专利名称：一种加入内标物的绞股蓝药材指纹图谱质量控制方法
技术领域：
本发明属绞股蓝原料质量控制方法领域，特别是涉及一种扶正化瘀植物药中加入内标物的绞股蓝药材指纹图谱质量控制方法。
背景技术：
绞股蓝(Gynostemma pentaphfllum(Thunb)Makino.)为多年生蔓生草本，系葫芦科绞股蓝属模式种植物。始载于《救荒本草》。中医药理认为绞股蓝味苦，性寒，无毒，具有清热解毒，止咳化痰，补气生津，健脾安神之功。现代药理证明绞股蓝具有抑制肿瘤，防止衰老，降低血脂，增强免疫，防止糖皮质激素副作用，保护心脏和肝脏，降低血糖，镇静止痛及抗溃疡等药理作用，从而使绞股蓝在治疗气管炎、传染性肝炎、劳伤虚损等方面广泛应用于临床。
绞股蓝分布于印度、尼泊尔、锡金、孟加拉、斯里兰卡、缅甸、越南、老挝、马来西亚、印度尼西亚、新几内亚、朝鲜、日本以及中国。其中，我国是该植物的分布和分化中心。它主要分布于秦岭至淮河线以南的亚热带和热带地区，江苏、浙江、安徽、福建、广东、海南、广西、河南、湖北、湖南、四川、重庆、贵州、云南、西藏、陕西、甘肃等都有分布。绞股蓝是绞股蓝属内垂直分布幅度最大的一个种，它广布于海拔300-3200m的山坡、山谷密林中、山坡疏林下、灌丛中、沟谷、河岸、路边的阴湿草地；多呈零星分布；绞股蓝主要生长在常绿阔叶、落叶混交林的下层，一般背阳坡多见，阳坡少见，在郁蔽的松林中，其他针叶林、针阔混交林及毛竹林中都很少有绞股蓝的生长与分布。在日本专利文献中，通常把绞股蓝皂甙的药源植物限定为“绞股蓝及其近缘植物”明确提到的近缘植物只有缅甸绞股蓝(Gynostemma burmanicum King ex Chakr.)、光叶绞股蓝(Gynostemmalaxum)和全缘绞股蓝(Gynoiemma integrifoliola Cogn.)三种。
绞股蓝为草质藤本植物，具有攀援性。根系为由不定根组成的须根系。根的初生结构由表皮、皮层和中柱构成，木质部2～4原型，具凯氏带，次生结构中栓内层较厚。茎有地上茎和地下茎之分。地上茎细柔，具槽纹，五棱形富韧性，无毛或被短柔毛。具卷须，生于叶腋，顶端多分二叉。由表皮、皮层、维管柱和髓构成，双韧型维管束，排成两圈，外圈5个，内圈4～5个，周围纤维连成一环。地下老茎圆柱形，周围纤维呈不连续环状，维管束具次生木质部和次生韧皮部，排成一圈，外生韧皮部明显，木质部发达，导管直径20～155gm，髓射线较宽，髓射线及髓薄壁细胞内含淀粉。茎触地处可生出不定根。鸟足状复叶5～7片，背腹型结构，不等型气孔器，叶柄具5束维管束，进入小叶时分为7～9束。不同产地的绞股蓝类群，其小叶数、小叶的形状及大小存在着变异。随着生态条件不同，叶肉栅栏组织和海绵组织的分化程度不同，叶表皮形态也不同，生长在较干燥环境中的种群，叶片在控制水分散失方面的结构发育得比较完善，而在空气湿度较大环境中的种群，由于控制水分散失的能力差，只能分布在极有限的区域中。
应用组织化学定位技术，发现绞股蓝皂苷主要分布在营养器官的同化组织及韧皮部薄壁细胞中，厚角组织、表皮和周皮的栓内层也有少量分布，其相对含量为叶＞茎＞根；在年生长周期中，以开花期的皂苷含量最高。
20世纪70年代以来，国内外学者采用现代分离技术和分析技术对绞股蓝化学成分进行广泛的研究。发现绞股蓝药材中含有多种成分，包括皂苷、黄酮、氨基酸、多醣、维生素以及微量元素。其中绞股蓝皂苷是主要有效成分。绞股蓝皂甙的基本化学结构是18种达玛烷型的甙元。现已从该植物中分离出一百多种与人参皂甙类似骨架的达玛烷型绞股蓝皂甙，其中绞股蓝皂甙-3与人参皂甙Rb1完全相同，绞股蓝皂甙-4，-8，-7的化学结构则分别与人参皂甙Rb3、Rd、F2相一致。
在绞股蓝药材的质量评价方面，目前国内外发表的文献中，一般采用比色法或薄层扫描法对绞股蓝总皂苷进行测定，并作为绞股蓝药材的质量评价指标，显然，这种质量评价方法不能准确鉴别和评价绞股蓝药材。本发明将弥补绞股蓝药材指纹图谱研究的空白。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种扶正化瘀植物药中加入内标物的绞股蓝药材指纹图谱质量控制方法，该方法能全面控制原料药材的质量，确保产品的质量稳定。
本发明的一种加入内标物的绞股蓝药材指纹图谱质量控制方法，包括下列步骤1.绞股蓝药材指纹图谱的检测方法(1)色谱柱Eclipse XDB-C18(250×4.6nm，0.5μm)；流动相水A-乙腈B。
(2)供试品的制备方法将绞股蓝药材粉碎过40目筛，采用四分法取样，称取2.0-4.0g绞股蓝药材。用石油醚索氏提取12-24小时，至提取器内溶液无色。取出药渣，挥干溶剂，加入60-100ml甲醇超声提取30-60min。将提取液减压过滤，滤液浓缩至干，用甲醇溶解并定容至10ml，得溶液A。将溶液A在HZ-818大孔吸附树脂上样后，用5倍床层体积的95％乙醇洗脱。减压蒸干洗脱液的溶剂，残留物用水溶解定容至10ml，得溶液B。将溶液B在AB-8大孔吸附树脂上样，依次用水、50％乙醇溶液和95％乙醇溶液洗脱，收集95％乙醇洗脱液，减压蒸干溶剂，残留物用60％甲醇定容至10ml。溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，移取滤液300μl，加入浓度为1.00mg/ml的人参皂苷Rb2对照品溶液50μl，混合均匀，进行HPLC指纹图谱分析。
(3)柱温20℃-40℃(4)检测波长203nm(5)流速0.6-1.0ml/min(6)进样量10-20μl(7)等度洗脱条件为流动相为水(A)-乙腈(B)，0-60min，34％B等度洗脱。
2.标准指纹图谱的建立选取10批不同批号的陕西样品，进行高效液相色谱指纹图谱分析。对合适样品的HPLC指纹图谱中所有峰进行比较，确定了6个共有峰作为特征峰，并按出峰时间先后次序进行编号(图1)。其中，1号峰是内标物人参皂苷Rb2。
根据LC-MS和HPLC-DAD的鉴别结果，绞股蓝的高效液相色谱指纹图谱表达了绞股蓝皂苷类组分的分布特性。以内标物人参皂苷Rb2作为指标成分峰。
从10批样品的HPLC指纹图谱中按照以下原则选取一批陕西绞股蓝药材的指纹图谱作为对照指纹图谱(图1)，结合药效实验情况，优先考虑确定疗效的药材的指纹图谱。结合指纹图谱和定量结果，选取特征峰分离较好，峰的保留时间和峰高适宜、峰型(峰的形状和峰高比例)较典型的指纹图谱。优先选取基线平稳、信噪比好的指纹图谱。
3、指纹图谱的质量控制的技术要求3.1样品真伪的鉴别根据公式计算十批药材指纹图谱中各特征峰相对于内标物人参皂苷Rb2的相对保留时间RRT(RRT＝特征峰的保留时间/内标峰(指标峰)的保留时间)，确定了各特征峰的相对保留时间和范围(如表1所示)。
表1陕西绞股蓝药材HPLC指纹图谱鉴别峰相对保留时间及范围
根据指纹图谱分析条件对待测样品进行测定，得出加入内标物后的样品HPLC色谱图，计算各特征峰的相对保留时间，并与所列对照指纹图谱和相对保留时间表进行比较。如各特征峰均存在，而且相对保留时间(RRT)吻合，则可确定为该药材。
3.2样品质量评价采用中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件(国家药典委员会)，将样品的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(或对照品共有模式指纹图谱)进行比较。以6个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.9。
本发明的有益效果如下1、指纹图谱提供了这样一个方法，将常规的单一指标成分或活性成分为质量控制的指标提升到一个新的阶段，用色谱的指纹特征，和通过指纹图谱得到的量化参数，更有效地鉴别真伪，控制质量。而关于绞股蓝指纹图谱的研究目前无文献报道。因此本发明就为解决这样一个绞股蓝药材质量控制的问题，提高质量控制的水平。
2.本发明提出一种加入内标物的指纹图谱鉴别方法，解决了目前市场上缺乏绞股蓝皂苷对照品的难题。采用与绞股蓝皂苷结构和性质极为相近人参皂苷作为内标物，以该内标物作为指标成分峰，得到的各特征峰的相对保留时间和相对峰面积更稳定，方法的粗放度更好。
3、考察了供试品溶液的稳定性，结果表明，在室温下，48小时之内，绞股蓝供试品溶液保持稳定。精密度和重复性试验，都表明相似度在0.9以上。
4、经过对10批绞股蓝药材的指纹图谱相似度进行计算，发现药材相似度在0.9-1.0之间。说明建立的陕西绞股蓝指纹图谱质控方法灵敏度高，重复性好，专属性强，方法可靠，可以对陕西绞股蓝药材质量进行科学有效的评价，能够运用于实际生产中质量控制，满足企业药材鉴别和质量控制的需求。
图1加入内标物人参皂苷Rb2的陕西绞股蓝药材的标准HPLC指纹图谱。
图2加入内标物人参皂苷Rb2的陕西绞股蓝药材的HPLC指纹图谱。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例11.实验方法1.1试剂与药材
1.2仪器
1.3绞股蓝样品的制备称取2.0g绞股蓝药材，用石油醚索氏提取12小时，至提取器内溶液无色。取出药渣，挥干溶剂，加入60ml甲醇超声提取30min。将提取液减压过滤，滤液浓缩至干，用甲醇溶解并定容至10ml，得溶液A。
将溶液A在装有10ml HZ-818大孔吸附树脂的层析柱上样后，用5倍床层体积的95％乙醇洗脱。减压蒸干洗脱液的溶剂，残留物用水溶解定容至10ml，得溶液B。
将溶液B在装有15ml AB-8大孔吸附树脂的层析柱上样，依次用水-乙醇溶液(100∶0、50∶50、5∶95)洗脱，收集95％乙醇洗脱液，减压蒸干溶剂，残留物用60％甲醇定容至10ml。溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液300μl与浓度1.00mg/ml的人参皂苷Rb2标准品溶液50μl混合，进行HPLC指纹图谱分析。
1.4绞股蓝皂苷的HPLC分析条件色谱柱Eclipse XDB-C18(250×4.6nm，0.5μm)；流动相水A-乙腈B，34％B等度洗脱60min；柱温30℃；流速0.8ml/min；检测波长203nm；进样量10μl。
1.5系统适用性在指纹图谱测定条件确定后，通过对至少三批样品进行测定，计算相关参数，并在此基础上提出高效液相色谱系统的适用参数条件。即人参皂苷Rb2对照品溶液(142.86μg/ml)的色谱峰面积重现性(RSD)不高于3％，保留时间重现性(RSD)不高于2％；色谱柱柱效以人参皂苷Rb2计不少于15,000块理论塔板数。
1.6实验结果陕西绞股蓝药材样品的HPLC指纹图谱如图2，特征峰的相对保留时间和相对峰面积如表2。
表2陕西绞股蓝药材指纹图谱的数据 *RRT(相对保留时间)＝特征峰的保留时间/内标峰(指标峰)的保留时间*RPA(相对峰面积)＝特征峰的峰面积/内标峰(指标峰)的峰面积 2、通过对十批绞股蓝药材的相似度进行计算，发现药材相似度大于0.9-1.0之间。说明建立的绞股蓝指纹图谱质控方法，方法可靠，而且操作简便，证实能够运用于实际生产中质量控制，满足企业药材鉴别和质量控制的需求。
权利要求
1.一种加入内标物的绞股蓝药材指纹图谱质量控制方法，包括下列步骤(1)绞股蓝药材指纹图谱的检测方法将绞股蓝药材粉碎过40目筛，称取2.0～4.0g绞股蓝。用石油醚索氏提取12-24小时，加入60-100ml甲醇超声提取30-60min。减压过滤浓缩至10ml，得溶液A；上HZ-818大孔吸附树脂，用5倍床层体积的95％乙醇洗脱。减压蒸干洗脱液溶剂，残留物用水溶解定容至10ml，得溶液B；上AB-8大孔吸附树脂，依次用水、50％乙醇溶液和95％乙醇溶液洗脱，收集95％乙醇洗脱液，减压蒸干溶剂，残留物用60％甲醇定容至10ml；溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，移取滤液300μl，加入浓度为1.00mg/ml的人参皂苷Rb2对照品溶液50μl，混合均匀，进行HPLC指纹图谱分析；(2)标准指纹图谱的建立选取10批不同批号的样品，对所有峰进行比较，确定6个共有峰为特征峰，按出峰时间先后次序进行编号。其中，1号峰是内标物人参皂苷Rb2；根据LC-MS和HPLC-DAD的鉴别结果，绞股蓝的高效液相色谱指纹图谱表达了绞股蓝皂苷类组分的分布特性。因此以内标物人参皂苷Rb2作为指标成分峰；从10批样品的HPLC指纹图谱中按照以下原则选取一批绞股蓝药材的指纹图谱作为对照指纹图谱，结合药效实验情况，优先考虑确定疗效的药材的指纹图谱。结合指纹图谱和定量结果，选取特征峰分离较好，峰的保留时间和峰高适宜、峰型典型的指纹图谱。优先选取基线平稳、信噪比好的指纹图谱；(3)指纹图谱的质量控制的技术要求样品真伪的鉴别计算十批药材指纹图谱中各特征峰相对于内标物人参皂苷Rb2的相对保留时间RRT(R确定了各特征峰的相对保留时间和范围；绞股蓝药材HPLC指纹图谱鉴别峰相对保留时间及范围
根据指纹图谱分析条件对待测样品进行测定，得出加入内标物后的样品HPLC色谱图，计算各特征峰的相对保留时间，并与所列对照指纹图谱和相对保留时间表进行比较。如各特征峰均存在，而且相对保留时间(RRT)吻合，则可确定为该药材；样品质量评价将样品的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱进行比较，6个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.9。
2.根据权利要求1所述的一种加入内标物的绞股蓝药材指纹图谱质量控制方法，其特征在于色谱柱Eclipse XDB-C18，流动相水A-乙腈B，柱温20℃-40℃，检测波长203nm，流速0.6-1.0ml/min，进样量10-20μl，等度洗脱条件为流动相为水(A)-乙腈(B)，0-60min，34％B等度洗脱。
全文摘要
本发明涉及一种加入内标物的绞股蓝药材指纹图谱质量控制方法，包括步骤(1)绞股蓝药材指纹图谱的检测方法；(2)标准指纹图谱的建立；(3)指纹图谱的质量控制的技术要求将样品的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱进行比较，6个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.9。本发明灵敏度高，重复性好，专属性强，方法可靠，对绞股蓝药材质量进行科学有效的评价，能够运用于实际生产中质量控制，满足企业药材鉴别和质量控制的需求。
文档编号G01N30/88GK101078713SQ20071004298
公开日2007年11月28日 申请日期2007年6月28日 优先权日2007年6月28日
发明者胡坪, 潘一峰 申请人:上海现代中医药技术发展有限公司