专利名称：乙酸测定试剂盒及乙酸浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种乙酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定乙酸浓度的 方法，属于食品/环境检验测定技术领域。
技术背景随着配制食醋标准的出台，食品添加剂乙酸(醋酸)的质量合格与否又直接关系着人民身体健康与否。在条文强制性标准配制食醋G B 10337—2000中明确规定，配制食醋所用的乙酸应符合G B 1903—1996的 规定，即应符合食品添加剂醋酸的要求。用工业醋酸假冒"食品添加剂醋 酸"，例如，使用某些副产品或回收的工业醋酸进行脱色，浓度不够时加入 盐酸、磷酸等以增加酸度。这类醋酸对人体的危害很大，因为这类醋酸不 仅含有添加的有毒、有害无机物，还含些很难说清的有害有机物。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测 定乙酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的乙酸测定试 剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析 仪上进行乙酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实 的推广应用。本发明乙酸浓度测定方法原理如下- '乙酸+ 二氧化碳+亚铁细胞色素bl 丙酮酸氧化酶丙酮酸+高铁细胞色素M +水 丙酮酸+1^-精氨酸+还原型辅酶章鱼碱脱氢酶N2-(D-羧乙基)-精氨酸+辅酶+水 这种方法应用丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase ; EC 1.2.2.2)酶(偶) 联章鱼碱脱氢酶(octopine dehydrogenase ; EC 1.5丄11)酶促反应连续监 测法/速率比色法。丙酮酸氧化酶酶解乙酸反应产生丙酮酸，再通过(偶) 联合章鱼碱脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰) 氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在 340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度 /速度，可以测算乙酸的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明乙酸测定试剂盒较为缓冲液稳定剂还原型辅酶二氧化碳亚铁细胞色素bl丙酮酸氧化酶100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 5 mmol/L 50 mmol/L 8000 U/L章鱼碱脱氢酶 10000 U/L本发明的乙酸测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素bl、精 氨酸、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素bl、 精氨酸。 试剂2缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶。 还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素bl、精氨酸、丙酮酸氧化酶、 章鱼碱脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状 态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素bl、 精氨酸。 试剂2缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶。还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素bl、精氨酸、丙酮酸氧化酶、 章鱼碱脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以 是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使 用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定乙酸浓度的方法，其还原型 辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的 一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的乙酸测定试剂为单试剂，包括 三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 二氧化碳 亚铁细胞色素bl丙酮酸氧化酶 章鱼碱脱氢酶100mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 5 mmol/L 50 mmol/L 8000 U/L 10000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使 用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8土0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乙酸样品与 试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约 O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出乙酸的 浓度大小。 实施例二本实施例的乙酸测定试剂为双试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶二氧化碳亚铁细胞色素bl100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 20 mmol/L 5 mmol/L 50 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂丙酮酸氧化酶100mmol/L 500 mmol/L 8000 U/L 10000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37r，反应时间10分钟，起始吸光度1.8士0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乙酸样品与 试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)， 延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出乙酸的 浓度大小。 实施例三本实施例的乙酸测定试剂为三试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶二氧化碳亚铁细胞色素bl100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 20 mmol/L 5 mmol/L 50 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂章鱼碱脱氢酶100mmol/L 500 mmol/L 10000U/L试剂3三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L丙酮酸氧化酶 8000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定乙酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间 IO分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测乙酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方 向为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左 右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出乙酸的 浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色 原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类 同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析 仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的乙酸浓度测定方法，其方法原理如下乙酸+二氧化碳+亚铁细胞色素b1丙酮酸氧化酶丙酮酸+高铁细胞色素b1+水丙酮酸+L-精氨酸+还原型辅酶章鱼碱脱氢酶 N2-(D-羧乙基)-精氨酸+辅酶+水将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出乙酸的浓度大小测定结果。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的乙酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定乙酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素b1、精氨酸、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，从而测算出乙酸的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101324511SQ20071002336
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司