一种铁-蛋白复合物过氧化物模拟酶及其检测过氧化氢的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种铁-蛋白复合物过氧化物模拟酶及其检测过氧化氢的方法，属于分析化学的技术领域。
【背景技术】
[0002]过氧化氢俗称双氧水，是一种重要的化工产品，在化工、轻工、电子、纺织、造纸、污水处理等行业应用广泛。由于过氧化氢具有很强的氧化性和漂白性，在食品、环境卫生等各个领域，因而检测各类样品中过氧化氢的含量具有重要的意义。在食品领域，过氧化氢曾被用作食品的消毒剂和漂白剂，食品中过高的过氧化氢残留会对人体造成消化道损伤，导致癌变，诱导心血管疾病。
[0003]目前检测过氧化氢含量的方法有多种，主要包括化学计量法、电化学分析法、荧光分析法和分光光度法等。辣根过氧化物酶(HRP)是一种被广泛应用的过氧化物酶试剂。该酶含有正铁原卟啉，能利用过氧化氢氧化氢供体，通过反应可生成有色的氧化型染料。利用HRP的催化特性，其已被广泛应用于测定食品或环境样品中过氧化氢的含量。但HRP也存在着来源有限、提纯困难，价格昂贵、不易保存等缺点，因此，开发新的模拟酶具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种过氧化物模拟酶及其制备方法，同时本发明还提供了利用该模拟酶检测过氧化氢的方法。
[0005]本发明所述的过氧化物模拟酶指的是高铁离子和蛋白质作用生成的铁-蛋白复合物，此复合物具备催化过氧化氢水解、具有类似天然过氧化物酶的作用。
[0006]本发明所述的利用过氧化物模拟酶测定过氧化氢含量的方法，指的是以过氧化氢为底物，以上述制备的过氧化物模拟酶为催化剂，催化过氧化氢和氢供体反应，使氢供体被氧化生成有色的氧化型染料，进一步通过以下方法检测过氧化氢:(I)通过观察染料颜色的变化定性检测过氧化氢的存在；(2)通过测定有色氧化染料的吸光度数值从而定量检测过氧化氢含量。
[0007]为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案:
(一)铁-蛋白复合物过氧化物模拟酶的制备:
取蛋白质溶液和高铁离子溶液加入到具有恒温和搅拌装置的烧瓶中，调节温度至25-35°C之间并保持恒定，用氢氧化钠溶液调节溶液pH值使为8-11之间。开动搅拌器，在恒温下强力搅拌24小时以上。待反应完毕后，取出反应液，装入透析袋，以水为透析介质，透析36小时以上，除尽未反应的游离高铁离子后，所得溶液即为铁-蛋白复合物过氧化物模拟酶的溶液。
[0008]在上述铁-蛋白复合物过氧化物模拟酶制备过程中，蛋白质溶液可以采用牛血清白蛋白、人血白蛋白、卵白蛋白、卵黄蛋白加水制成蛋白质溶液，优选采用牛血清白蛋白。蛋白质溶液的浓度在控制在0.5%?5%之间，优选控制在1%?2%之间。高铁离子溶液可以采用氯化尚铁、硝酸尚铁、硫酸尚铁加水溶解制成，优选米用氣化尚铁加水溶解制成。尚铁尚子溶液的浓度控制在5 -50 mmol/L之间，优选控制在20?30 mmol/L之间。蛋白质溶液和高铁离子的混合溶液中蛋白质溶液和高铁离子溶液的体积比控制在10:1?2:1之间，优选采用5:1的比例。
[0009]在上述铁-蛋白复合物过氧化物模拟酶制备过程中，反应温度和混合溶液的pH值是制备过程中的关键因素。反应温度过低，反应速度慢，所需时间过长;反应温度过高，会使蛋白质发生变性，致使反应无法进行。优选的反应温度是30±2°C之间并保持恒定。混合溶液的PH值的调节应使溶液的pH值在8?11之间，可根据不同蛋白质等电点的不同而有所不同，其原则是尽量高于等电点但又不可使高铁离子因碱性过大而产生沉淀，其调节混合溶液PH值的方法采用缓慢搅拌下逐滴滴加氢氧化钠试液至溶液恰好不产生沉淀为宜。不同蛋白质溶液的等电点数值可参考如下:牛血清白蛋白(4.9)、人血白蛋白(4.7-4.9)、卵白蛋白(4.71 ;4.59)、卵黄蛋白(4.8-5.0)。
[0010]在上述铁-蛋白复合物过氧化物模拟酶的制备过程中，混合溶液的反应时间在24小时以上，优选为36小时；反应后透析时间在36小时以上，优选为72小时。透析后应检查透析液中游离高铁离子是否可检出，以保证透析完全。
[0011 ] (二)利用铁-蛋白复合物过氧化物模拟酶检测过氧化氢的方法:
取铁-蛋白复合物过氧化物模拟酶溶液，依次加入氢供体溶液、待测定的过氧化氢溶液，加盐酸溶液调节混合液PH值至pH=2左右，摇匀，作为供试品溶液，同法以等量水代替待测定的过氧化氢溶液制作空白溶液。将供试品溶液和空白溶液放置于37°C恒温水浴中孵育15分钟，取出，依下述方法检测过氧化氢:(I)比较供试品溶液和空白溶液反应前后颜色变化情况，若空白溶液在反应前后无明显变化，供试品溶液在反应前后出现明显颜色变化，可判断供试品溶液中存在过氧化氢，属定性检测；(2)若供试品中存在过氧化氢，将供试品溶液于400-800nm波长范围内测定吸收光谱，根据吸收光谱中最大吸收波长处的吸光度数值求算出过氧化氢的浓度，属定量检测。
[0012]在上述所述的利用铁-蛋白复合物过氧化物模拟酶检测过氧化氢的方法中，所述的氢供体溶液是3，3’，5，5’_四甲基联苯胺盐酸盐溶液、3，3_二氨基联苯胺四盐酸盐溶液、
4-氨基安替比林溶液中的一种，优选是3，3 ’，5，5 ’ -四甲基联苯胺盐酸盐溶液。3，3 ’，5，5 ’ -四甲基联苯胺盐酸盐溶液的浓度在I?lOmmol/L之间，优选是5mmol/L，采用二甲基甲酰胺或二甲亚砜作为溶剂进行配制。
[0013]在上述所述的利用铁-蛋白复合物过氧化物模拟酶检测过氧化氢的方法中，铁-蛋白复合物过氧化物模拟酶溶液与氢供体溶液的体积比在1:0.5-1: 2之间，优选是1:1。在采用3，3’，5，5’_四甲基联苯胺盐酸盐溶液作为氢供体的方法中，氢供体被氧化后颜色由无色变为蓝色，在657nm波长附近有最大吸收，可利用供试品溶液在此波长处的吸光度数值与已知浓度的对照品溶液的吸光度数值相比较，求算出供试品中过氧化氢溶液的浓度。
[0014]由上述技术方案可知，本发明所述的铁-蛋白复合物过氧化物模拟酶能够催化过氧化氢和氢供体的反应，是一种新型的过氧化物酶模拟酶，可用于过氧化氢的定性和定量检测。
[0015]本发明的有益效果是:采用价格便宜的高铁离子与蛋白质生成铁-蛋白复合物过氧化物模拟酶，制备方法简便易行，可用于代替价格昂贵的天然过氧化物酶;所发明的利用铁-蛋白复合物模拟酶检测过氧化氢的方法，条件温和，速度快，可用于过氧化氢的定性和定量检测。
【附图说明】
[0016]图1为铁-蛋白复合物过氧化物模拟酶的吸收光谱曲线；
图2为铁-蛋白复合物过氧化物模拟酶催化过氧化氢分解，氧化3，3 ’，5，5 ’ -四甲基