一种甲壳低聚糖重金属生物修复剂及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及重金属生物修复，尤其是涉及一种甲壳低聚糖重金属生物修复剂及其 制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 随着工业快速发展以及人类活动逐渐加强，土壤重金属污染的问题也日益严重， 其中土壤Cd污染范围最广、污染程度最严重。其中Cd是造成耕地土壤重金属污染的最主要 来源。2013年2月，南方日报刊发了《湖南问题大米流向广东餐桌》的文章，耕地土壤受重金 属Cd的污染引起广泛关注。福州除了滨海岛屿区外，其他几类区域都出现Cd含量超标现象， 近郊区菜地土壤中Cd含量超标率最高，其超标率为40 % (丁玉娟，林昌虎，何腾兵，等.蔬菜 重金属污染现状及研究进展[J].贵州科学，2012，5:78-83)。
[0003] 我国受重金属污染严重，微生物修复技术通过改变重金属的生物有效性，来降低 其毒性或提高其超积累植物富集量，减少重金属对食物链的污染，兼具成本低和促进土壤 可持续生产的优越性和科学性，土壤淋洗技术也是去除土壤重金属的有效方法，利用淋洗 剂溶解土壤中的重金属使其随淋洗液流出，然后对淋洗液进行后续处理，从而达到修复土 壤污染的目的。中国专利CN201110334587.6提供一种重金属污染土壤的化学淋洗修复方 法，该方法使用Na 2EDTA溶液淋洗重金属污染土壤，有效去除土壤中的有效态镉和铅，但 EDTA存在价格昂贵且在自然环境体系中难以降解。
[0004] 壳聚糖具有较强的金属离子配位能力，其分子中的氨基和与氨基相邻的羟基基与 许多金属离子(如取2+、附 2+、〇!2+、？132+、0(12+等）能形成稳定的鳌合物（李增新，梁强，孟韵， 等.壳聚糖对污染土壤中吸附态Pb( Π )的解吸作用[J].生态环境，2008,（03): 1049-1052)。 相关研究人员根据壳聚糖分子链中含有大量氨基和羟基，对壳聚糖进行酰化、酯化和醚化 等化学改性，生成一系列壳聚糖衍生物，可改善其水溶性、生物活性及力学性能，拓展壳聚 糖对水体、土壤环境中重金属的修复功能(武娜娜.壳聚糖改性吸附剂的制备及其在重金属 污染的污水和土壤处理中的应用[Μ ].华南理工大学，2 0 1 4 )。甲壳低聚糖 (chitooligosaccharides，缩写为C0S)是由甲壳素(〇11；[1:;[11)和壳聚糖((311；[1:08&11)经水解后 产生的一类低聚合度、可溶于水的氨基糖类化合物，是甲壳素低聚物（chi tin oligosaccharides)和壳寡糖（chitosan oligosaccharides)的总称，具有较高水溶性，能 够改善土壤的微生物体系以及土壤团粒结构。由于甲壳低聚糖分子量小，所以甲壳低聚糖 与重金属螯合后，容易被植物吸收。中国专利CN201410078241.8提供一种亚磷酸盐-壳寡糖 复合生物药肥的制备方法，该亚磷酸盐-壳寡糖复合生物药肥，既是一种生物肥料，又是一 种生物农药，同时还是一种重金属污染土壤原位修复剂;亚磷酸能使重金属形成难溶性的 磷酸盐沉淀，但壳寡糖与重金属结合后容易被植物吸收，造成植物重金属超标。中国专利 CN201110413145.0提供一种修复重金属镉污染土壤的方法，采用壳聚糖、微生物联合植物 修复重金属污染，但壳聚糖水溶性差，需要溶解在浓盐酸溶液中，一定程度上限制了其应 用。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于针对现有技术存在的上述问题，提供不仅制备方法简单、环境友 好，而且能够促进土壤有效态镉含量的增加，提高土壤淋洗效果或强化植物对镉吸收的一 种甲壳低聚糖重金属生物修复剂及其制备方法与应用。
[0006] 所述甲壳低聚糖重金属生物修复剂按质量比的组成为甲壳低聚糖溶液5~70、地 衣芽孢杆菌发酵液10~30、胶冻样芽孢杆菌发酵液10~50。
[0007] 所述甲壳低聚糖重金属生物修复剂按质量比的组成优选为甲壳低聚糖溶液30~ 60、地衣芽孢杆菌发酵液10~20、胶冻样芽孢杆菌发酵液10~40。
[0008] 所述甲壳低聚糖是利用淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)三炬03号种为发 酵菌，以虾蟹壳粉为原料，通过微生物发酵生产得到的发酵上清液经过阴离子表面活性剂 改性得到的。所述淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)三炬03号种已于2010年6月30日 保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编:430072，保藏编号为 CCTCC Ν0:Μ 2010165。
[0009] 所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)三炬-10，已于 2015年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳 区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号： CGMCC N0.10741。
[0010] 所述胶冻样芽孢杆菌为胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)三炬01号菌 株，已于2010年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京 市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编 号：CGMCC N0.3995。
[0011] 所述甲壳低聚糖重金属生物修复剂的制备方法，包括以下步骤：
[0012] 1)制备改性甲壳低聚糖溶液
[0013] 配制PDA培养基，将淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus)三炬03号种孢子液，涂 布于营养琼脂平板上培养，再用无菌生理盐水将营养琼脂平板上的淡紫拟青霉 (Paecilomyces lilacinus)三炬03号种孢子液的孢子洗涤，制成孢子悬液;将孢子悬液接 入种子培养基中培养得种子液;再将种子液接种至发酵培养基中发酵培养48~72h得淡紫 拟青霉发酵液;将淡紫拟青霉发酵液离心去除菌体，获得上清液，浓缩，制得含量10 %~ 15 %的甲壳低聚糖溶液;在制得的甲壳低聚糖溶液中加入等摩尔质量浓度为20~lOOmmol/ L的阴离子表面活性剂溶液，振荡2~48h，制得改性甲壳低聚糖溶液；
[0014] 2)制备地衣芽孢杆菌发酵液
[0015] 配制营养琼脂培养基，将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)三炬-10接种 在营养琼脂平板上进行划线培养，从营养琼脂平板上将活化好的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)三炬-10用无菌生理盐水洗涤，制成菌悬液，将菌悬液接种至种子培养基中 培养，得种子液，再将种子液接种至发酵培养基中发酵，制得地衣芽孢杆菌发酵液；
[0016] 3)制备胶冻样芽孢杆菌发酵液
[0017]配制无氮固体培养基，将胶冻样芽孢杆菌为胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus)三炬01号菌株接种在无氮固体培养基平板上进行划线培养，从无氮固体培 养基平板上将活化好的胶冻样芽孢杆菌为胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)三 炬01号菌株转接至无氮固体培养基中培养，得种子液，再将种子液接种至发酵培养基中发 酵，制得胶冻样芽孢杆菌发酵液；
[0018] 4)制备甲壳低聚糖重金属生物修复剂
[0019] 将步骤1)所得的改性甲壳低聚糖溶液、步骤2)所得的地衣芽孢杆菌发酵液、步骤 3)所得的胶冻样芽孢杆菌发酵液按质量比（5~70): (10~30): (10~50)混合，即得甲壳低 聚糖重金属生物修复剂。
[0020] 在步骤1)中，所述PDA培养基的组成可为：去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂 15g/L，自然pH值;所述涂布于营养琼脂平板上培养的条件可于28~32°C下培养72~120h; 所述种子培养基的组成可为:蔗糖15g/L、大豆粉10g/L，、磷酸二氢钾lg/L、硫酸锌0.1g/L， 灭菌前pH值为6.0;所述将孢子悬液接入种子培养基的接种量按体积百分比可为8%~ 15%，稀释至OD600为0.2;所述将孢子悬液接入种子培养基中培养的条件可于28~32°C，150 ~200rpm下培养72~96h;所述发酵培养基的组成可为:虾蟹壳粉25g/L、蛋白胨2g/L;所述 种子液可按5~10 %接种量接入发酵培养基中；所述发酵培养的条件可为:接种后通风量为 l.Ovvm，在发酵过程中，根据二氧化碳的产生量，逐步增加通风量;发酵中、后期时，分三次 逐步流加10%的虾蟹壳粉混合悬浮液；所述阴离子表面活性剂可选自十二烷基磺酸钠 (SDS )、直链十二烷基苯磺酸钠 (LAS )、鼠李糖脂等中的至少一种，优选鼠李糖脂。
[0021] 在步骤2)中，所述营养琼脂培养基的组成可为牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠 5g/L、琼脂20g/L，灭前pH值为7.3;所述种子培养基的组成可为牛肉膏3 8/1、蛋白胨1(^/1、 氯化钠5 g / L，灭菌前p Η值为7.0 ;所述菌悬液接种的接种量按体积百分比可为菌悬液的 10%，菌悬液0D6Q() = 0.2;所述种子培养基中培养的条件可于28°C，18