一种制备微液滴的加样针以及微液滴的制备方法与流程

[0001]
本申请涉及微流控技术、微尺度材料制备、微反应器以及微分析技术领域，具体涉及一种制备微液滴的加样针以及微液滴的制备方法。


背景技术：

[0002]
微液滴在各领域应用广泛，基于微液滴的微流控技术在单细胞分析、单细胞测序、数字pcr、蛋白质结晶、高通量反应筛选和单细胞功能分选等领域得到了快速的发展与应用。
[0003]
微液滴的生成是利用互不相溶的两相生成乳化的微液滴，微液滴相被称为分散相，包裹微液滴的相被称为连续相。微液滴生成后可以对其进行分裂、融合、混合、稀释、收集和分选等操作。因此对于微液滴的形状、大小以及单分散性的控制十分重要。
[0004]
现有技术中，微液滴生成技术主要以下几种。一种是利用微流控芯片生成微液滴，其原理是基于分散相和连续相在微通道中交汇时的界面失稳。根据其驱动力(如重力，离心力，推动力)的不同，其装置的复杂度和操作的繁琐度不同，因此需要熟练的操作人员才可以制作和操作。第二种是利用特殊装置喷射微量液体形成微液滴，如采用压电陶瓷、热激膨胀、高压电喷等特殊的喷射或微液滴激发方式，但是这种方式对微液滴体积的精确调控比较困难，且生物样品可能会受到一定程度的损坏。


技术实现要素：

[0005]
本申请的一个主要目的在于克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种用于制备大小均一、体积可控的微液滴的加样针。
[0006]
本申请的一个主要目的在于克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种容易更换和批量使用的用于制备微液滴的加样针。
[0007]
本申请的另一个主要目的在于提供一种利用所述加样针制备微液滴的方法。本申请的申请人基于申请号为201410655191.5，名称为微管道的液滴的生成方法的中国专利，申请号为201410655309.4，名称为基于微液滴的数字核酸扩增定量分析方法及系统的中国专利，以及申请号为 201821013244.3，名称为一种用于微液滴生成的吸头装置，继续研究了本申请，上述专利公开的方法和装置生成的微液滴大小可控且微液滴均一性较好。利用毛细管和一种带有金属毛细管的吸头装置，在毛细管上端集成了储液腔体，可方便进行更换，利用毛细管可直接吸取样品，并通过在油相液面下往复振动生成微液滴。但是这一加样针存在如下问题：为了生成纳升体积微液滴，金属毛细管内径小至100微米，这给加工和组装带来了较大困难，加样针的成本过高；吸取样品液时，由于毛细管阻力较大，容易产生真空和气泡，制约了取液速度，影响液滴生成的均一性；金属毛细管本身的疏水性不够，在生成液滴时，表面容易吸附样品液中的生物分子而变得亲水，导致液滴无法连续生成；而非金属毛细管的加工成本高，刚性弱，无法保证液滴生成的均一性。因此申请人基于上述方法以及装置的缺陷进一步研究了本申请。本申请提供一种可整体注塑生产的无外接毛细管吐液
口的新型微液滴制备加样针，利用加样针吐液部加工锥型开口吐液口，解决了直管道加工的困难，可大批量低成本加工；这一设计保证了振动时，吐液部的刚性和振动控制的精准性，实现了低成本的均一纳升液滴制备。
[0008]
为实现上述目的，本申请采用如下技术方案：
[0009]
1、一种制备微液滴的加样针，其特征在于，包括一体成型且相互贯通的储液部和吐液部，所述储液部为朝向所述吐液部的方向径向尺寸逐渐减小的中空圆台，所述吐液部为远离所述储液部的方向径向尺寸逐渐减小的中空圆台，所述储液部的锥度为c1，所述吐液部的锥度为c2，且c1≦c2，所述储液部的壁厚为d1，所述吐液部的壁厚为d2，且d1>d2。
[0010]
2、根据项1所述制备微液滴的加样针，其特征在于，所述储液部的高度为3～50mm，优选为5～30mm，锥度为2～30
°
，优选为2～20
°
，壁厚为 0.3～2.0mm，优选为0.4～0.5mm。
[0011]
3、根据项1所述制备微液滴的加样针，其特征在于，所述吐液部的高度为1～10mm，优选为2～5mm，锥度为10～60
°
，优选为10～20
°
，壁厚为 0.05～0.3mm，优选为0.1～0.2mm。
[0012]
4、根据项1所述制备微液滴的加样针，其特征在于，所述储液部远离所述吐液部的一端套设有适配部，所述适配部为朝向所述吐液部的方向径向尺寸逐渐减小的圆台，且所述适配部与储液部一体成型。
[0013]
5、根据项4所述制备微液滴的加样针，其特征在于，所述适配部远离所述吐液部的一端设置有环绕所述适配部的台阶部，所述台阶部朝向所述吐液部的一端设置有至少一条加强筋，且所述台阶部一体成型于所述适配部上。
[0014]
6、根据项4所述制备微液滴的加样针，其特征在于，所述适配部的高度为3～8mm，优选为3～5mm；锥度为2～6
°
，优选为3～4.5
°
。
[0015]
7、根据项4所述制备微液滴的加样针，其特征在于，所述适配部远离所述吐液部的一端为供液开口，所述吐液部远离所述储液部的一端为吐液开口。
[0016]
8、根据项7所述制备微液滴的加样针，其特征在于，所述吐液开口的内径为25～200μm，优选为50～200μm，更优选为100～180μm；所述吐液开口的外径为200～800μm，优选为250～550μm，更优选为350～450μm。
[0017]
9、根据项1～8中任一项所述制备微液滴的加样针，其特征在于，所述加样针由与纯水溶液的接触角不小于80度的材料制成，所述材料为氟化乙烯基丙烯共聚物、聚氟乙烯、聚醚砜树脂、聚苯硫醚、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚乙烯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、环烯烃聚合物、尼龙、聚甲醛、聚氯乙烯、或聚丙烯中的一种，优选为尼龙、聚乙烯、聚丙烯、或环烯烃聚合物。
[0018]
10、一种制备微液滴的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0019]
提供加样针；
[0020]
在所述加样针内注满载油，且所述加样针内的载油无气泡；
[0021]
提供盛有样品溶液的第一开口容器，移动加样针，使所述吐液部的吐液开口位于所述第一开口容器的液面上方；
[0022]
向下移动所述加样针，使所述吐液开口接触并浸入所述样品溶液，使得所述加样针内吸入所述样品溶液；
[0023]
提供盛有油性液体的第二开口容器，将吸入所述样品溶液的加样针移动至所述第二开口容器的液面上方；
[0024]
向下移动所述加样针，使所述吐液开口接触并浸入所述油性液体，将所述加样针在所述油性液体内做周期性往复运动并排液，从而使的所述吐液开口内的所述样品溶液进入所述油性液体内，形成大小均一的微液滴。
[0025]
11、根据项10所述的方法，其特征在于，所述加样针是项1-9中任一项所述的加样针。
[0026]
12、根据项10所述制备微液滴的方法，其特征在于，所述周期性往复运动为速度或加速度变化的周期性往复运动。
[0027]
13、根据项10所述的制备微液滴的方法，其特征在于，所述周期性往复运动的位置波形为正弦波、方波、三角波、梯形波、锯齿波或上述波形的叠加或组合。
[0028]
14、根据项10所述制备微液滴的方法，其特征在于，所述载油与所述样品溶液不互溶；所述油性液体与所述样品溶液不互溶。
[0029]
15、根据项10所述制备微液滴的方法，其特征在于，所述加样针灌注载油和加样针吐液生成液滴过程中，采用气泡探测方法或人工观察判断加样针内是否有气泡，以排除气泡对液滴体积均一性的影响。
[0030]
根据本申请所述的制备微液滴的加样针，通过采用“上部设有用于连接供液适配器的适配部，中部设有用于样品储存的储液部，下部设有用于微液滴生成的吐液部，所述适配部的上端开口为供液开口，所述吐液部的下端开口为吐液开口，从所述供液开口到所述吐液开口直径依次递减，所述吐液开口内径为25～200微米，外径为200～800微米，所述加样针与所述样品溶液以及所述油性液体接触时，接触角均不小于80
°
的设计，使得通过所述加样针制备微液滴时，由于所述加样针在所述油性液体内做速度变化的周期性往复运动，从而使得所述样品溶液在吐液开口处受到油性液体周期性的剪切力，进而使得所述加样针内的所述样品溶液进入所述油性液体内，实现了大小均一、体积可控的微液滴生成。
[0031]
本申请所述的制备微液滴的加样针，所述储液部的锥度为c1，所述吐液部的锥度为c2，且c1≦c2，所述储液部的壁厚为d1，所述吐液部的壁厚为d2，且d1>d2。较大的吐液部锥度结构保证了前端微小开口的可加工性及模具的寿命，也保证了吐液部的刚性。较厚的储液部壁厚保证了加样针整体的刚性，而较薄的吐液部保证了加样针前端尺寸较小，有利于减小往复运动时管壁对流体剪切力的衰减以及对油相的扰动，促进微液滴的可靠生成。
附图说明
[0032]
附图用于更好地理解本申请，不构成对本申请的不当限定。其中：
[0033]
图1为本申请公开的用于制备微液滴的加样针的示意图。
[0034]
图2为本申请公开的用于制备微液滴的加样针的底视图。
[0035]
图3为图2中a部分的放大图，示出了本申请提供的加样针的吐液开口的结构示意图。
[0036]
图4为本申请的储液部和吐液部的示意图。
[0037]
图5为利用本申请公开的微液滴制备方法制备微液滴的操作步骤示意图。
[0038]
图6a、6b和6c为本申请一个具体实施例中振动机构带动加样针在液面下或跨液面进行速度变化的周期性往复运动生成微液滴的原理示意图。
[0039]
图7为试验例1生成微液滴的实验结果图。
[0040]
图8a-8d为本申请吐液开口的管壁形状示意图。
[0041]
附图标记列表
[0042]
110-加样针；120-吐液部；130-储液部；140-适配部；150-吐液开口；160
-ꢀ
供液开口；170-供液适配器；180-台阶部；190-加强筋；200-样品溶液；210
-ꢀ
油性液体；220-微液滴；230-载油；240-振动机构。
具体实施方式
[0043]
以下结合附图对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。
[0044]
参考图1-图4所示，本申请提供一种制备微液滴的加样针110，包括一体成型且相互贯通的储液部130和吐液部120，所述储液部130为朝向所述吐液部120的方向径向尺寸逐渐减小的中空圆台，所述吐液部120为远离所述储液部130的方向径向尺寸逐渐减小的中空圆台，所述储液部130的锥度为c1，所述吐液部120的锥度为c2，且c1≦c2，所述储液部的壁厚为d1，所述吐液部的壁厚为d2，且d1>d2。较大的吐液部120的锥度结构保证了前端微小开口的可加工性及模具的寿命，也保证了吐液部120的刚性。较厚的储液部130的壁厚保证了加样针整体的刚性，而较薄的吐液部120保证了加样针前端尺寸较小，有利于微液滴的生成。
[0045]
锥度是指圆锥的底面直径与锥体高度之比，如果是圆台，则为上、下两底圆的直径差与锥台高度之比值。
[0046]
图4(a)为储液部的结构示意图，图4(b)为吐液部的结构示意图。
[0047]
储液部130的锥度
[0048]
吐液部120的锥度
[0049]
如图2-图3所示，所述储液部130与所述吐液部120均为两端开口的中空圆台状结构，所述储液部130可以为两端开口中空的圆台状结构，所述吐液部120可以为两端开口中空的圆台状结构，所述储液部130的下端与所述吐液部120的上端一体成型。储液部130用于存储载油230，所述吐液部120 用于吸取样品溶液200。
[0050]
所述加样针110制备微液滴220时，在所述加样针110内注满载油230，且所述加样针110内的载油230无气泡；然后将加样针110置于盛有样品溶液200的第一开口容器的液面内，使得所述加样针110的吐液部120吸入所述样品溶液200；然后将吸入所述样品溶液200的加样针110移动至盛有油性液体210的第二开口容器的液面内，使所述吐液开口150接触并浸入所述油性液体210，之后将所述加样针110在所述油性液体210内做速度变化的周期性往复运动，从而使得所述样品溶液200在吐液开口150处的吸附力减弱，进而使得所述加样针110内的所述样品溶液200进入所述油性液体210 内，实现了大小均一、体积可控的微液滴220生成。
[0051]
在本申请的实施方式中，所述储液部130的高度为3～50mm，优选为 5～30mm，锥度
为2～30
°
，优选为2～20
°
，壁厚为0.3～2.0mm，优选为0.4～0.5mm。
[0052]
所述储液部130的高度可以为3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、 9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、 19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm、25mm、26mm、27mm、28mm、 29mm、30mm、31mm、32mm、33mm、34mm、35mm、35mm、36mm、37mm、38mm、39mm、40mm、41mm、42mm、43mm、44mm、45mm、46mm、47mm、 48mm、49mm、50mm中的一种。
[0053]
所述储液部130的锥度可以为2
°
、3
°
、4
°
、5
°
、6
°
、7
°
、8
°
、9
°
、 10
°
、11
°
、12
°
、13
°
、14
°
、15
°
、16
°
、17
°
、18
°
、19
°
、20
°
、 21
°
、22
°
、23
°
、24
°
、25
°
、26
°
、27
°
、28
°
、29
°
、30
°
中的一种。
[0054]
所述储液部130的壁厚可以为0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、 0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、 1.7mm、1.8mm、1.9mm、2.0mm。
[0055]
在本申请的实施方式中，所述吐液部120的高度为1～10mm，优选为 2～5mm，锥度为10～60
°
，优选为10～20
°
，壁厚为0.05～0.3mm，优选为 0.1～0.2mm。
[0056]
所述吐液部120的高度可以为1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、 7mm、8mm、9mm、10mm中的一种。
[0057]
所述锥度可以为10
°
、11
°
、12
°
、13
°
、14
°
、15
°
、16
°
、17
°
、 18
°
、19
°
、20
°
、21
°
、22
°
、23
°
、24
°
、25
°
、26
°
、27
°
、28
°
、 29
°
、30
°
、31
°
、32
°
、33
°
、34
°
、35
°
、36
°
、37
°
、38
°
、39
°
、 40
°
、41
°
、42
°
、43
°
、44
°
、45
°
、46
°
、47
°
、48
°
、49
°
、50
°
、 51
°
、52
°
、53
°
、54
°
、55
°
、56
°
、57
°
、58
°
、59
°
、60
°
中的一种。
[0058]
所述吐液部120的壁厚可以为0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、 0.09mm、0.1mm、0.11mm、0.12mm、0.13mm、0.14mm、0.15mm、0.16mm、 0.17mm、0.18mm、0.19mm、0.2mm、0.21mm、0.22mm、0.23mm、0.24mm、 0.25mm、0.26mm、0.27mm、0.28mm、0.29mm、0.3mm。
[0059]
所述吐液部120较大的锥度能够在保证所述吐液开口150内径及外径较小的情况下使吐液部120的高度变短，增加了加样针110吐液部120的机械强度，有助于微液滴220制备的稳定性和微液滴220的均一性。
[0060]
在本申请的实施方式中，所述储液部130远离所述吐液部120的一端套设有适配部140，所述适配部140为朝向所述吐液部120的方向径向尺寸逐渐减小的圆台，且所述适配部与储液部为一体成型。
[0061]
所述适配部140可以用来连接供液适配器170，使得载油230通过所述供液适配器170进入所述储液部130。
[0062]
所述适配部140可以为两端开口的中空圆台状结构。
[0063]
所述储液部130与所述适配部140紧密连接。
[0064]
在本申请的实施方式中，如图8a所示，所述适配部140远离所述吐液部120的一端为供液开口160，所述吐液部120远离所述储液部130的一端为吐液开口150。
[0065]
如图8b-8d所示，所述吐液开口的三种变形，所述吐液开口的内径为等径设置，所述吐液开口的外径为等径或沿轴向逐渐较小。在图8b中所述吐液开口150为空心圆柱状，且所述吐液开口的内径和外径均为等径，所述吐液开口150与所述吐液部120一体成型，且所述吐液部120的端部的内径与所述吐液开口150的内径相等，且相互贯通。图8c和图8d与图8b的不同之处在于，图8c和图8d中的所述吐液开口150的下部的外径沿轴向逐渐减小。
[0066]
所述供液开口160与所述供液适配器170插接，从而使得所述载油230 能够顺利进入所述储液部130内。
[0067]
如图3所示，所述吐液开口150的内径r3为25～200μm，优选为 50～200μm，更优选为100～180μm；所述吐液开口150的外径r4为 200～800μm，优选为250～550μm，更优选为350～450μm。
[0068]
所述吐液开口150的r3内径可以为25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、 50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、 100μm、105μm、110μm、115μm、120μm、125μm、130μm、135μm、140μm、 145μm、150μm、155μm、160μm、165μm、170μm、175μm、180μm、185μm、 190μm、195μm、200μm中的一种。
[0069]
所述吐液开口150的外径r4可以为200μm、210μm、220μm、230μm、 240μm、250μm、260μm、270μm、280μm、290μm、300μm、310μm、320μm、 33μm、340μm、350μm、360μm、370μm、380μm、390μm、400μm、410μm、 420μm、430μm、440μm、450μm、460μm、470μm、480μm、490μm、500μm、 510μm、520μm、530μm、540μm、550μm、560μm、570μm、580μm、590μm、 600μm、610μm、620μm、630μm、640μm、650μm、660μm、670μm、680μm、 690μm、700μm、710μm、720μm、730μm、740μm、750μm、760μm、770μm、 780μm、790μm、800μm中的一种。
[0070]
在本申请的实施方式中，所述适配部140远离所述吐液部120的一端设置有环绕所述适配部140的台阶部180，所述台阶部180朝向所述吐液部120 的一端设置有至少一条加强筋190。即所述供液开口160的外表面设置有环绕所述适配部140的台阶部180，所述台阶部180为圆环状，且所述台阶部一体成型在所述适配部上。
[0071]
所述台阶部180套设于所述适配部140的供液开口160，且所述台阶部 180与所述适配部140紧密连接。所述台阶的直径大于加样针110盒内加样针110放置孔的直径，部分所述台阶与加样针110盒内的承放面接触，使所述加样针110阵列化悬空放置于加样针110盒内。
[0072]
所述加强筋190的数量可以为1条、2条、3条、4条、5条以及多条，当所述加强筋190为多条时，多条加强筋190可以为等间距设置。多条所述加强筋190能够在供液适配器170与所述适配部140紧密插接时增加加样针 110的机械强度。
[0073]
在本申请的实施方式中，所述加强筋190与所述适配部140均是朝向所述吐液部120延伸，即所述加强筋190的延伸方向与所述适配部140的延伸方向一致，所述加强筋190的底部与所述适配部140连接(此处加强筋190 的底部为加强筋190面向所述适配部140的一侧)。
[0074]
在本申请的实施方式中，所述适配部140的高度为3～8mm，优选为 3～5mm；锥度为2～6
°
，优选为3～4.5
°
。
[0075]
所述适配部140的高度可以为3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、 6mm、6.5mm、7mm、7.5mm以及8mm中的一种。
[0076]
所述适配部140的锥度可以为2
°
、2.5
°
、3
°
、3.5
°
、4
°
、4.5
°
、5
°
、5.5
°
以及6
°
中的一种。
[0077]
供液适配器170与所述适配部140紧密插接的部分的锥度为2-6
°
，保证了供液适配器170与所述加样针110连接处的气密性。
[0078]
在本申请的实施方式中，所述储液部130的储液体积为5-500μl，优选为20-60μl。
[0079]
所述储液部130的储液体积为5μl、10μl、20μl、30μl、40μl、50μl、 60μl、70μl、80μl、90μl、100μl、150μl、200μl、250μl、300μl、350μl、 400μl、450μl以及500μl中的一种。
[0080]
利用本申请提供的加样针110及微液滴制备方法制备微液滴时，所述加样针110内所吸取的样品溶液200的体积小于所述加样针110的储液体积范围，防止过多的样品溶液200进入供液适配器170从而引起交叉污染。
[0081]
在本申请中所述加样针110由与纯水溶液的接触角不小于80度的材料制成，所述材料包括但不限于氟化乙烯基丙烯共聚物(fep)、聚氟乙烯(pvf)、聚醚砜树脂(pes)、聚苯硫醚(pps)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(pbt)、聚乙烯(pe)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(abs)、聚甲基丙烯酸甲酯 (pmma)、聚碳酸酯、环烯烃聚合物、尼龙、聚甲醛、聚氯乙烯、或聚丙烯中的一种，优选为尼龙、聚乙烯、聚丙烯、环烯烃聚合物中的一种。
[0082]
氟化乙烯基丙烯共聚物(fep，接触角为98度)由四氟乙烯和六氟丙烯共聚而成，具有优良的耐热性能、绝缘性能、耐腐蚀性能、耐候性能、摩擦系数较低等特点。聚氟乙烯(pvf，接触角为98度)是氟乙烯均聚物，具有优良的耐热性能、绝缘性能、耐腐蚀性能、耐辐射性能、抗冲击性能等特点。聚醚砜树脂(pes，接触角为90度)是一种综合性能优异的热塑性高分子材料，具有优良的耐热性能、物理机械性能、绝缘性能、加工性能等，特别是具有可以在高温下连续使用和在温度急剧变化的环境中仍能保持性能稳定的突出特点。聚苯硫醚(pps，接触角为87度)是一种综合性能优异的特种工程塑料，具有优良的耐高温性能、耐腐蚀性能、耐辐射性能、阻燃性能、物理机械性能、尺寸稳定性能、电性能等特点。聚对苯二甲酸丁二醇酯(pbt，接触角为88度)是一种综合性能优异的特种工程塑料，具有优良的耐热性能、韧性、耐疲劳性能，耐有机溶剂、自润滑、低摩擦系数等特点。聚乙烯 (pe，接触角为88度)是一种热塑性树脂，具有优良的耐低温性、化学稳定性、耐腐蚀性、电绝缘性等特点。丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(abs，接触角为82度)是一种强度高、韧性好、易于加工成型的热塑型高分子材料，具有抗腐蚀性、抗冲击性、高阻燃性、高耐热性、高透明性等特点。聚甲基丙烯酸甲酯(pmma，接触角为82度)具有优良的透明度、加工性能、机械强度、绝缘性能、耐候性能、耐热性能等特点。聚丙烯(pp，接触角为 88度)是一种性能优良的热塑性合成树脂，具有耐化学性、耐热性、电绝缘性、高强度机械性能和良好的高耐磨加工性能等特点。
[0083]
本申请中的所述适配部140所在的一端为上侧/上部，所述吐液部120 所在的一端为下侧/下部。
[0084]
在一个具体实施方式中，所述加样针的制备采用注塑成型工艺，利用制备好的金属注塑模具型腔，进行将熔融的预先添加疏水辅料聚丙烯等原料通过加压、注入、保压、冷却、脱膜等操作制作出所述形状的加样针。通过上述注塑生产工艺，可大批量低成本制备上述加样针。
[0085]
如图5、图6a、6b以及图6c所示，本申请还提供一种制备微液滴的方法，包括如下步骤：
[0086]
a：提供所述加样针110、加样针适配器170、以及与加样针适配器170 通过导管相连的精密注射泵；
[0087]
b：将加样针110紧密安装于加样针适配器170上；通过加样针适配器 170在所述加样针110内注满载油230，且所述加样针110内的载油230无气泡；
[0088]
c：提供盛有样品溶液200的第一开口容器，移动加样针110，使所述吐液部120的吐液开口150位于所述第一开口容器的液面上方；
[0089]
d：向下移动所述加样针110，使所述吐液开口150接触并浸入所述样品溶液200，使
得所述加样针110内吸入所述样品溶液200；
[0090]
e：提供盛有油性液体210的第二开口容器，将吸入所述样品溶液200 的加样针110移动至所述第二开口容器的液面上方；
[0091]
f：向下移动所述加样针110，使所述吐液开口150接触并浸入所述油性液体210，将所述加样针110在所述油性液体210内做周期性往复运动，从而使的所述吐液开口150内的所述样品溶液200进入所述油性液体210内，形成大小均一的微液滴220。微液滴220的体积可以为50pl-50nl；当所述吐液开口150的内径为45μm时，所述微液滴220的最小体积可以达到50pl；当所述吐液开口150的内径为78μm时，所述微液滴220的最小体积可以达到250pl；当所述吐液开口150的内径为200时，所述微液滴220的最小体积可以达到50nl。
[0092]
如图6a所示，在步骤f中振动机构与所述加样针110连接，通过所述振动机构240带动所述加样针110在所述油性液体210内做速度变化的周期性往复运动。振动时，适配器携带加样针，在振摆装置驱动下，围绕轴心高速摆动，摆动频率优选在100赫兹至500赫兹之间，加样针吐液开口距离轴心4～6cm，吐液开口往复运动的振动幅度优选在0.1～5mm，更优选在 0.5～2mm。
[0093]
如图6b所示，在步骤f中振动机构与所述加样针110连接，通过所述水平振动机构240带动所述加样针110在所述油性液体210内做速度变化的周期性往复运动。振动时，适配器携带加样针，在振动机构驱动下，水平往复运动，摆动频率优选在100赫兹至500赫兹之间，更优选在100赫兹至150 赫兹之间，吐液开口往复运动的振动距离优选在0.1～5mm，更优选在 0.5～2mm。
[0094]
所述加样针110的吐液开口150的速度曲线可以呈正弦波、方波、三角波、梯形波、锯齿波或上述波形的叠加和组合。
[0095]
所述加样针110做速度变化的周期性往复运动，在一个往复运动周期内生成0.5或1个微液滴220，优选为生成1个微液滴220。
[0096]
如图6c所示，在步骤f中，振动机构240驱动加样针110做周期性速度变化的运动。首先，加样针110从左到右做加速运动；然后，加样针110 从左到右运动达到一个振动周期内的最大速度，使油相对加样针吐液开口注射的液体的剪切力实现对开口外侧液滴的切割；然后，加样针减速运动达到右侧最远位置；最后，加样针低速运动返回左侧，完成一个振动周期。上述变速运动在一个振动周期内可实现一个液滴的切割。所述加样针110吐液开口往复运动的位置-时间波形，在一个振动周期内是不对称波形。上述振动形式在一个振动周期内只在从左到右运动时生成1个液滴，而不是在从左到右和从右到左的两个半周期内分别生成一个1滴，即一个往复运动周期内生成两个液滴。这一波形和生成液滴机制，对于注塑合模时内孔和外孔不同轴具有非常好的容忍度，也有效避免了由于加工精度及吐液开口的微小瑕疵造成的左右同时生成液滴的液滴体积不一致。
[0097]
所述振动机构240带动所述加样针110在液面下进行速度变化的周期性往复运动，所述样品溶液200的流速均与生成的微液滴220的直径呈一定的正相关关系，增加所述加样针110内样品溶液200的流速时，生成的微液滴 220的直径变大，所述加样针110的振动频率均与生成的微液滴220的直径呈一定负相关关系，加样针110的振动频率增加，生成的微液滴220的直径变小。因此，利用本申请公开的加样针110和微液滴制备方法生成的微液滴 220的直径可以通过加样针110内的样品溶液200的流速和加样针110的振动频率来控制，对
微液滴220体积的控制调节比较灵活。除此之外，通过插拔式的快捷加样针110更换，可以避免不同批次样品的交叉污染；同时还可以更换加样针110内流出溶液的组分，顺次在开口容器中形成多个不同组分和体积的微液滴220，既可以用于实现微液滴220的高通量筛选，也可以实现多步骤的超微量生化反应和检测，具有广阔的应用前景。
[0098]
采用本发明所述的加样针和微液滴生成方法，所述加样针灌注载油和加样针吐液生成液滴过程中，采用气泡探测方法探测或人工观察判断加样针内是否有气泡，以排除气泡对液滴体积均一性的影响。例如采用白色led从侧面与加样针水平位置对加样针进行照明，采用高分辨视频采集ccd相机从正面与照明led垂直方向，对加样针进行成像，利用深度学习算法对采集的图像进行实时分析，判断加样针内是否存在气泡。在存在气泡时，提示用户更换加样针，重新进行实验，或通过自动化机构，实现加样针的自动更换，以保证液滴生成大小的均一性，并避免因为气泡存在，而导致实验失败和样品的浪费。
[0099]
在本申请中所述第一开口容器以及第二开口容器的形状不限，为现有技术，只要能实现在本申请中的功能即可。
[0100]
在本申请的实施方式中，所述载油230与所述样品溶液200不互溶；所述油性液体210与所述样品溶液200不互溶。
[0101]
在本申请中所述载油230可以为矿物油、硅油、液态烷烃、或液态酯类中的一种或多种；油性液体210为矿物油、硅油、液态烷烃、或液态酯类中的一种或多种，其中含有适量的离子表面活性剂或非离子表面活性剂，如吐温系列表面活性剂、司盘系列表面活性剂、含长链烷基的硅氧链非离子型表面活性剂等；样品溶液200为纯水溶液、peg或dmso，其还可以是混合物，如pcr试剂、细胞培养液、生物样品、缓冲溶液等。
[0102]
实施例1
[0103]
本申请所述加样针110的储液体积为60微升，制备加样针110的材料为聚丙烯(pp，纯水溶液接触角为88度)，吐液部120高度为5mm，锥度为20
°
，壁厚为0.15mm，储液部130高度为18.7mm，锥度为4
°
，壁厚为 0.5mm，适配部高度为6mm，锥度为4
°
，吐液开口150的内径为100μm，外径为400μm。按照上述尺寸制作精密金属注塑模具型腔和内芯，采用注塑成型工艺进行大批量自动化加样针加工。加工良品率为99.98％(批量检测数量10000只)。
[0104]
试验例1
[0105]
采用实施例1所述的加样针110，所述加样针110的适配部140上端开口与供液适配器170的一端紧密插接，供液适配器170的另一端通过特氟龙 (teflon)软管与带有三通阀的精密注射泵连接，注射泵上配备一支体积为 50微升的微量进样器，加样针110与振动机构固定连接。供液适配器170 与加样针110适配部140上端开口可以直接插接匹配，方便加样针110的拆卸与更换。在微液滴制备前，特氟龙软管、供液适配器170和加样针110内充满矿物油，并检查液路无泄漏，无气泡。利用微量进样器的抽吸，使加样针110从盛有样品溶液200的第一开口容器中以2.5微升/s的速度吸取25微升1mg/ml bsa溶液(缓冲体系为1x pbs,ph＝7.5)，并移动加样针110至盛有含3％wtabil em90的矿物油的第二开口容器上方。利用波形发生器作为加样针110在矿物油液面下或跨液面进行速度变化的周期性往复运动的驱动信号发生器，使排出吐液开口150的样品溶液200与油性液体210进行相对运动。在振幅1.2毫米，频率100赫兹，微量进样器的流速100纳升/秒，注射体积20微升的条件下制备的微液滴220如图7所示。当微量进样器被注射泵施加压力时，样品溶液200匀速进入油性液体
210中，由于样品溶液 200和油性液体210的相对运动产生的流体剪切力(液面下周期性往复运动)、界面张力和界面力(跨液面周期性往复运动)使得排出加样针110的吐液开口150的样品溶液200脱离吐液开口150，形成体积为纳升体积的微液滴220，微液滴220半径的cv小于3％。在约3.3分钟时间内，在第二开口容器中形成了约20000个1纳升体积的微液滴220。
[0106]
重复上述吸液和液滴生成操作50次，并分别检测各次生成液滴的体积和均一性。发现，加样针可长时间稳定反复使用，生成液滴均为1nl，cv 小于3％，加样针表面良好的疏水亲油性质，保证了加样针长时间稳定工作能力。
[0107]
对比例1
[0108]
参考公开专利(申请号为201410655309.4的中国专利)加工带有金属毛细管的加样针，与实施例1的适配部，储液部的尺寸相同，区别在于对比例 1中的吐液部为不锈钢毛细管，不锈钢毛线管的长度为1cm，内径为100μm，外径为240μm，毛细管和储液部下端锥形内腔相连。利用注塑法进行加工，再利用点胶连接毛细管和注塑件，由于毛细管内径极小，点胶连接容易发生堵塞，由于增加的毛细管切割加工、毛细管表面抛光、表面处理、以及点胶等工艺，在改进工艺条件下，良品率约为33.6％(数量为10000只)。
[0109]
采用试验例1操作流程和参数，挑取结构完好的所述带金属毛细管加样针，利用所述加样针以2.5微升/s的速度吸取25微升1mg/mlbsa溶液(缓冲体系为1x pbs,ph＝7.5)，由于毛细管阻力过大，储液部产生气泡，导致后续生成液滴偏大且不均一，平均体积约为2.6纳升，cv>25％。
[0110]
试验例2
[0111]
利用对比例1所述带金属毛细管加样针，采用试验例1操作流程，将吸液速度下调为0.5微升/s，吸取25微升1mg/ml bsa溶液(缓冲体系为1xpbs,ph＝7.5)。发现储液部未产生气泡，然而耗时从10s提高到50s。采用试验例1操作流程振动生成微液滴。显微观察发现，在生成约前2000个液滴时，毛细管外壁保持疏水状态，生成液滴大小为1nl，大小均一；之后，由于毛细管表面被bsa吸附变得亲水，观察发现毛细管出口端面外侧发生溶液吸附，注射液体与毛细管的接触面积变大，在相同振动条件下，生成液滴体积变为3nl或4nl，cv值>30％，无法生成均一的1nl液滴。
[0112]
表1为本申请加样针的各实施例的项参数
[0113] 连续生成1nl液滴能力加工成本良品率实施例1>100,000低99.98％对比例1～2,100高35％
[0114]
通过上述实施例以及对比例可知本申请所述的加样针良品率高，加工成本低，而且可以连续生成大量均一的低至1纳升体积的微液滴。
[0115]
尽管以上结合附图对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。