分离纯化昆虫谷氨酰胺转氨酶的方法
【专利摘要】本发明涉及一种昆虫谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase)的分离纯化方法。所述分离纯化方法包括(1)制备昆虫谷氨酰胺转胺酶的步骤；(2)采用硫酸铵，通过沉淀方式分离由步骤(1)所得的昆虫谷氨酰胺转胺酶，得到初步目标蛋白的步骤；(3)初步目标蛋白依次经葡萄糖凝胶柱和离子交换柱层析，得到目标蛋白的步骤；或，初步目标蛋白依次经离子交换柱和葡萄糖凝胶柱层析，得到目标蛋白的步骤。本发明首次成功分离纯化了昆虫谷氨酰胺转胺酶，为以谷氨酰胺转氨酶为作用靶标的害虫生理调控研究及以谷氨酰胺转氨酶为作用靶标的新型害虫防治或杀虫手段的研发奠定了基础。
【专利说明】
分离纯化昆虫谷氨醜胺转氨酶的方法
技术领域
[0001 ]本发明设及一种昆虫谷氨酷胺转胺酶(Transglutaminase)的分离纯化方法。
【背景技术】
[0002] 谷氨酷胺转胺酶(Transglutaminase，EC 2.3.2.13)能催化谷氨酷胺肤键的丫-甲 酷胺基团与赖氨酸肤键的ε-氨基基团发生酷基转移反应，形成ε-(γ-谷氨酷基)氨酸异肤 键。能特异性地识别谷氨酷胺类蛋白底物，并对胺类酷基受体的特异性较低，赖氨酸肤键的 ε-氨基基团或低分子聚合的伯胺都可W作为反应的酷基受体。具有催化蛋白质分子间或分 子内的交联反应、氨基酸与蛋白质之间的连接、W及蛋白质分子内谷氨酷胺基的水解等优 良的催化性能。
[0003] 在哺乳动物中，谷氨酷胺转胺酶参与凝血、免疫防御、细胞分化和调亡、炎性自身 免疫和神经退行性疾病等过程。被用于外创伤、骨折和软骨病变的修复W及某些肠道疾病 的治疗和自身免疫抗原，还被用于许多重大疾病（如：白内障、动脉硬化症、阿尔茨海默式、 亨廷顿氏病、帕金森病等)的调控过程。目前，谷氨酷胺转胺酶在食品、化妆品和医药等领域 中有着极其广泛的应用价值。
[0004] 研究谷氨酷胺转胺酶发现:在微生物、植物、无脊椎动物、两栖动物、鱼类、鸟类等 物种中均存在谷氨酷胺转胺酶。但是，不同来源谷氨酷胺转胺酶不仅在酶学性质如：分子 量、等电点、最适pH值、最适溫度等方面存在较大差异，而且在蛋白结构、氨基酸序列、空间 结构、活性等方面也存在差异。其中，微生物来源的谷氨酷胺转胺酶分子量普遍较小，W 40W)a居多，约为哺乳动物谷氨酷胺转胺酶分子量的一半。不同来源谷氨酷胺转胺酶的共同 点在于:蛋白活性中屯、都有Cys残基，酶的催化Ξ联体具有高度保守性。
[0005] 在自然条件下，谷氨酷胺转胺酶容易形成不可逆的聚合物，因而很难分离纯化。另 夕h保持谷氨酷胺转胺酶的稳定性和建立灵敏度高的酶活检测方法也是分离纯化谷氨酷胺 转胺酶过程中需解决的一大难点。
[0006] 尽管已发现谷氨酷胺转胺酶广泛分布于昆虫肌肉和细胞中，但昆虫谷氨酷胺转胺 酶的特性被报道较少，目前主要集中在果蛹（Drosophila melanogaster)和冈比亚按蚊 (Anopheles gambiae)等虫媒的谷氨酷胺转胺酶。据报道，果蛹体内谷氨酷胺转胺酶参与血 浆凝结的形成，敲除果蛹的谷氨酷胺转胺酶基因能显著降低果蛹体内谷氨酷胺转胺酶的表 达水平，幼虫更容易受到外源病原真菌和细菌的感染，显著增加幼虫感染性死亡率;在冈 比亚按蚊体内，谷氨酷胺转胺酶可能参与其生育和免疫生理的调控。
[0007] 对昆虫谷氨酷胺转胺酶认识的局限性，极大地限制了 W谷氨酷胺转胺酶为作用祀 标的害虫生理调控研究和新型害虫防治或杀虫手段的研发。但是，到目前为止，有关昆虫谷 氨酷胺转胺酶的分离纯化过程尚未见文献报道。
【发明内容】
[000引为了解决上述W谷氨酷胺转胺酶为作用祀标的害虫生理调控研究和新型害虫管 理手段的研发，进一步深化认识昆虫谷氨酷胺转胺酶的难题，本发明的目的在于:提供一种 昆虫谷氨酷胺转胺酶的分离纯化方法。
[0009] 本发明所述昆虫谷氨酷胺转胺酶的分离纯化方法，其包括如下步骤：
[0010] (1)制备昆虫谷氨酷胺转胺酶的步骤；
[0011] (2)采用硫酸锭，通过沉淀方式分离由步骤（1)所得的昆虫谷氨酷胺转胺酶，得到 初步目标蛋白的步骤;和，
[0012] (3)初步目标蛋白依次经葡萄糖凝胶柱和离子交换柱层析，得到目标蛋白的步骤； 或，初步目标蛋白依次经离子交换柱和葡萄糖凝胶柱层析，得到目标蛋白的步骤；
[0013] 其中，所述昆虫为鱗翅目、直翅目、銷翅目、双翅目、同翅目或双翅目等害虫，所述 葡萄糖凝胶柱分离范围为3，000~150，000。
【附图说明】
[0014] 图1经不同饱和度硫酸锭沉淀后样品中谷氨酷胺转氨酶比活力。
[0015] 图2谷氨酷胺转胺酶的S邱hadex G-75葡聚糖凝胶分离。
[0016] 图3谷氨酷胺转胺酶的S邱hadex G-100葡聚糖凝胶分离。
[0017] 图4 PH7.8的Tris-HCl缓冲液对谷氨酷胺转胺酶的离子交换层析洗脱分离；
[0018] 图中：各泳道对应于4个具有谷氨酷胺转胺酶活性的蛋白样品。
[0019] 图5 P册.5的Tris-HCl缓冲液对谷氨酷胺转胺酶的离子交换层析洗脱分离。
[0020] 图6谷氨酷胺转胺酶经方法1纯化后的凝胶电泳图谱；
[0021] 图中:M-标准蛋白；TG-目标蛋白。
[0022] 图7谷氨酷胺转胺酶经方法2纯化后的凝胶电泳图谱；
[0023] 图中：M-标准蛋白；1-粗酶液;2-硫酸锭沉淀后酶液;3-第一次离子交换沉析 后酶液;4-第二次离子交换沉析后酶液;5-凝胶层析后酶液。
【具体实施方式】
[0024] 在本发明一个优选的技术方案中，采用55%饱和度的硫酸锭，通过沉淀方式分离 由步骤(1)所得的昆虫谷氨酷胺转胺酶，得到初步目标蛋白。
[0025] 在本发明另一个优选的技术方案中，步骤(3)中，当初步目标蛋白采用先经离子交 换柱层析，再经葡萄糖凝胶柱层析时，需经两次离子交换柱层析，再经葡萄糖凝胶柱层析；
[0026] 在本发明又一个优选的技术方案中，步骤(3)中所用葡萄糖凝胶柱为S邱hadex Ο? ι 00 凝胶柱 (分离范围 4 ， 000-150 ， 000) 。
[0027] 在本发明又一个优选的技术方案中，步骤(3)中所用离子交换柱为DEAE-纤维素- 52离子交换柱，所用洗脱液是:pH值为7.0~9.0(更优选7.8~8.5)、浓度为15mM~25mM的 Tris-肥1缓冲液，且在所述Tris-肥1缓冲液含有0~1.0M NaCl (更优选0.2M~0.8M)。
[0028] 本发明的发明人首次成功分离纯化了昆虫谷氨酷胺转胺酶，为W谷氨酷胺转氨酶 为作用祀标的害虫生理调控研究及W谷氨酷胺转氨酶为作用祀标的新型害虫防治或杀虫 手段的研发奠定了基础。
[0029] 下面结合实施例对本发明做进一步阐述，其目的仅在于更好理解本发明的内容。 因此，所举之例不限制本发明的保护范围。
[0030] 实施例1
[0031 ]昆虫谷氨酷胺转胺酶的制备
[0032] 实验方法：
[0033] (1)取大小均一的四龄粘虫幼虫若干头，饥饿处理地后，用20mM化is-HCl缓冲液 (口册.0)清洗虫体。
[0034] (2)按照体积比3:l(v:v)，（缓冲液:幼虫的体积比为3:1)将幼虫置于20mM Tris- 肥1缓冲液(P册.0)中，冰浴条件下，静置30min后，充分匀浆。
[0035] (3)待虫体充分破碎后，将匀浆液离屯、（10,000旨，4°(：)20111^，取上清液进行冷冻干 燥，收集干粉，用作谷氨酷胺转胺酶的酶源。
[0036] (4)测定谷氨酷胺转胺酶的活力。取10化1预热至37°C的苯甲基氧化碳酷-k谷氨 酷胺甘氨酸(Na-CBZ-GIn-Gly)底物溶液(配制方法：称取lOOmg Na-CBZ-GIn-Gly溶于2mL的 0.2mol/L化OH溶液中，完全溶解后加入4mL的0.2M Tris-HCl(pH 6.0)缓冲液、2mL的0.1M 径胺溶液和2mL的0.01M还原型谷脫甘肤溶液，并调节抑为6.0)，加入50μ1酶液，37°C水浴溫 度下反应lOmin，加入100μΙ TCA显色液（由3M HC1、12%S氯乙酸、5%六水Ξ氯化铁按照1: 1:1等体积混合而成)使反应终止，常溫离屯、（8,000g)5min后，取上清液置于酶标仪中波长 为525nm处读取吸光度值(OD525 )，依据标准曲线计算出谷氨酷胺转胺酶的比活力。W不添 加 Na-CBZ-GIn-Gly的底物溶液为对照。
[0037] 实验结果：
[0038] 结果表明（表1)，粘虫体内存在谷氨酷胺转胺酶，且谷氨酷胺转胺酶的总活性随着 酶源样品中蛋白含量的增加而逐渐增加，但谷氨酷胺转胺酶的比活力较低，表明粘虫体内 谷氨酷胺转胺酶的含量较低。
[0039] 表1虫体酶源样品中谷氨酷胺转胺酶的比活力
[0040]
[0041] 实施例2
[0042] 昆虫谷氨酷胺转胺酶的硫酸锭沉淀分离
[0043] 实验方法：
[0044] (1)将粘虫匀浆液在冰浴条件下缓慢加入硫酸锭固体，分别至饱和度为25%、 35%、45 %、55%、65%、75%、85%，用玻璃棒揽拌均匀，待硫酸锭固体彻底溶解后继续揽拌 30min，4 °C下静置过夜后，离屯、（10，OOOg，4 °C) 30min，收集上清液和沉淀。
[0045] (2)将沉淀溶于20mM化is-HCl缓冲液(P册.0)中，与上清液一样分别转移入透析 袋，置于4°C流动缓冲液中透析过夜，至l%BaCl溶液检测确定透析液中没有硫酸锭后停止 透析，取酶液进行冷冻干燥。
[0046] (3)测定谷氨酷胺转胺酶的比活力。
[0047] 实验结果：
[004引结果表明（图1)，在硫酸锭溶液的饱和度达到55%，样品的沉淀中谷氨酷胺转胺酶 比活力达到最大，而样品的上清液中谷氨酷胺转胺酶比活力显著降低，表明采用55%饱和 度的硫酸锭沉淀样品中谷氨酷胺转胺酶的效果最佳。
[0049] 实施例3
[0050] 昆虫谷氨酷胺转胺酶的S邱hadex G-75葡聚糖凝胶分离 [0化1]实验方法：
[0052] (1)取50g Sephadex G-75葡聚糖凝胶（分离范围3,000-80,000)加入化去离子水 中，揽拌均匀后，室溫下静置溶胀过夜，然后置于沸水中溶胀地，冷却后备用。
[0053] (2)将溶胀好的凝胶一次性装入层析柱（1.6X 100cm)内，加入3倍柱床体积的20mM 化is-肥1(抑8.0)缓冲液进行平衡。
[0054] (3)待平衡液与凝胶液面约1cm处时，取酶液进行上样，待酶液全部进入胶面后，加 入20mM Tris-肥1 (pH 8.0)缓冲液进行洗脱，调节流速为0.5血/min，收集流出组分，测定各 组分在波长为280nm处的吸收值，
[0055] (4)测定各馈分样品中谷氨酷胺转胺酶的比活力。
[0056] ( 5)样品进行聚丙締酷胺凝胶电泳（SDS-PAGE)。采用12 %的分离胶（3.36m 1 d地2〇,2.5ml 1.5M Tris-肥l(p册.8)，100μ1 10%SDS，4ml 30%聚丙締酷胺，2扣1 10%过 硫酸锭，1 化1 TEMED)和4%的浓缩胶（2.4ml d地2〇，1.0ml 0.5M Tris-HCl(pH6.8)，40yl 10%505,0.53111130%聚丙締酷胺，1化110%过硫酸锭，1化1了6160)。浓缩胶电压为80￥，分 离胶电压为120V。采用0.1%考马斯亮蓝R250染色液对凝胶进行染色，采用脱色液(水：甲 醇:冰醋酸8:1:1)对染色后的凝胶进行脱色。
[0化7]实验结果：
[005引结果表明，在Se地adex G-75凝胶层析中，谷氨酷胺转胺酶活性集中在13-20号管 (图2A)。在SDS-PA(iE图谱中，谷氨酷胺转胺酶的分子量约为63.31kDa，表明谷氨酷胺转胺酶 蛋白在Se地adex G-75的分离范围内，但是经S邱hadex G-75凝胶层析后，目的蛋白样品中 仍含较多杂蛋白（图2B)。
[0化9] 实施例4
[0060] 昆虫谷氨酷胺转胺酶的S邱hadex G-100葡聚糖凝胶分离
[0061] 实验方法：
[0062] (1)取50g Sephadex G-100葡聚糖凝胶(分离范围4,000-150,000)加入化去离子 水中，揽拌均匀后，室溫下静置溶胀过夜，然后置于沸水中溶胀地，冷却后备用。
[0063] (2)将溶胀好的凝胶一次性装入层析柱（1.6X 100cm)内，加入3倍柱床体积的20mM 化is-肥1(抑8.0)缓冲液进行平衡。
[0064] (3)待平衡液与凝胶液面约1cm处时，取酶液进行上样，待酶液全部进入胶面后，加 入20mM Tris-肥1 (pH 8.0)缓冲液进行洗脱，调节流速为0.5血/min，收集流出组分，测定各 组分在波长为280nm处的吸收值，
[0065] (4)测定各馈分样品中谷氨酷胺转胺酶的比活力。
[0066] 实验结果：
[0067] 结果表明（图3)，在S邱hadex G-100凝胶层析中，谷氨酷胺转胺酶活性集中在7-11 号管，表明谷氨酷胺转胺酶蛋白在S邱hadex G-100的分离范围内，且蛋白洗脱的峰形优于 Sephadex G-75洗脱峰。
[006引实施例5
[0069] PH7.8的Tris-HCl缓冲液进行谷氨酷胺转胺酶的离子交换层析分离
[0070] 实验方法：
[0071] (1)取30g DEAE-纤维素-52溶于化去离子水中，揽拌均匀后，室溫下静置溶胀过 夜，抽滤去除去离子水，置于0.5M化0H溶液中浸泡30min，抽滤去除上层液，用去离子水洗 至中性。然后再置于0.5M肥1溶液中30min，抽滤并水洗至中性，最后再置于0.5M化0田容液 中浸泡30min，抽滤并水洗至中性。
[0072] (2)将溶胀好的DEAE-纤维素-52-次性装入层析柱(3.9 X 20cm)内，加入3倍柱床 体积的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.8)进行平衡。
[0073] (3)待平衡液与凝胶液面约1cm处时，取酶液进行上样，待酶液全部进入胶面后，用 含有0-1.0M化C1的20mM化is-HCl缓冲液(pH7.8)进行梯度洗脱，调节流速为0.5血/min， 收集流出组分，测定各组分在波长为280nm处的吸收值。
[0074] (4)测定各组分中谷氨酷胺转胺酶的比活力。
[0075] (5)含有谷氨酷胺转胺酶活性的样品进行聚丙締酷胺凝胶电泳。
[0076] 实验结果：
[0077] 结果表明，采用抑7.8的20mM化is-HCl洗脱液进行洗脱时，离子交换柱层析能检 测到四个具有谷氨酷胺转胺酶活性的且紧密相邻的蛋白吸收峰，峰值界限不明显（图4A)。 聚丙締酷胺凝胶电泳图谱显示，运四个具有谷氨酷胺转胺酶活性的蛋白样品中仍存在较多 杂蛋白，且杂蛋白条带与谷氨酷胺转胺酶条带距离较近(图4B)。
[007引实施例6
[0079] P册.5的Tris-HCl缓冲液进行谷氨酷胺转胺酶的离子交换层析分离
[0080] 实验方法：
[0081 ] (1)取30g DEAE-纤维素-52按照实施例5方法进行溶胀处理。
[0082] (2)将溶胀好的DEAE-纤维素-52-次性装入层析柱(3.9 X 20cm)内，加入3倍柱床 体积的20mM Tris-HCl缓冲液(P册.5)进行平衡。
[0083] (3)待平衡液与凝胶液面约1cm处时，取酶液进行上样，待酶液全部进入胶面后，用 含有0-1.0M化C1的20mM化is-HCl缓冲液(P册.5)进行梯度洗脱，调节流速为0.5血/min， 收集流出组分，测定各组分在波长为280nm处的吸收值。
[0084] (4)测定各组分中谷氨酷胺转胺酶的比活力。
[0085] (5)含有谷氨酷胺转胺酶活性的样品进行聚丙締酷胺凝胶电泳。
[00化]实验结果：
[0087] 结果表明，采用抑8.5的20mM化is-HCl洗脱液进行洗脱时，离子交换柱层析能检 测到一个具有谷氨酷胺转胺酶活性的蛋白吸收峰（图5A)。聚丙締酷胺凝胶电泳图谱显示， 具有谷氨酷胺转胺酶活性的蛋白样品中，谷氨酷胺转胺酶条带与其他杂蛋白条带距离较远 (图 5B)。
[0088] 实施例7(昆虫谷氨酷胺转胺酶的纯化）
[0089] 方法1，具体包括如下步骤：
[0090] (1)按照实施例1方法制备粘虫谷氨酷胺转胺酶的酶源。
[0091] (2)采用55%饱和度的硫酸锭进行蛋白沉淀，初步目标蛋白，装入透析袋中透析过 夜。
[0092] (3)采用S邱hadex G-lOO凝胶柱进行层析，每15mL洗脱液收集一管，
[0093] (4)采用DEAE-纤维素-52离子交换柱层析(D2.6 X 20cm)和抑8.5洗脱缓冲液
[0094] 实验结果：
[00M]结果表明，经S邱adex G-100凝胶层析后，获得初步分离的含谷氨酷胺转胺酶活性 的目的蛋白样品，谷氨酷胺转胺酶蛋白被纯化了5.683倍。该目的蛋白经浓缩后，经过DEAE- 纤维素-52离子交换层析，大部分蛋白未被吸附而被洗脱，谷氨酷胺转胺酶蛋白被离子浓度 约为0.5M的NaCl洗脱液洗脱，收集的谷氨酷胺转胺酶蛋白被纯化了 48.36倍，最终回收率为 12.69%。在聚丙締酷胺凝胶电泳图谱中，目的蛋白仅显示一条清晰的谷氨酷胺转胺酶蛋白 条带，分子量约为63.WkDa(图6)，达到了蛋白的N-端测序纯度。缺点是蛋白的损失量较大， 目的蛋白的回收率较低。
[0096] 方法2,具体包括如下步骤：
[0097] (1)按照实施例1方法制备粘虫谷氨酷胺转胺酶的酶源。
[0098] (2)采用55%饱和度的硫酸锭进行蛋白沉淀，初步目标蛋白，装入透析袋中透析过 夜。
[0099] (3)采用DEAE-纤维素-52离子交换柱进行层析，洗脱液为PH7.8的20mM化is-HCl (含0-1.0M NaCl)缓冲液。
[0100] (4)采用DEAE-纤维素-52离子交换柱进行层析，洗脱液为P册.25的Tris-肥1(含0- 1.0M NaCl)缓冲液。
[0101] (5)采用S邱hadex G-100凝胶柱进行层析，收集目标蛋白。
[0102] 实验结果：
[0103] 结果表明，在第一次离子交换柱层析中，经PH7.8的20mM Tris-HCl(含尽-1.0M的 NaCl)缓冲液洗脱，在0.3M~0.8M的化C1溶液的洗脱液条件下，含有谷氨酷胺转胺酶活性的 蛋白被较大程度地解吸附洗脱，出现一个较大的蛋白吸收峰。该目的蛋白在第二次离子交 换柱层析中，经抑8.25的20mM化is-HCl(含0-1.0M化C1)缓冲液洗脱，含有谷氨酷胺转胺 酶活性的蛋白被0.3M~0.6M的NaCl溶液的洗脱液解吸附洗脱。进一步通过S邱hadex G-100 凝胶柱进行层析，收集的谷氨酷胺转胺酶蛋白被纯化了 40.68倍，最终回收率为18.62%。但 是，在聚丙締酷胺凝胶电泳图谱中，目的蛋白的分子量约为63.17,而分子量约为56.68的杂 蛋白没有被去除。优缺点是目的蛋白的回收率高，但存在少量杂蛋白。
【主权项】
1. 一种分离纯化昆虫谷氨酰胺转胺酶的方法，其包括如下步骤： (1) 制备昆虫谷氨酰胺转胺酶的步骤； (2) 采用硫酸铵，通过沉淀方式分离由步骤（1)所得的昆虫谷氨酰胺转胺酶，得到初步 目标蛋白的步骤;和， (3) 初步目标蛋白依次经葡萄糖凝胶柱和离子交换柱层析，得到目标蛋白的步骤;或， 初步目标蛋白依次经离子交换柱和葡萄糖凝胶柱层析，得到目标蛋白的步骤； 其中，所述昆虫为鳞翅目、直翅目、鞘翅目、双翅目、同翅目或双翅目害虫，所述葡萄糖 凝胶柱分离范围为3，000~150，000。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所用硫酸铵为55%饱和度的硫酸 铵。3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，初步目标蛋白先经两次离子 交换柱层析，再经葡萄糖凝胶柱层析，得到目标蛋白。4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所用葡萄糖凝胶柱为Sephadex G-100凝胶柱。5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所用离子交换柱为DEAE-纤维素 -52离子交换柱，所用洗脱液是:pH值为7.0~9.0、浓度为15mM~25mM的Tris-HCl缓冲液，且 在所述Tris-HCl缓冲液含有0~1.0M NaCl。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述pH值为7.8~8.5。7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述NaCl浓度为0.2M~0.8M。8. 如权利要求1~7中任意一项所述的方法，其特征在于，其中昆虫谷氨酰胺转胺酶由 包括如下步骤的制备方法制得： (1) 取大小均一的四龄粘虫幼虫若干头，饥饿处理4小时后，用pH值为8.0、浓度为20mM 的Tris-HCl缓冲液清洗虫体； (2) 将pH值为8.0、浓度为20mM的Tris-HCl缓冲液与经清洗虫体，按体积比为3:1混合， 得混合物，在冰浴条件下，将所得混合物静置至少30分钟，充分匀浆，得匀浆液； (3) 将步骤(2)中所得匀浆液离心，取上清液进行冷冻干燥，收集干粉，用作谷氨酰胺转 胺酶的酶源。
【文档编号】C12N9/10GK106011099SQ201610458931
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】黄青春, 张蕾, 郓新明, 饶文兵, 肖慈英, 杨超
【申请人】华东理工大学