO中，然后加入天然溶菌酶的NaHCO3水溶 液，搅拌条件下进行缩合反应，反应结束后得到反应混合物； (2) 依次采用去离子水和磷酸盐缓冲液对步骤（1)得到的混合液进行透析，得到的透析 物经过离心分离得到共价修饰后的溶菌酶。3. 根据权利要求2所述的溶菌酶的修饰方法，其特征在于，所述的活性酯为N-羟基琥珀 酰亚胺酯。4. 根据权利要求2所述的溶菌酶的修饰方法，其特征在于，所述的溶菌酶为蛋清溶菌 酶。5. 根据权利要求2所述的溶菌酶的修饰方法，其特征在于，所述的羧酸型全乙酰化槐糖 脂采用如下方法制备得到： (1) 无水条件下，向槐糖脂中加入无水甲醇和甲醇钠，加热回流进行反应，反应结束后， 酸化得到中间体； (2) 将步骤（1)得到的中间体与乙酸酐在THF中经DMAP催化进行乙酰化反应，反应结束 后经过后处理得到酰化中间体； (3) 将步骤(2)得到的酰化中间体置于磷酸盐缓冲液中，经脂肪酶选择性催化水解，得 到所述的羧酸型全乙酰化槐糖脂。6. 根据权利要求5所述的溶菌酶的修饰方法，其特征在于，步骤（1)中，所述的槐糖脂与 甲醇钠的摩尔比为1:0.15-1:0.2,回流时间为3-6h; 步骤（2)中，所述的水解中间体、乙酸酐和DMAP的摩尔比为1:8~10:0.4~0.6，反应温 度为25-30°(：，反应时间为1-311; 步骤(3)中，所述脂肪酶选自PS-30、PPL、AYS和Novozym-435中的一种，反应温度为25-30°C，反应时间为24-76h。7. 根据权利要求5所述的溶菌酶的修饰方法，其特征在于，所述的槐糖脂采用以下方法 制备得到： (1)将冻干假丝酵母菌C.bombicola ATCC 22214均匀分散至灭菌后的YM培养基中，随 后画线接种至YM琼脂培养基斜面上，25°C恒温2天，挑取单菌落接种至灭菌后的液体培养基 中，25°C，200rpm培养24h，得到菌悬液； (2) 将步骤（1)得到的菌悬液接种至灭菌后的种子培养基中，25°C，200rpm培养24h; (3) 将步骤(2)的种子培养基接种至灭菌后的装配有电子数控与搅拌装置的发酵罐培 养基中，25°C，转速不超过1200rpm，溶氧控制在30%，利用氢氧化钠溶液调控体系pH 3.5， 当细胞生长进入静止期后，将葡萄糖及菜籽油添加入发酵罐中，每隔3h监测发酵液中葡萄 糖浓度，浓度低于150mM时补加葡萄糖； (4) 将步骤(3)的发酵液于SOOOrpm下离心10min，离心后，发酵液体系呈三相，中间层含 槐糖脂产物，利用等体积乙酸乙酯洗涤，合并有机相，减压除溶剂得槐糖脂。8. -种如权利要求1所述的溶菌酶的应用，其特征在于，所述的溶菌酶用于制备多功能 食品保鲜剂或者抑菌剂。
【文档编号】C12P19/12GK106011108SQ201610474289
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】石玉刚, 房升, 邵诗音, 汪琦, 朱陈敏, 孙锦程, 洪东升
【申请人】浙江工商大学