一种非对称近红外方酸染料及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学技术领域，具体设及一种非对称近红外方酸染料及其制备方 法与应用。
【背景技术】
[0002] 近红外巧光染料的发射波长在650-900nm之间，在该范围内生物分子自身巧光较 弱，可避免生物背景干扰而获得较高的分析灵敏度(施锋；李宏洋；彭孝军.生物分析用 近红外巧光染料研究进展.薦參王2003，iY?伤;，268-272.)，且波长>650皿的红光 可W穿透动物皮肤和组织，因此，将近红外染料作为巧光探针应用于生物分析和细胞成像 中已引起了广泛关注。
[0003] 方酸染料是由方酸与富电子芳基化合物或苯胺类化合物缩合生成的1,3-二 取代衍生物。该类化合物的显著特征是在可见光至近红外光区有狭窄而强的吸收 带和较高的量子产率。运种光电特性主要来源于分子内强烈的供体-受体-供体 (donor-acceptor-donor)间的电荷迁移作用。近年来，方酸染料W其优异的光学性能、良 好的光稳定性备受关注，成为功能染料研究的热点之一。由于方酸染料具有的平面结构 使其在极性溶剂中容易聚集，从而引起吸收带展宽和巧光泽灭；而在解聚集过程中巧光信 号通常会发生恢复或者增强，运为设计"巧光增强型"探针提供了一种有趣的新途径。早 期Buncel和McKerrow等人通过吸收光谱观察了方酸染料在不同比例有机溶剂与水的混 合相中形成的聚集态吸收峰，在随后的研究中又指出发色团的结构会影响染料分子在溶液 中的聚集模式（Buncel,E. ;McKerrow,A.J. ;Kazmaier,P.M.Solvent-controlled aggregationofaphotoconductivedye.J. Chem. Soc., Chem. Commun.1992, (17),1242-1243;McKerrow,A.J. ;Buncel,E. ;Kazmaier,P.M.Aggregationof squ曰r曰inedyes:structure-propertyrelationshipsandsolventeffects.Can. J. 紐細7. 1995，巧行化1605-1615. )。2010年，Pang等人通过分子结构微小的变化，使方 酸染料在含微量表面活性剂的溶液中组装得到H-聚集体和J-聚集体。形成的聚集态与 生物大分子蛋白间的非共价作用力使得染料解聚集，释放巧光信号，实现了蛋白的选择性 识另iKXu,Y. ;Li,Z. ;Malkovskiy,A. ;Sun,S. ;Pan邑，Y.Aggregationcontrol ofsqu曰r曰ines曰ndtheiruse曰sne曰r-infr曰redfluorescentsensorsforprotein. 乂化乃?.紐e化愿010，パ4 0巧，8574-8580.)。本课题组利用配体二硫代氨基甲酸 醋（dithiocarbamate，DTC)对重金属离子良好的亲和能力，设计了隶离子配位诱导解聚集 型方酸染料比色巧光双响应探针。Hg2+与染料分子侧链DTC的结合形成空间位阻，引起染 料解聚集，并使得溶液颜色由紫红色变为蓝色，溶液巧光强度增强700倍，对隶离子的检 测限可达到 7. 1nM(Qien,C. ;Wang,R. ;Guo,L.;化，N. ;Dong,比；化an,Y.A squ曰r曰ine-b曰sedcolorimetricand"turnon"fluorescentsensorforselective detectionofHg化inanaqueousmedium.Org.Ze化 2011,13 (5),1162-1165.)。但 由于生物大分子大多是水溶性的，所W方酸染料在生物医学领域的应用不仅需要具有良好 的光谱性能，更需要具有良好的水溶性。但是目前大多数方酸染料的水溶性较差，限制了其 在生物医学方面的应用。
[0004]血清白蛋白是血液缓冲系统的组分之一，具有营养作用，是维持血液胶体渗透 压的主要成分和运输内源性及外源性物质的重要载体。牛血清白蛋白（BovineSerum A化umin，BSA)作为血浆的主要成分蛋白（0. 38g/mL)，由于其分子量小、成本低、结构稳定、 优异的结合性能W及与人血清白蛋白（HumanSerumA化umin)的结构同源性而引起广泛的 研究。本发明通过在方酸染料的侧链引入亲水性基团氧酸链，W增强其水溶性，所得非对称 近红外方酸染料纯度高、稳定性好，可作为巧光和比色双响应的蛋白标记物，用于血清蛋白 等的检测。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种非对称近红外方酸染料及其制备方法与应用，通过在 方酸染料的侧链引入亲水性基团氧酸链，W增强其水溶性，所得染料稳定性好，光学性能优 异，且合成方法简单，反应条件容易控制，产物纯度高，可作为巧光和比色双响应的蛋白标 记物，用于血清蛋白等的检测。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种非对称近红外方酸染料，其结构式为：
[0007]所述非对称近红外方酸染料的制备方法包括W下步骤： 1) 将方酵
，并 在氮气保护下进行回流分水处理； 2) 反应结束后，将所得反应混合物冷却至室溫，减压除去溶剂，得粗产品； 3) 所得粗产品经二氯甲烧洗涂后，采用硅胶柱层析进行梯度洗脱，得所述非对称近红 外方酸染料。
[000引上述步骤1)中所用
均摩 尔比为2:4:3;所用溶剂为正下醇和苯按体积比2:1混合而成。
[0009] 步骤3)中所述梯度洗脱是先用二氯甲烧进行洗脱，再将二氯甲烧与甲醇按体积比 100:1混合后进行洗脱。
[0010] 其中，所过
9合成方法包括如下步骤： 1) 将间氨基苯酪、
和碳酸钢混合，溶于异丙醇与水按体积比1:1 混合的溶液中，在氮气保护下揽拌加热至85°c，然后回流反应48小时，反应完毕冷却至室 溫； 2) 加入饱和食盐水混匀后，用二氯甲烧萃取，所得有机相用无水硫酸儀干燥后，旋蒸除 去溶剂得粗产物； 3) 将所得粗产物经硅胶柱层析纯化即得成品。
[0011] 所a
的合成方法包括如下步骤： 1) 将间氨基苯酪、漠乙烧和碳酸钢混合，溶于异丙醇与水按体积比1:1混合的溶液中， 在氮气保护下揽拌加热至85°C，然后回流反应24小时，反应完毕冷却至室溫； 2) 加入饱和食盐水混匀后，用二氯甲烧萃取，所得有机相用无水硫酸儀干燥后，旋蒸除 去溶剂得粗产物； 3) 将所得粗产物经硅胶柱层析纯化即得成品。
[0012] 所得非对称近红外方酸染可作为巧光和比色双响应的蛋白标记物用于血清蛋白 等的检测。
[0013] 本发明的显著优点在于：本发明通过向苯胺侧链接入氧酸链，调节了染料的溶解 性能和聚集行为，改善了其在水中的溶解性，从而影响了染料的光物理性质。所得非对称近 红外方酸染料稳定性好，光学性能优异，可作为巧光和比色双响应的蛋白标记物，用于生物 分子标记、分析和分离等多个领域。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明非对称近红外方酸染料在不同溶剂中的吸收光谱变化图。
[0015]图2为本发明非对称近红外方酸染料在不同比例的乙醇-水溶液中的吸收光谱变 化图。
[0016] 图3为本发明非对称近红外方酸染料在抑7. 0的PB缓冲液（10ml)中对不同浓 度BSA的吸收光谱图（A)和巧光光谱图（B) (Aex=620nm，PMT=650V，slit=5nm/5皿)。
[0017]图4为本发明非对称近红外方酸染料在纯水中的粒径分布图（A)与滴加BSA后的 粒径分布图（B)。
[0018] 图5为本发明非对称近红外方酸染料在660nm处巧光强度对BSA的响应随抑值 变化趋势图（^ex=620nm，PMT=650V，slit=5nm/5nm)。
[0019] 图6为本发明非对称近红外方酸染料在抑7. 0的PB缓冲液（10ml)中滴加BSA 及其它生物干扰物时的巧光光谱图（^ex=620皿，PMT=650V，slit=5nm/5皿）。
【具体实施方式】
[0020] 为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合【具体实施方式】对本发明所述的 技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[00川 实施例1
含成的具体步骤： 在50血的洁净；口烧瓶中加入间氨基苯酪（0. 196g，1.80臟01)，::满、窃一興S (0. 988g，3. 60mmol),碳酸钢（0.267g，2. 52mmol),再加入30血异丙醇-水混合液 (1:1，v/v)溶解、混匀，在氮气保护下揽拌加热至85°C，然后回流反应48小时，TLC跟踪至原 料点完全消失，即为反应终点。反应结束后，旋蒸除去反应混合液中的异丙醇。然后将生成 物转移至100mL的分液漏斗中，加入少量的饱和食盐水，然后用30mL的二氯甲烧萃取S 次，合并有机层。用无水硫酸儀干燥有机层，静置，过滤除去硫酸儀，母液经旋蒸除去多余的 二氯甲烧。所得物质用硅胶柱提纯，先W石油酸：乙酸乙醋（1.5:l，v/v)为洗脱剂除去杂质 和单取代间径基苯胺衍生物，再将洗脱剂极性增大为石油酸：乙酸乙醋（1:1，v/v)，得到淡 黄色的油状物0.200g，即为目标的双取代间径基苯胺衍生物，产率35 %。古NMR(400MHz, CDCI3) :S7. 01 (t，方8. 4Hz，lH)，6. 23 (d，方6. 3Hz，2H)，6. 17 (d，方8. 1Hz，lH)，3. 60 (t，方6. 3Hz,細），3. 53 (dd，方 13. 4,6. 4Hz,細），3. 39 (s，細）。"cNMR(100MHz'CDCls): 5 157. 43,149. 29,130. 21，104. 02,103. 42,99. 02, 72. 02, 70. 48,68. 44, 58. 92, 50