样品制备装置的制作方法

专利名称：样品制备装置的制作方法
技术领域：
技术领域为生物化学领域中的样品制备装置，尤其是使用用于样品过滤、分离和 纯化的多孔性单成体(monolith)过滤件的样品制备装置。
背景技术：
样品中盐、去垢剂和其它污染物的存在会不利于样品的生物化学分析。在生物化 学领域中，已研制出许多样品制备装置，以从包含目标分析物的液体样品中去除溶剂、溶质 和其它分子/物质。例如，美国专利第6，048，457号和第6，200, 474号描述一种移液吸头，该吸头中带 有用于纯化蛋白质和肽的层析介质。所述层析介质通常由带有C4、C18或强阳离子性树脂 如聚砜、聚醚砜、聚四氟乙烯、醋酸纤维素、聚苯乙烯、苯乙烯-丙烯腈共聚物和PVDF等的功 能化玻璃珠组成。美国专利第6，537，502号还描述一种样品纯化移液吸头，该样品纯化移 液吸头在移液吸头的内表面上具有用于样品分离和纯化的固体基体涂层。该固体基体由例 如聚四氟乙烯、聚砜、聚醚砜、聚苯乙烯、苯乙烯-丙烯腈共聚物和聚偏氟乙烯等聚合物组 成。然而，仍需要易于使用并可以以低成本生产的样品制备装置。

发明内容
本发明公开了一种样品制备装置。该样品制备装置包括限定第一开口和第二开口 之间的通路的外壳；和占据所述通路的一区段的样品过滤件。所述样品过滤件包含可与核 酸特异性结合的单成体吸附剂。本发明还公开了包含涂覆有可与目标分析物特异性结合的 捕获剂的玻璃料(frit)的样品过滤件，和包含带有可裂解细胞膜的浸渍的化学物质的亲 水性基质的样品过滤件。本发明还公开了一种一体式样品制备筒盒(cartridge)。所述一体式样品制备筒 盒包括样品制备装置和筒盒基座。所述样品制备装置包括限定第一开口和第二开口之间的 通路的外壳和占据所述通路的一区段的样品过滤件，所述样品过滤件包含可与目标分析物 特异性结合的吸附剂。所述筒盒基座包括经构造与所述样品制备装置界面接合的第一端 口、经构造与液体输送装置界面接合的第二端口和连接所述第一端口和第二端口的第一通 道。本发明还公开了一种样品纯化系统。所述样品纯化系统包括样品制备装置、筒盒 基座和液体输送装置。
5
本发明还公开了从样品中纯化出分析物的方法。所述方法包括将样品通过样品装 备装置，所述样品制备装置包括限定第一开口和第二开口之间的通路的外壳和占据所述通 路的一区段的过滤件，其中，样品过滤件包含可与所述分析物特异性结合的材料，所述样品 在通过所述样品制备装置的同时通过所述样品过滤件；和使用洗脱液洗脱结合于样品过滤 件的分析物，其中，所述样品和所述洗脱液通过同一开口进出所述外壳。


下文将参照下列附图进行详细的说明，其中，相同的附图标记表示相同的元件，附 图中图IA至ID是样品制备装置的多个实施方式的示意图。图2A至2C是一体式样品制备装置的一个实施方式的三维图(图2A)、顶视图(图 2B)和底视图(图2C)的示意图。图3示出了对从血样中纯化出的炭疽杆菌(Bacillus anthracis)核酸的实时PCR 分析。对照包括未经处理的悬浮在水中浓度为IO4CfuAil的炭疽杆菌和NTC (无模板对照)。图4示出了对从各种化脓链球菌(Sti^ptococcus pyogenes)浓度下的样品中纯 化出的化脓链球菌核酸的实时PCR分析。对照是未经处理的悬浮在水中浓度为104CfU/ml 的化脓链球菌样品和NTC(无模板对照)。图5示出了对从鼻咽样品中纯化出的炭疽杆菌核酸的实时PCR分析。对照是未经 处理的悬浮在水中浓度为104CfU/ml的炭疽杆菌。图6示出了对从血样中纯化出的委内瑞拉马脑炎病毒核酸的实时PCR分析。对照 是未经处理的悬浮在水中浓度为104pfu/ml的委内瑞拉马脑炎病毒和NTC(无模板对照)。 所有样品测试2次。图7是示出了 Flow Pro流体处理系统的样品切换屏的截屏。图8是示出了 Flow Pro流体处理系统(Global FIA Fox Island, WA)的实时PCR结 果屏的截屏。对照是未经处理的悬浮在水中浓度为104Cfu/ml的鼠疫菌(Yersinia pestis) 和NTC (无模板对照)。
具体实施例方式本说明书应结合附图来解读，所述附图应被看作本发明的整个书面说明的一部 分。为清楚和简洁目的，图形不一定按比例绘制，本发明的某些特征可能以放大的比例显 示，或者多少以示意的形式显示。在说明书中，相对性术语如“前”、“后”、“上”、“下”、“顶”和 “底”及其衍生词应被解释为是指之后所描述的取向或所讨论的图形中所显示的方向。这些 相对术语是为了描述方便，通常不意图要求特定方向。除非另有说明，否则涉及到附接和偶 联等(例如“连接”和“附接”)的术语是指其中多个结构通过中间结构相互直接或间接固 定或附接的关系以及可拆卸附接或刚性附接或关系。在描述本发明实施方式时，为了清楚起见而采用特定的术语。然而，本发明不意图 限于所选择的特定术语。应当理解的是，每个特定元件包括以类似方式操作达到类似目的 的所有技术等同物。本发明的一个方面涉及样品制备装置。在一个实施方式中，所述样品制备装置包括限定二个开口之间的样品通路的外壳；和嵌在所述通路的一区段的过滤件结构，所述过 滤件结构包括可与核酸特异性结合的单成体吸附剂。下文描述的实施方式中所用的术语“单成体吸附剂”或“单成体吸附剂材料”是指 单件形式的具有连续互连孔结构的多孔性三维吸附剂材料。单成体例如通过将前体铸造、 烧结或聚合到理想形状的模具中来制得。术语“单成体吸附剂”或“单成体吸附剂材料”是 为了与填充到床构造中或嵌入到多孔性基质中的单吸附颗粒集合(其中最终产品包含单 吸附剂颗粒)区别开。术语“单成体吸附剂”或“单成体吸附剂材料”还意在与吸附纤维或 涂覆有吸附剂的纤维的集合(如滤纸或涂覆有吸附剂的滤纸)相区分。下文描述的实施方式中所用的术语“特异性结合”或“特异性的结合”是指吸附剂 与分析物(如核酸)的结合所具有的特异性足以将分析物与样品的其他组分或污染物相区 分开。在一个实施方式中，吸附剂/配体复合体的解离常数小于约1X10_6M。本领域的普 通技术人员应当理解的是，可以通过结合和洗脱缓冲液配方控制分析物与吸附剂的结合和 洗脱的严格性。例如，可以使用KCl或NaCl通过盐浓度控制核酸的洗脱严格性。核酸通过 其较高的负电荷而比蛋白质更耐洗脱。温度、PH和温和去垢剂是可以用于选择性结合和洗 脱的其它处理。采用热块(heat block)或水浴可以保持结合和洗脱的温度一致性。对结 合缓冲液的操作是优选的，这是因为需要评价改进型洗脱缓冲液对下游分析器的影响。下文描述的实施方式中所用的术语“核酸”是指具有任意长度的单独核酸和核酸 聚合链，包括天然存在的或人工合成的DNA和RNA(包括其类似物)或其修饰物，特别是那 些已知天然存在的修饰物。符合本发明的核酸长度的实例包括但不限于适合于PCR产物 (例如，约50至700个碱基对(bp))和人类基因组DNA(例如，约千碱基对(Kb)至十亿碱 基对(Gb))的长度。因此应当理解的是，术语“核酸”包括单核酸以及小片段(例如表达序 列标签或遗传片段)中的核苷酸段、核苷段(天然的或合成的和及其组合)、以及较大的链 (例如基因组材料，包括单个基因甚至是整条染色体)。现在参考图1A，样品制备装置100的一个实施方式包括外壳10和样品过滤件20。 外壳10限定了第一开口 14和第二开口 16之间的通路12。外壳10的形状和尺寸没有特别 的限制。优选的外壳构造基本为圆筒形，使得在操作过程中流动矢量(flow vector)基本 是直的，从而最小化或避免非圆筒形构造可能发生的稀释性清洗。在图IA至ID所示的实 施方式中，外壳10具有移液吸头(pipette tip)的几何形状，即第一开口 14的直径大于所 述第二开口 16的直径，第一开口 14在尺寸上与移液管的端部配合。样品过滤件20紧邻第 二开口 16设置，使得样品通过第二开口 16被带入到外壳10中以后马上得到过滤。在一个 实施方式中，样品过滤件20与第二开口 16邻接。在另一个实施方式中，样品过滤件20与 第二开口 16分隔Imm至20mm的距离。在另一个实施方式中，外壳10呈柱形几何形状。在一个实施方式中，外壳10具有约0. 1 μ 1至约IOml的容积。在另一个实施方式 中，外壳10具有5μ 1至约5ml的容积。适用于外壳10的材料没有特别限制，这些材料包 括塑料(如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯)、玻璃和不锈钢。样品过滤件20由可与核酸特异性结合的任何多孔性单成体材料制成。所述多孔 性单成体材料的孔隙率取决于用途。一般来说，多孔性单成体材料应该具有实现对于具体 用途所需的样品流速的孔隙率。在一个实施方式中，样品过滤件20由液体样品可以通过的精细多孔性玻璃料制
7成。多孔性玻璃料是始于粉碎珠子在热压机中形成单个的单成体结构的烧结玻璃，是纯化 核酸的优异基质。玻璃料的均勻结构提供了玻璃料内的可预见的液体流动，并允许洗脱液 在样品流动时具有类似的流体动力学。所述可预见的液体流动也导致了在洗脱过程中的较 高回收。适合于本发明(包括本文所述的各种实施方式)使用的示例性的玻璃料孔径为约 2微米至约220微米。在一个实施方式中，玻璃料的孔径为约2微米至约100微米。在另一 个实施方式中，玻璃料的孔径为约40微米至约75微米。在另一个实施方式中，玻璃料的孔 径为约150微米至约200微米。在又一个实施方式中，玻璃料的孔径为约2微米至约20微 米。对于涉及纯化微生物DNA的用途，尺寸为约10微米至约15微米的玻璃料是适合的。在一个实施方式中，玻璃料的厚度为约Imm至约20mm。在另一个实施方式中，玻璃 料的厚度为约2mm至约5mm。在又一个实施方式中，玻璃料的厚度为约2mm至约3mm。在另一个实施方式中，玻璃料经化学处理而使其表面功能化。例如，玻璃料可以用 氨基硅烷衍生化或以ChargeSwitch 技术(Invitrogen，Carlsbad，CA)处理以产生正电 荷，从而更好地吸附带负电荷的核酸。虽然玻璃料是核酸的良好吸附剂，但是本领域技术人员应当认识到，玻璃料也可 用于吸附其他类型的分子。例如，玻璃料可以包被有抗体以从样品中提取出其他目标配体。 在一个实施方式中，玻璃料在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和环烯烃共聚物COC中用作为微 生物和毒素的捕获部分的抗体进行衍生化。在此使用的术语“抗体”取尽可能广泛的含义， 并可以包括但不限于抗体、重组抗体、遗传工程抗体、嵌合抗体、单特异性抗体、双特异性抗 体、多特异性抗体、嵌合抗体、异种抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、骆驼化抗体、脱免疫抗体 以及抗独特型抗体。术语“抗体”还可以包括但不限于抗体片段，如完整抗体的至少一部 分，例如抗原结合可变区。抗体片段的实例包括Fv、Fab、Fab'、F(ab' )、F(ab' )2、Fv片 段、双链抗体(diabody)、线性抗体、单链抗体分子、多特异性抗体和/或抗体的其他抗原结 合序列。在另一个实施方式中，玻璃料包被有凝集素，该凝集素可结合见于细菌衣膜中的糖 类，并可以用来捕获样品中的细菌。在另一个实施方式中，样品过滤件20由多孔性玻璃单成体、多孔性玻璃陶瓷或多 孔性单成体聚合物制成。多孔性玻璃单成体可以使用美国专利第4810674号和4765818号 (在此通过参考的方式将其引入本文)所述的溶胶凝胶法制备。多孔性玻璃陶瓷可以通过 多孔性玻璃单成体的受控结晶制备。多孔性单成体聚合物是在过去10年发展起来的一类新材料。与由非常小的珠子 组成的聚合物不同，单成体是使用简单的成型工艺制备的聚合物单个连续件。在一个实施 方式中，外壳10用作多孔性单成体聚合物的模具。简而言之，外壳10的通路12的一区段 填充有单体和致孔剂的液体混合物。接着，将具有紫外光非透性的掩模放置在填充区段上。 掩模具有暴露填充区段的一小部分的小狭口。最后，利用紫外光通过掩模上微小开口照射 填充区段的单体/致孔剂的混合物。UV照射触发聚合过程，该过程在通路12的填充区段中 形成固体多孔性单成体材料。在又一个实施方式中，样品过滤件20由带有可裂解细胞膜、使蛋白质变性或诱捕 核酸的浸渍化学物质的亲水基质制成。在一个实施方式中，亲水基质是FTA 纸(Whatman， Florham Park，NJ)。将生物样品施加到FTA 纸上，样品中所含有的细胞在纸上裂解。将该纸洗涤以除去所有非DNA材料(DNA依然缠结在纸内)。然后洗脱DNA以用于后续的分 析。样品过滤件20的形状与通路12紧密配合，以防止样品在操作过程中绕过过滤件 20旁流(channel)或旁通(bypass)。在一个实施方式中，过滤件20通过机械方式如卷曲、 压配和热收缩外壳10或其一部分而与通路12配合。在另一个实施方式中，过滤件20通过 粘合剂附接到通路12的内部。在又一个实施方式中，玻璃料的侧部随通路12的轮廓而逐 渐变细(taper)。在图IA至ID所示的实施方式中，外壳10具有截头锥形移液吸头的形状， 第一开口 14在尺寸上与液体输送系统(如手动移液器或电子移液设备)的端部配合。样 品通过第二开口 16吸起，通过样品过滤件20，然后保持在外壳10的高于样品过滤件20的 区段中。在一个实施方式中，液体输送系统是电子移液设备，如电子移液器或自动移液站。在一个实施方式中，样品过滤件20包括至少包括两个区段，即与核酸特异性结合 的第一区段22和与另一种目标分析物如蛋白质特异性结合的第二区段24 (图1B)。在另一 个实施方式中，外壳10含有置于第二开口 16和样品过滤件20之间的预过滤件30 (图1C)。 预过滤件30具有大于样品过滤件20的孔径，并且不与核酸特异性结合。在又一个实施方 式中，外壳包含邻近第一开口 14的气溶胶过滤件40，以防止来自泵吸设备的污染(图1D)。在另一个实施方式中，外壳10在样品过滤件20和气溶胶过滤件40之间的空间中 还包含多个机械裂解珠如玻璃珠。通过对整个样品制备装置100进行涡旋，机械裂解珠可 用于破坏细胞和释放核酸。在该实施方式中，在涡旋过程中第二开口 16可以盖有盖帽，以 防止液体从第二开口 16漏失。本发明的另一个方面涉及一体式样品制备筒盒。现在参考图2A至2C，一体式品 制备筒盒的实施方式200包括基座50和样品制备装置100。该基座50包含在顶部表面61 上的第一样品端口 51和第二样品端口 52、在底部表面62上的第三样品端口 53和第四样品 端口 54、将第一样品端口 51和第三样品端口 53连接的第一通道55、将第二样品端口 52和 第四样品端口 54连接的第二通道56、和将第一通道55和第二通道56连接的第三通道57。第一样品端口 51构造成收纳样品制备装置100，使得样品制备装置100(不管是柱 形构造还是移液吸头构造)能够容易地插入到第一样品端口 51中并与基座50形成不漏液 体的密封。在附接到第一样品端口 51后，样品制备装置100就保持竖直位置。样品可以从第 一开口 14 (即沿着样品通路12下行)或第二开口 16 (即沿着样品通道12上行)装载到样 品制备装置100。作为另一种选择，样品制备装置100可以带有预装载样品而附接到第一样 品端口 51上。第二样品端口 52还可以用来将液体导入一体式样品制备筒盒200中或从一体式 样品制备筒盒200中取出液体。第二样品端口 52构造成收纳液体输送装置(如移液器 或自动移液站)的端部26。在一个实施方式中，第二样品端口 52是包含能够被移液吸头 刺穿并且在取出吸头后密封的密封件58的自密封入口。这种用于移液管的自密封进入端 口允许容易地导入样品而不存在盖子打开(常常是导致污染的因素)的风险。在一个实 施方式中，密封件58是来自Abgene (Epsom, UK)的Multisip 拼合式隔栓(splits印turn plug)。在另一个实施方式中，密封件58是配流阀(port valve)，例如来自Minivalve International (Yellow Springs,OH)鸭嘴阀和圆顶阀。在另一个实施方式中，第一样品端口 51还含有可容纳样品制备装置100的自密封装置，例如圆顶阀或隔件。在另一个实施方式中，第一样品端口 51和/或第二样品端口 52可以用螺丝帽或 压合盖(press fit cap)密封，以允许导入和取出样品。该端口也可以用胶带封条密封，以 防止在自动化加工过程中泄漏。第一通道55、第二通道56、第三个通道57将第一样品端口 51与第二样品端口 52 连接，使得核酸纯化过程可以在一体式样品制备筒盒200中完成。第三样品端口 53和第四 样品端口 54可以连接到废物瓶，以收集来自样品制备装置100的流通物。一体式样品制备筒盒200可构造成与流体控制系统如Flow Pro流体处理系统 (Flow Pro Fluidic Handling System, Global FIA, Fox Island, WA)相容。在一个实施 方式中，第一样品出口 53和第二样品出口 54与鲁尔激活阀(Luer-activated valve)59配 合。鲁尔激活阀59是通常关闭、只有在插入鲁尔式配件(luer-type fitting)时才可以打 开的阀。鲁尔激活阀59允许容易地插入流体控制系统，并在样品制备筒盒200从流体控制 系统取出后防止样品从样品制备筒盒200泄漏。在一个实施方式中，一体式样品制备筒盒 200设计成可塞进流体控制系统而无需紧固螺丝或调节螺栓。本领域普通技术人员应该理解的是，一体式样品制备筒盒200的总体布局允许其 他样品导入和洗脱抽取策略。在一个实施方式中，样品制备筒盒200连接到流体控制系统。 样品制备装置100插入第一样品端口 51。样品通过第二样品端口 52引入一体式样品制备 筒盒200，所述第二样品端口 52在导入样品后密闭。离液剂(chaotrophe)如胍通过流体控 制系统经第四样品端口 54导入一体式样品制备筒盒200，并与一体式样品制备筒盒200内 的样品混合。然后样品/离液剂混合物从样品制备装置100的第二开口 16被推入样品制 备装置100中，通过过滤件20，进入外壳10的高于样品过滤件20的区段。然后样品/离液 剂混合物从一体式样品制备筒盒200经第二样品端口 54取出并作为废物弃掉。通过流体 控制系统经第三样品端口 53将洗涤缓冲液导入一体式样品制备筒盒200中。类似于样品 /离液剂混合物的运动，使洗涤缓冲液强制进入样品制备装置100然后从中取出，在该过程 中通过过滤件20两次。洗涤步骤可以重复若干次。最后，洗脱缓冲液经第二开口 16导入 到样品制备装置100中，将所结合的核酸洗脱到外壳10的高于样品过滤件20的区段中，并 从此处将洗脱物移出以作进一步的分析。在另一个实施方式中，样品经与第一样品端口 51附接的样品制备装置100的第一 开口 14导入，并从第二样品端口 52移出洗脱物。在另一个实施方式中，样品经与第一样品 端口 51附接的样品制备装置100的第一开口 14导入，并从样品制备装置100的第一开口 14移出洗脱物。在另一个实施方式中，样品经第二样品端口 52导入到与第一样品端口 51 附接的样品制备装置100，并从第二样品端口 52移出洗脱物。在另一个实施方式中，样品预 装载到样品制备装置100中，然后将样品制备装置100插入到一体式样品制备筒盒200的 第一样品端口 51中。经过洗涤和洗脱步骤，从第二样品端口 52移出洗脱物。在又一个实 施方式中，样品预装载到样品制备装置100中，然后将样品制备装置100插入到一体式样品 制备筒盒200的第一样品端口 51中。在洗涤步骤后，将与样品过滤件20结合的分析物洗 脱到样品制备装置100中，然后样品制备装置100从第一样品端口 51取出，样品过滤件20 和气溶胶过滤件40之间的空间内是洗脱缓冲液中的经纯化的分析物。一体式样品制备筒盒200易于使用。首先，该装置不需要离心，从而免除了与将样
10品从试管转移到离心柱有关的复杂性，并且简化了所需要的仪器。另外，移液器的自密封进 入端口允许容易地导入样品而不存在盖子打开(常常为导致污染的因素)的风险。此外， 鲁尔激活阀使筒盒插入和取出简单而方便，而又不存在过程完成后由于泄漏而损失样品的 风险。此外，样品制备装置100的竖直取向迫使气泡从样品过滤件20上升至设备的顶 部，从而改善流体控制并促进分析物的结合和洗脱。此外，样品过滤件20的小孔将大气团 (air bolus)减小成可移行到样品通路12内部的液柱的顶部的小气泡，产生离液剂与样品 的振动混合效果。应当注意的是，样品制备装置100的移液吸头构造允许样品/清洗液/ 洗脱液经过样品过滤件20双向流动，而大多数样品制备方法依赖于在仅一个方向上经过 过滤件的流动。双向流动特征不仅允许样品液体被吸取到样品制备装置100中并经同一开 口(例如第二开口 16)从样品制备装置100洗脱出来，而且允许使用者上下吸取样品多个 循环，因此提供了处理大于样品制备装置100的容积的样品的能力。在一个实施方式中，通道55、56和57设计成具有尽可能短的长度以减少不必要的 生物分子(核酸)与一体式样品制备筒盒200内表面的吸附。通道也可以进行表面涂覆，以 减少不必要的生物分子吸附。在一个实施方式中，通道55、56和57的直径为0. Imm至5mm， 以减少表面与体积的比率，从而减少不必要的核酸吸附。在除去洗脱物后，一体式样品制备筒盒200从流控站取出并弃掉。一体式样品制备筒盒200的基座50可由对样品溶解/洗涤/洗脱过程中常用的 化学物质耐受的任何材料制成。在一个实施方式中，基座50由透明材料制成。基座50的 材料的实例包括但不限于聚碳酸酯和聚丙烯。所述流体控制系统可以是能够提供一体式样品制备筒盒200中所需流速的任何 流体控制系统。在一个实施方式中，流体控制系统是GlobalFIA (Fox Island，WA)的Flow Pro流体处理系统。
实施例实施例1 利用 2. Oml Rainin 过滤移液吸头(filtered pipette tip)和 3mm 的 玻璃料从含有炭疽杆菌的血样中纯化核酸在这个实验中，采用如下程序，利用2.0ml Rainin过滤移液吸头和3mm的玻璃料 (ROBU Glasfilter-Geraete GmbH，德国)从含有炭疽杆菌的血样中纯化核酸1、将1个15ml锥形管标记为流通物；并将4个1. 5ml离心管标记为乙醇1、乙 醇2、乙醇3和洗脱物。2、在流通物管内将360 μ 1的血液与40 μ 1的炭疽杆菌(IO5集落形成单位(cfu)/ ml，在水中)混合(终浓度为104cfu/ml)。3、将1120 μ 1 QiagenAL裂解缓冲液添加到混合物中。4、添加 80 μ 1 蛋白酶 K(20mg/ml)。5、添加400 μ 1的溶菌酶，旋涡并离心(spin down)。6、将样品混合物在55 °C温浴1小时。7、将2000 μ 1 96%至100%的乙醇添加到流通物管中。将混合物涡旋并脉冲离 心。
8、将100 μ 1洗脱缓冲液(IOmM的Tris，pH 8. 0)分取到洗脱物管中。将试管放在 设为70°C的热块上(洗脱缓冲液必须在70°C加热至少5分钟。将缓冲液保持在热块上直 到步骤13)。9、向3个乙醇管的每一根管中分取Iml 70%乙醇。10、通过Rainin电子移液器用玻璃料吸头(中等孔隙率)将样品混合物吸取到流 通物管中。吸打5个循环(循环=吸入+打出)。11、使用Rainin电子移液器，通过吸打乙醇1管中的70%乙醇10个循环来洗涤所 结合的核酸。以乙醇2管和乙醇3管中的70%乙醇重复所述洗涤(共三次洗涤)。12、通过吸打空气20个循环，将乙醇从玻璃料吸头吹除。如果留有可见量的乙醇， 则擦拭该吸头的外部并轻柔振敲该吸头。13、通过吸打步骤8的70°C的洗脱缓冲液10个循环来洗脱玻璃料上的核酸。缓冲 液可能开始起泡，但是继续吸打并且在结束时将微型离心管离心。确保所有的缓冲液已从 吸头吹除。14、收集洗脱物，并弃掉玻璃料吸头。15、通过实时PCR量化所洗脱的核酸。如图3所示，在洗脱物中检测到来自炭疽杆菌的核酸。实施例2 利用2. Oml Rainin过滤移液吸头和2mm的玻璃料从化脓链球菌中纯化
核酸在这个实验中，采用如下程序，利用2.0ml Rainin过滤移液吸头和2mm的玻璃料 (ROBU Glasfilter-Geraete GmbH，德国)从各种浓度的化脓链球菌悬浮液中纯化核酸1、将3个1. 5ml离心管标记为样品+胍、乙醇和洗脱物。2、通过用玻璃珠涡旋进行裂解。3、通过涡旋，将500 μ 1的化脓链球菌样品与500 μ 1的6Μ胍(ρΗ 6. 5)混合。保 留等份的未经处理的(即胍处理前(pre-guanidine)的化脓链球菌作为步骤10中的实时 PCR分析的对照。4、将100 μ 1洗脱缓冲液(ImM NaOH)分取到洗脱物管中。使用玻璃料吸头(中 度孔隙率)和Rainin电子移液器吸打样品/胍混合物。吸打5个循环(循环=吸入+打 出)。5、使用Rainin电子移液器吸打Iml 70%乙醇5个循环以洗涤所结合的核酸。6、采用电子移液器使空气通过玻璃料吸头以吹除乙醇。重复吸打20个循环以除 去痕量的乙醇。如果留有可见量的乙醇，则轻柔振敲玻璃料吸头。使用Kimwipe 除去吸 头外部的乙醇。7、使用来自步骤4的70°C洗脱缓冲液，通过吸打10个循环，从玻璃料上洗脱核酸。 确保所有的洗脱缓冲液已从该尖部吹除。8、收集洗脱物，并弃掉玻璃料吸头。9、通过实时PCR量化所洗脱的核酸。如图4所示，在通过玻璃料吸头制备的样品中检测到化脓链球菌的核酸。实施例3 利用2. Oml Rainin过滤移液吸头和2mm的玻璃料从含有炭疽杆菌的鼻
咽样品中纯化核酸
12
在这个实验中，采用如下程序，利用2.0ml Rainin过滤移液吸头和2mm的玻璃料 (ROBU Glasfilter-Geraete GmbH，德国)从含有炭疽杆菌的鼻咽样品中纯化核酸1、将3个1. 5ml离心管标记为样品+胍、乙醇和洗脱物。2、通过在样品+胍管中将450 μ 1的鼻咽物与50 μ 1炭疽杆菌(IO5集落形成单位 (cfu)/ml，在水中)混合(终浓度为104cfu/ml)制备鼻咽样品。保留一份等分试样的鼻咽 样品作为步骤11的实时PCR分析中的对照。3、将500 μ 1的6M胍(ρΗ 6. 5)添加到样品+胍管中并涡旋。4、将100 μ 1洗脱缓冲液(IOmM Tris, ρΗ8. 0)分取到洗脱物管中。将试管放于设 在70°C的热块上(洗脱缓冲液必须在70°C加热至少5分钟)。将试管保持在热块上直到步 骤9。5、使用玻璃料吸头(中度孔隙率)以Rainin电子移液器吸打样品/胍混合物。吸 打5个循环(循环=吸入+打出)。6、使用Rainin电子移液器吸打Iml 70%乙醇以洗涤所结合的核酸。7、采用电子移液器使空气通过玻璃料吸头以吹除乙醇。重复吸打20个循环以除 去痕量的乙醇。如果留有可见量的乙醇，则轻柔振敲玻璃料吸头。使用Kimwipe 除去吸 头外部的乙醇。8、使用来自步骤4的70°C洗脱缓冲液，通过吸打10个循环，从玻璃料上洗脱核酸。 确保所有的洗脱缓冲液已从吸头吹除。9、收集洗脱物，并弃掉玻璃料吸头。10、通过实时PCR量化所洗脱的核酸。如图5所示，在洗脱物中检测到来自炭疽杆菌的核酸。实施例4 利用1. 2ml Gilson过滤移液吸头和5mm的玻璃料从含有委内瑞拉马脑 炎病毒的血样中纯化核酸在这个实验中，采用如下程序，利用2.0ml Rainin过滤移液吸头和5mm的玻璃料 (ROBU Glasfilter-Geraete GmbH，德国)从含有委内瑞拉马脑炎病毒的血样中纯化核酸1、将6个1. 5ml离心管标记为流通物、乙醇1、乙醇2、乙醇3、洗脱物1和洗脱物 2。2、在流通物管内将90 μ 1的血液与10 μ 1的委内瑞拉马脑炎病毒(IO5菌斑形成 单位(pfu)/ml，在水中)混合(终浓度为104pfu/ml)。3、将280 μ 1 QiagenAL裂解缓冲液添加到混合物中。4、添加 40μ 1 蛋白酶 K(20mg/ml)。5、添加100 μ 1的溶菌酶，旋涡并离心。6、将样品混合物在55 °C温浴1小时。7、将500 μ 1 96%至100%的乙醇添加到流通物管中。将混合物涡旋并脉冲离心。8、将100 μ 1洗脱缓冲液(IOmM的Tris，pH 8. 0)分取到洗脱物管中。将试管放于 设在70°C的热块上(洗脱缓冲液必须在70°C加热至少5分钟。将试管保持在热块上直到 步骤13)。9、将Iml 70%乙醇分取到3个乙醇管的每一根管中。10、通过Gilson电子移液器用玻璃料吸头(中等孔隙率)将样品混合物吸取到流通物管中。吸打5个循环(循环=吸入+打出)。使用电子移液器，吸打乙醇1管中的70% 乙醇10个循环来洗涤所结合的核酸。以乙醇2管和在乙醇3管中的70%乙醇重复所述洗 涤(共三次洗涤)。通过吸打空气20个循环，将乙醇从玻璃料吸头吹除。如果留有可见量 的乙醇，则擦拭吸头的外部并轻柔地振敲吸头。11、通过吸打步骤8的70°C的洗脱缓冲液10个循环来洗脱玻璃料上的核酸。在这 些循环结束后，将洗脱缓冲液从热块上拿下。确保所有的缓冲液已从吸头吹除。12、在洗脱物1管中收集洗脱物。13、采用相同的玻璃料吸头重复步骤13，在洗脱物2管中收集洗脱物，并弃掉玻璃 料吸头。14、通过实时PCR量化所洗脱的核酸。如图6所示，在第一洗脱物和第二洗脱物中都检测到来自委内瑞拉马脑炎病毒的 核酸。不过，第一洗脱物所含委内瑞拉马脑炎病毒核酸的浓度高得多。实施例5 利用流体控制系统和一体式样品制备系统进行自动化样品制备将如图2A所示的一体式样品制备装置原型连接到Flow Pro流体处理系统 (Global FIA, Fox Island, WA) 0采用如下程序从鼠疫菌悬浮液中纯化核酸1、将2个1. 5ml离心管标记为样品和洗脱物。2、将150 μ 1的ImM NaOH分取到位于Global FIA系统上的标记为“洗脱缓冲液”
的试管中。3、将500μ1 70%乙醇分取到位于Global FIA系统上的洗涤管中。4、在“样品”管(步骤1)内将500μ1的鼠疫菌悬浮液(104cfU/ml，在水中)与 500 μ 1的6Μ胍(ρΗ 6. 5)混合并涡旋。保留一些未混合的样品用于随后的分析。5、使用Rainin电子移液器将样品/胍混合物吸取到玻璃料吸头(中等孔隙率)中。6、将玻璃料吸头(内含样品)放在位于Global FIA设备上的样品制备筒盒上。7、使用FloLV软件进行“玻璃料吸头样品切换(toggle) ”流程(图7)。8、使用FloLV软件进行“玻璃料吸头乙醇洗涤”流程。9、使用FloLV软件进行“玻璃料吸头乙醇干燥”流程。10、使用FloLV软件进行“玻璃料吸头洗脱”流程。11、一旦流程结束，即从Global FIA系统上取下玻璃料吸头，将该玻璃料吸头附接 到Rainin电子移液器上，并将洗脱物分配到标记为“洗脱物”的1.5ml的离心管中。11、弃掉该玻璃料吸头。12、通过实时PCR量化所洗脱的核酸。如图8所示，在洗脱物中检测到来自鼠疫菌的核酸。在此使用的术语和描述仅以示例(而非用作限定)的方式提供。本领域的技术人 员应当认识到，在所附权利要求书中限定的本发明及其等同方式的精神和范围内可以有很 多改变，其中除非另有说明，否则所有术语均按它们的尽可能广泛的含义来理解。
权利要求
一种样品制备装置，所述样品制备装置包括限定第一开口和第二开口之间的通路的外壳；和占据所述通路的一区段的样品过滤件，所述样品过滤件包含特异性结合核酸的单成体吸附剂。
2.如权利要求1所述的样品制备装置，其中，所述样品过滤件经化学处理而产生正电荷。
3.如权利要求1所述的样品制备装置，其中，所述单成体吸附剂选自由玻璃料、多孔性 玻璃单成体、和多孔性单成体聚合物组成的组。
4.如权利要求3所述的样品制备装置，其中，所述单成体吸附剂包含玻璃料。
5.如权利要求3所述的样品制备装置，其中，所述单成体吸附剂包含多孔性玻璃单成体。
6.如权利要求3所述的样品制备装置，其中，所述单成体吸附剂包含多孔性单成体聚 合物。
7.如权利要求1所述的样品制备装置，其中，所述样品过滤件包含特异性结合核酸的 第一区段和特异性结合目标分析物的第二区段。
8.如权利要求7所述的样品制备装置，其中，所述目标分析物是蛋白质。
9.如权利要求1所述的样品制备装置，其中，所述第一开口的直径大于所述第二开口 的直径，并且其中所述样品过滤件紧邻所述第二开口设置。
10.如权利要求9所述的样品制备装置，其中，所述玻璃料的侧部随所述通路的轮廓而 逐渐变细。
11.如权利要求1所述的样品制备装置，其中，所述外壳进一步包含紧邻所述第一样品 过滤件设置的第二样品过滤件。
12.如权利要求1所述的样品制备装置，其中，所述外壳进一步包含邻近所述第一开口 设置的气溶胶过滤件。
13.如权利要求1所述的样品制备装置，其中，所述外壳呈移液吸头的构造。
14.一种一体式样品制备筒盒，所述样品制备筒盒包含 样品制备装置，所述样品制备装置包含限定第一开口和第二开口之间的通路的外壳；和占据所述通路的一区段的样品过滤件，所述样品过滤件包含特异性结合目标分析物的 吸附剂；和筒盒基座，所述筒盒基座包含 经构造与所述样品制备装置界面接合的第一端口； 经构造与液体输送装置界面接合的第二端口 ；和 将所述第一端口与第二端口连接的第一通道。
15.如权利要求14所述的一体式样品制备筒盒，其中，所述筒盒基座由选自由聚碳酸 酯、聚苯乙烯和聚丙烯组成的组的材料制成。
16.如权利要求14所述的一体式样品制备筒盒，其中，所述液体输送装置是流控站。
17.如权利要求14所述的一体式样品制备筒盒，其中，所述第二端口包含鲁尔激活阀。
18.如权利要求14所述的一体式样品制备筒盒，其中，所述筒盒基座进一步包含第三端口 ；和将所述第三端口与所述第一端口连接的第二通道。
19.如权利要求18所述的一体式样品制备筒盒，其中，所述第三端口是自密封端口。
20.权利要求18所述的一体式样品制备筒盒，其中，所述第三端口包含隔件或单向阀。
21.一种筒盒基座，所述筒盒基座包含 具有顶侧和底侧的座体；第一端口，该第一端口形成在所述座体的所述顶侧上，并经构造与样品制备装置界面 接合；第二端口，该第二端口形成在所述座体的所述底侧上，并经构造与液体输送装置界面 接合；和第一通道，该第一通道将所述第一端口与所述第二端口连接。
22.如权利要求21所述的筒盒基座，其中，所述筒盒基座进一步包含 一个或多个另外的端口 ；和将所述一个或多个另外的端口与所述第一端口连接的一条或多条另外的通道。
23.一种样品制备装置，所述样品制备装置包含 限定第一开口和第二开口之间的通路的外壳；和占据所述通路的一区段的玻璃料，所述玻璃料涂覆有特异性结合目标分析物的捕获剂。
24.如权利要求23所述的样品制备装置，其中，所述捕获剂是抗体。
25.如权利要求23所述的样品制备装置，其中，所述捕获剂是凝集素。
26.一种样品制备装置，所述样品制备装置包含 限定第一开口和第二开口之间的通路的外壳；和占据所述通路的一区段的过滤件，所述过滤件包含带有裂解细胞膜的浸渍的化学物质 的亲水性基质。
27.如权利要求26所述的样品制备装置，其中，所述亲水性基质为FTA纸 。
28.一种从液体样品中纯化分析物的方法，所述方法包括 将所述液体样品放到容器中；将所述液体样品的至少一部分抽取到样品制备装置中，所述样品制备装置包括 限定第一开口和第二开口之间的通路的外壳；和占据所述通路的一区段的过滤件，所述样品过滤件包含特异性结合所述分析物的材料，其中，所述部分液体样品经由所述第一开口被抽取到所述外壳中并通过所述过滤件， 并且其中所述分析物在通过所述过滤件的同时与所述过滤件结合；使所述部分液体样品经由所述第一开口从所述样品制备装置中排出，其中所述部分液 体样品在离开所述样品制备装置的同时再一次通过所述过滤件；和通过将洗脱缓冲液经所述第一开口抽取到所述样品制备装置中并经所述第一开口从 所述样品制备装置排出所述洗脱缓冲液，从而由所述过滤件洗脱所述分析物，其中，所述洗 脱缓冲液在进入和离开所述样品制备装置的同时通过所述过滤件。
29.如权利要求28所述的方法，其中，所述方法进一步包括将洗涤缓冲液经所述第一开口抽取到所述样品制备装置中并经所述第一开口将所述 洗涤缓冲液从所述样品制备装置排出，从而洗涤所述过滤件，其中，所述洗涤缓冲液在进入 和离开所述样品制备装置的同时通过所述过滤件。
30.如权利要求29所述的方法，其中，所述洗涤步骤重复两次或多于两次。
31.如权利要求28所述的方法，其中，重复所述样品抽取和样品排出步骤直至所有所 述液体样品通过所述过滤件至少一次。
32.如权利要求28所述的方法，其中，所述分析物是核酸并且所述过滤件包含玻璃料。
33.如权利要求28所述的方法，其中，所述样品制备装置具有移液吸头构造。
34.如权利要求28所述的方法，其中，所述抽取、排出和洗脱步骤由电子移液器控制。
35.如权利要求28所述的方法，其中，所述抽取、排出和洗脱步骤由自动移液站控制。
36.一种从样品中纯化分析物的方法，所述方法包括 使所述样品通过样品制备装置，所述样品制备装置包括 限定第一开口和第二开口之间的通路的外壳；和 占据所述通路的一区段的过滤件，其中，所述样品过滤件包含特异性结合所述分析物的材料，并且所述样品在通过所述 样品制备装置的同时通过所述样品过滤件；和使用洗脱溶液洗脱结合在所述样品过滤件上的分析物，其中，所述样品和所述洗脱溶液通过同一开口进入和离开所述外壳。
37.如权利要求36所述的方法，其中，所述样品制备装置附接在筒盒基座上，所述筒盒 基座包含构造用于收纳所述样品制备装置的第一端口和构造用于收纳液体输送装置的第 二端口。
38.如权利要求36所述的方法，所述方法进一步包括使用洗涤溶液洗涤所述过滤件，其中，所述洗涤溶液通过同一开口进入和离开所述外tJXi O
39.一种样品纯化系统，所述样品纯化系统包括 样品制备装置，所述样品制备装置包括限定第一开口和第二开口之间的通路的外壳；和占据所述通路的一区段的样品过滤件，所述样品过滤件包含特异性结合目标分析物的 单成体吸附剂；筒盒基座，所述筒盒基座包含构造用于收纳所述样品制备装置第一端口；构造用于收纳液体输送装置的第二端口；将所述第一样品端口与所述第二样品端口连接的通道；和连接于所述筒盒基座的液体输送装置，所述液体输送装置控制所述样品制备装置和所 述筒盒基座中的流体流动。
40.如权利要求39所述的样品纯化系统，其中，所述液体输送装置通过所述外壳上的 同一开口将液体输送到所述样品制备装置中并将液体从所述样品制备装置中移除。
全文摘要
本发明公开了一种样品制备装置。所述样品制备装置包括限定第一开口和第二开口之间的通路的外壳；和占据所述通路的一区段的样品过滤件。所述样品过滤件含有可与核酸特异性结合的单成体吸附剂。本发明还公开了包含包被有可与目标分析物特异性结合的捕获剂的玻璃料的样品过滤件、包含带有裂解细胞膜的浸渍的化学物质的亲水性基质的样品过滤件、筒盒基座和一体式样品制备筒盒。
文档编号B01L3/00GK101883619SQ200880119131
公开日2010年11月10日 申请日期2008年6月25日 优先权日2007年10月31日
发明者克里斯多佛·G·库尼, 菲尔·贝尔格莱德 申请人:阿考尼生化系统公司