专利名称：一株茚并芘降解菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于受污染土壤与水的生物降解处理技术领域，特别涉及一株茚并芘降解 菌及其应用。
背景技术：
多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons，简称PAHs)是指两个或两个以上 苯环组成的有机化合物。人为源如燃料、汽油、垃圾等不完全燃烧导致环境中的PAHs逐渐 增加。由于PAH吸附性强、水溶性差、特殊而稳定的环状结构，很难被生物利用，致使它们在 土壤环境中长期残留，并呈现不断积累的趋势。PAHs具有潜在的致畸性、致癌性和基因毒 性，对环境和人类身体健康构成极大的威胁，已引起世界各国的高度重视。生物降解是实现 恢复PAHs污染环境的最有效手段之一。一般来说，随着多环芳烃苯环数量的增加，其降解速率降低。因此，低分子量的多 环芳烃在环境中能较快被降解，在环境中存在的时间较短，而高分子量的多环芳烃则难于 降解，较长期存在于环境中。然而由于缺少高效的多环芳烃降解菌，制约了多环芳烃污染土 壤生物修复技术的进一步发展和应用。现有的微生物降解PAHs的研究普遍集中在低分子 量PAHs的降解微生物的筛选、分离与纯化，而对于高效降解高分子量PAHs的微生物报道较 少。分离与纯化高分子量PAHs高效降解菌是生物修复PAHs污染环境的关键。因此，需要从污染的环境中驯化筛选出对高分子量的多环芳烃(如茚并芘)降解 速率较快的微生物菌种，然后再把它们应用于实际PAHs污染环境的生物治理，这对于治理 和修复多环芳烃污染土壤有重要的意义。
发明内容
本发明提供一株茚并芘降解菌及其应用。所用菌株经鉴定为Pandoraea sp.ATSB32。该菌株16S rDNA的Genbank登录号为EF397589. 1，将该菌株制成含菌量为 1. 25X 108CFU/ml的菌悬液，可用于环境中茚并芘的降解。从污染土壤中分离纯化所述茚并芘降解菌的步骤如下(1)选取受石油污染的土壤，将其通过直径为2mm的网筛后立即放置于4°C冰箱中 保存备用。(2)向体积为IOOOmL的开口玻璃瓶中加入25 30mL浓度为lg/L的茚并芘的丙 酮混合溶液，为除去丙酮将玻璃瓶开口放置2天。(3)向步骤O)中开口玻璃瓶中加入500 600mL基础培养基，在转速为100r/min 的条件下搅拌40 50min后加入步骤(1)中的土壤250g ；然后置于温度为25 30°C的 环境中在转速为lOOr/min的条件下搅拌富集驯化培养30d，在培养期间定期向玻璃瓶中加 入基础培养基以维持玻璃瓶中泥浆系统的水土比例保持不变；其中基础培养基的组成为 NH4Cl :1. 5g · ΙΛ KH2PO4 :1. 5g · Λ MgCl2 :0. 25g · Λ CaCl2 · 2Η20 :0. IOg · Γ1。(4)向体积为100 200mL的锥形瓶中加入IOmL浓度为lg/L的茚并芘的丙酮混
3合溶液，为除去丙酮将锥形瓶开口放置2天。(5)向步骤中的锥形瓶中入50mL基础培养基、0. 5mL微量金属液和0. ImL维 生素 c 溶液；其中微量金属液的组成为=CoCl2 · 6H20 :35mg · L-1，CuCl2 :0. 20mg · L-1，H3BO3 6. Omg · ΙΛ MnCl2 · 4H20 :25mg · Λ Na2MoO4 · 2H20 :3. Omg · Λ NiCl2 · 2H20 :2. Omg · Λ ZnCl2 :2. 5mg · L-1。(6)向步骤(5)中的锥形瓶内接入步骤(3)驯化的土壤0.25g，然后置于温度为 25 30°C转速为lOOr/min的振荡器中培养5 7天，每天打开瓶口一次以恢复锥形瓶内 的溶解氧；按接种体积比为200 250 1的比例转入另一按步骤(4)至( 处理后的锥 形瓶内，当转接次数大于8之后即可获得高效去除茚并芘的好氧降解菌群。(7)向体积为500mL的锥形瓶内加入400mL基础培养基、1. OmL微量金属液、0. ImL 维生素c溶液，摇勻后作为液体培养基备用。(8)向体积为150mL的锥形瓶内加入50mL按步骤(7)配制的液体培养基和0. 60g 琼脂，然后在温度为121°C的高压锅中灭菌20分钟，在室温下冷却至65 70°C时，在超净 工作台中将其倒入体积为160mL的培养皿中，为除去培养基表面多余的水分将该培养皿在 超净工作台中放置2天。(9)在超净工作台中向步骤(8)中的培养皿中加入0. 5mL浓度为lg/L的茚并芘丙 酮溶液，来回倾斜转动培养皿使茚并芘的丙酮溶液均勻分布，为除去培养基表面的丙酮将 该培养皿在超净工作台中放置2天。(10)向体积为25mL的锥形瓶内加入IOmL按步骤(7)配制的液体培养基和0. 25g 琼脂，在温度为121°C的高压锅中灭菌20分钟，在超净工作台中冷却至38 40°C。(11)在超净工作台中向步骤(10)的锥形瓶中加入ImL步骤(6)得到的茚并芘好 氧降解菌群溶液，摇勻后吸取ImL慢慢加入步骤(9)中的培养皿中，来回倾斜转动培养皿使 接种有混合菌群的培养基溶液均勻分布。将培养皿放入温度为25°C的培养箱中培养观察， 10 15天后便可发现有明显的菌落出现。(12)在超净工作台中挑取步骤(11)培养皿中的菌落，进行重复分离，分离纯化8 个周期以上即可得到能够高效降解茚并芘的纯菌种。本发明的有益效果是所述的方法能够分离纯化到对茚并芘降解性能好的微生物 菌种。
具体实施例方式向加入茚并芘和基础培养基的开口玻璃瓶内加入受石油污染的土壤进行茚并芘 降解微生物的富集与驯化，30d后向加入茚并芘、基础培养基、微量金属液、维生素c溶液及 吸附剂的锥形瓶内接入富集驯化的土壤。在温度为25 30°C、转速为lOOr/min的振荡器 中培养5 7天后，进行循环转接，在循环次数大于8次后即可得到高效去除茚并芘的降解 菌群。在超净工作台中制作以茚并芘为唯一碳源和能源的琼脂固体培养基底层平板，在底 层平板上制作含有茚并芘降解菌群的琼脂固体培养基顶层平板，将制作好的培养基平板在 培养箱中培养10 15天。在超净工作台中向加入茚并芘、基础培养基、微量金属液、维生素 c溶液及吸附剂的锥形瓶内接入培养基平板中的菌落，在温度为25 30°C、转速为IOOr/ min的振荡器中培养5 7天。然后进行循环转接，在循环次数大于8次后即可得到能够降解茚并芘的纯菌种。 运用分离纯化得到的降解茚并芘的菌种Pandoraea sp. ATSB32制成菌悬液，含菌 量为1. 25X 108CFU/ml，进行降解茚并芘的降解试验。结果表明菌株Pandoraea sp. ATSB32 能够对茚并芘进行有效的降解，当茚并芘的初始浓度为0. 25mg/L、l. 19mg/L、2. 27mg/L、 4. 17mg/L 时，25 天后的降解去除率分别为43. 8%,55. 04%,55. 57%,37. 49%。
权利要求
1.一株茚并芘降解菌，其特征在于，所述菌株经鉴定为Pandoraea sp.ATSB32。
2.根据权利要求1所述茚并芘降解菌，其特征在于，该菌株16SrDNA的Genbank登录 号为 EF397589. 1。
3.一种权利要求1所述茚并芘降解菌的应用，其特征在于，菌悬液的含菌量为 1. 25X 108CFU/ml。
全文摘要
本发明公开了属于生物降解处理技术领域的一株茚并芘降解菌及其应用。茚并芘降解菌经鉴定为Pandoraea sp.ATSB32。该菌株16S rDNA的Genbank登录号为EF397589.1。将该菌株制成含菌量为1.25×108CFU/ml的菌悬液，对初始浓度分别为0.25mg/L、1.19mg/L、2.27mg/L、4.17mg/L的茚并芘在25天后的降解去除率分别为43.8％、55.04％、55.57％、37.49％。
文档编号B09C1/10GK102080055SQ20091022426
公开日2011年6月1日 申请日期2009年11月26日 优先权日2009年11月26日
发明者丁爱中, 杜勇超, 程莉蓉, 豆俊峰, 陈海英 申请人:北京师范大学