专利名称：基于三(2,2’-联吡啶)钌固态电化学发光的dna传感器及制法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于三(2，2，-联吡啶)钌固态电化学发光的DNA传感 器及制法和应用，属于分析化学和化学传感器技术领域。
技术背景DNA是生物遗传信息载体，其分析检测在DNA测序、DNA表 达谱分析、临床分析、疾病相关基因的突变分析等领域有着重大的科 学价值和实际意义。为满足这些领域对DNA分析检测的需求，研究 人员发展了许多种DNA检测方法。这些方法包括荧光、质谱、电 化学等。三(2,2'-联吡啶)钌的电化学发光具有灵敏度高、选择性好、观懂 线性范围宽等优点，因而在诸如临床分析和生物分子检测等领域得到 了，见范应用(Richter， M. M.， Electrochemiluminescence (ECL). C7jew. i ev. 2004， 104, 3003-3036)。近来，应用三(2,2，-联吡啶)钌电化学发光 作为检测手段，研究人员设计了新型DNA传感器。人类许多疾病与 基因的单碱基突变相关，因而单碱基错配的检测显得尤为重要。但是 DNA单碱基错配的电化学发光检测还少有报道。 发明内容本发明提供基于三(2,2，-联吡啶)钌固态电化学发光的DNA传感 器及制法和应用。基于三(2,2，-联吡啶)钌固态电化学发光的DNA传感器是免标记DNA电化学发光传感器。利用碳纳米管/全氟磺酸离子 交换膜/三(2,2，-联吡啶)钌修饰玻碳电极(记作RuGC电极)构成了 DNA电化学发光传感器，并将此传感器用作DNA的免标记电化学发本发明的目的之一是提供一种基于三(2,2'-联吡啶)钌固态电化 学发光的DNA传感器。此传感器具有免标记、灵敏和简便的特点。本发明的目的之二提供一种基于三(2，2'-联吡啶)钌固态电化学 发光的DNA传感器的制备方法。本发明的目的之三将基于三(2,2，-联吡啶)钌固态电化学发光的 DNA传感器用于双链DNA以及热变性双链DNA的检测及检测方法。本发明的目的之四是将基于三(2，2'-联吡啶)钌固态电化学发光 的DNA传感器用于DNA单碱基错配的检测及检测方法。基于三(2，2，-联吡啶)钌固态电化学发光的DNA传感器，其构成 如下在玻碳电极上，修饰有碳纳米管/全氟磺酸离子交换膜/三(2，2' -联吡啶)钌。基于三(2，2，-联吡啶)钌固态电化学发光的DNA传感器的制备步 骤如下(1)打磨玻碳电极，使其表面平整光滑，超声并水洗电极表面， 得到预处理的玻碳电极；(2) 将0.5 mg/mL的碳纳米管/全氟磺酸离子交换膜的混合液体 浇筑于(1)中预处理的玻碳电极表面，晾干；(3) 将(2)中所得玻碳电极浸入lmM的三(2，2'-联吡啶)钌的溶液中，通过离子交换固定三(2,2'-联吡啶)钌，制得"碳纳米管/全 氟磺酸离子交换膜/三(2,2'-联吡啶)钌"修饰玻碳电极(简记作RuGC 电极)；(4)将(3)中所得RuGC电极用水清洗，去除物理吸附的三(2，2' -联吡啶)钌，得到基于三(2,2，-联吡啶)钌固态电化学发光的DNA传 感器。此传感器贮存备用。利用基于三(2，2，-联吡啶)钌固态电化学发光的DNA传感器，测 定双链DNA步骤如下(1) 将待测DNA样品滴于基于三(2，2，-联吡啶)钌固态电化学发光 的DNA传感器的电极表面，晾干；(2) 接着，用此含DNA的传感器作工作电极，浸入pH为5.5的 10 mM的醋酸缓冲溶液的电化学池，对双链DNA进行电化学和电化 学发光测量；该醋酸缓冲溶液含有50 mM的NaCl。利用本发明的基于三(2，2'-联吡啶)钌固态电化学发光DNA传感 器对双链DNA检测的表征如图1所示。图1示出了基于三(2，2，-联吡啶)钌固态电化学发光的DNA传感 器在缓冲溶液和3.04x10—8 mol/L鲑鱼精双链DNA中的循环伏安曲线 和对应的电化学发光强度-扫描电位曲线。可以看出，相对于空白的 缓冲溶液，鲑鱼精双链DNA给出了增强的电化学和电化学发光信号。 DNA电化学响应为缓冲溶液的1.17倍(图1A之线条1和2); DNA 电化学发光响应则为缓冲溶液的12.5倍(图1B之线条1和2)。这 表明本发明所制备的基于三(2,2，-联吡啶)钌固态电化学发光的DNA传感器，可以实现DNA的电化学和电化学发光双检测，但电化学发 光方法比电化学方法更为灵敏。利用基于三(2，2，-联吡啶)钌固态电化学发光的DNA传感器，测 定热变性双链DNA步骤如下:(1) 将待测双链DNA于水浴中煮沸5 min，之后立即用冰浴冷 却，即得热变性双链DNA;(2) 将(1)中的热变性双链DNA样品滴于基于三(2，2，-联卩比啶) 钌固态电化学发光的DNA传感器的电极表面，晾干；(3) 接着，用此含热变性DNA的基于三(2，2，-联吡啶)钌固态电 化学发光的DNA传感器作工作电极，浸入pH为5.5的10 mM的醋 酸缓冲溶液的电化学池，进行电化学和电化学发光测量；该醋酸缓冲 溶液含有50mM的NaCl。利用本发明的基于三(2,2，-联吡啶)钌固态电化学发光DNA传感 器对热变性双链DNA检测的表征如图1所示。从图1数据，可以看出，相对于鲑鱼精双链DNA，热变性鲑鱼 精双链DNA给出了增强的电化学和电化学发光信号。变性鲑鱼精双 链DNA的电化学响应仅比鲑鱼精双链DNA的高一点(图1A之线条 2和3);但热变性鲑鱼精双链DNA的电化学发光响应为鲑鱼精双链 DNA的5倍(图1B之线条2和3)。这表明本发明所制备的基于三 (2,2'-联吡啶)钌固态电化学发光DNA传感器，可以实现热变性DNA 的电化学和电化学发光双检测，但电化学发光方法比电化学方法更为 灵敏。利用基于三(2，2，-联吡啶)钌固态电化学发光DNA传感器，测定 DNA单碱基错配步骤如下(1)将待测基因序列及其互补序列等摩尔比混合，于9(TC水浴 中，杂交反应5min，逐渐冷却至室温，得到杂交双链；所述的待测 基因序列及其互补序列包括完全互补序列或单碱基错配序列；(2) 将(1)中所得杂交双链DNA样品滴于基于三(2，2'-联吡啶) 钌固态电化学发光DNA传感器的电极表面，晾干；(3) 接着，用此含杂交双链DNA的基于三(2,2，-联吡啶)钌固态 电化学发光DNA传感器作工作电极，浸入pH为5.5的10 mM的醋 酸缓冲溶液的电化学池，进行电化学和电化学发光测量；该醋酸缓冲 溶液含有50mM的NaCl。利用本发明的基于三(2，2，-联吡啶)钌固态电化学发光DNA传感 器对DNA单碱基错配检测的表征如图2和图3所示。图2示出了利用基于三(2,2'-联吡啶)钌固态电化学发光DNA传 感器对3.93xl0—1() mol/L p53基因序列片段进行单碱基错配检测的结 果。仅用电化学方法(循环伏安扫描)，无法区分单碱基错配链(CZ4) 和完全互补链(C7G)。相反，则电化学发光方法能够有效地区分浓 度为3.93x10, mol/L单碱基错配链和完全互补链(图2)。从图2C 可以看出，C/J错配的电化学发光响应是C/G Watson-Crick互补链的 1.5倍。图3给出了序列l(即5'-GCAGGG GQ^GCC GGT-3')及其完全互 补序列2 (即5'-ACC GGC_^GC CCC TGC-3')的杂交产物的校正曲线。从3.93xl(T9 mol/L到1.965xl0—7 mol/L范围内，电化学发光强度 和样品浓度呈现好的线性关系(R2= 0.9990)。本发明的有益效果本发明的基于三(2，2'-联吡啶)钌固态电化学 发光的DNA传感器，可以实现DNA的电化学、电化学发光双检测。 此传感器还可以实现热变性DNA的电化学、电化学发光双检测。而 且，基于三(2,2'-联吡啶)钌固态电化学发光DNA传感器可以实现 DNA单碱基错配的电化学发光双检测。其灵敏度高、操作简单、检 测时无需标记；方法具有普适性，可用于任意序列DNA片段的检测。
图1为基于三(2,2'-联吡啶)钌固态电化学发光DNA传感器在缓 冲溶液(线条l)、3.04xl(T8 mol/L鲑鱼精双链DNA(线条2)和3.04xl(T8 mol/L热变性鲑鱼精双链DNA (线条3)中的循环伏安曲线(A)和 对应的电化学发光强度-扫描电位曲线(B)。图2为基于三(2，2'-联吡啶)钌固态电化学发光DNA传感器在样 品1 (线条l)、 3.93xlO"Vol/L样品2 (线条2)和3.93xl(T1()mol/L 样品3 (线条3)中的循环伏安曲线(A)和对应的电化学发光强度-扫描电位曲线(B)。 (C)为(B)中电化学发光强度的定量分析结果。 (样品1，缓冲溶液；样品2，序列1 (即5'-GCA GGG GC^ GCC GGT-3')与其完;全互补链序歹U 2 (艮卩5'-ACC GGC_^GC CCC TGC-3') 的杂交产物；样品3，序列1 (艮卩5'-GCAGGGGC^GCCGGT-3')与 其单碱基错配互补链序列3 (即5'-ACC GGCjGC CCC TGC-3')的 杂交产物。)。图3为序列1 (即5'-GCA GGG GCf GCC GGT-3')及其完全互 补序列2 (即5'-ACC GGC^GC CCC TGC-3')的杂交产物的校正曲 线。
具体实施方式
实施例1三(2，2'-联吡啶)钌固态电化学发光DNA传感器的制备(1) 打磨玻碳电极，使其表面平整光滑，超声，水洗电极表面， 得到预处理的玻碳电极；(2) 将10 0.5 mg/mL "碳纳米管/全氟磺酸离子交换膜"混 合液体浇筑于①中预处理的玻碳电极表面，晾干；(3) 将(2)中所得玻碳电极浸入lmM三(2,2'-联吡啶)钌的溶 液中，通过离子交换固定三(2，2'-联吡啶)钌，制得"碳纳米管/全氟 磺酸离子交换膜/三(2,2'-联吡啶)钌"修饰玻碳电极(记作RuGC电 极)；(4) 将(3)中所得RuGC电极用大量水清洗，去除物理吸附的 三(2,2'-联吡啶)钌，即得基于三(2，2'-联吡啶)钌固态电化学发光的 DNA传感器。此传感器贮存备用。实施例2利用三(2，2'-联吡啶)钌固态电化学发光DNA传感器，测定鲑鱼 精双链DNA(1)将5 nL 3.04xl(T8 mol/L鲑鱼精双链DNA样品滴于传感器的 电极表面，晾干；(2)接着，用此含鲑鱼精双链DNA的传感器作工作电极，浸入 含2mLpH5.5的lOmM醋酸缓冲溶液(含有50mMNaCl)的电化 学池，进行电化学和电化学发光测量。 实施例3利用三(2,2'-联吡啶)钌固态电化学发光DNA传感器，测定热变 性鲑鱼精双链DNA(1) 将3.04xl(X8 mol/L鲑鱼精双链DNA于水浴中煮沸5 min， 之后立即用冰浴冷却，即得热变性鲑鱼精双链DNA;(2) 将5 (1)中所得热变性鲑鱼精双链DNA滴于传感器的 电极表面，晾干；(3) 接着，用此含热变性鲑鱼精双链DNA的传感器作工作电极， 浸入含2mLpH为5.5的10mM醋酸缓冲溶液(含有50mMNaCl) 的电化学池，进行电化学和电化学发光测量。实施例4利用三(2,2'-联吡啶)钌固态电化学发光DNA传感器，测定DNA 单碱基错配(1) 将3.93x10-9mol/Lp53基因序列(序列1， 5'-GCAGGG GC^ GCC GGT-3')及3.93xl(T9mol/L其互补序列(完全互补序列2， 5'-ACC GGC丄GC CCC TGC-3'或单碱基错配序列3, 5'-ACC GGC ^GC CCC TGC-3')等摩尔比混合，于90° C水浴中，反应5min，逐渐冷却至 室温，得到杂交双链；(2) 将5pL (1)中所得杂交双链DNA滴于传感器的电极表面，晾干；(3)接着，用此含杂交双链DNA的传感器作工作电极，浸入含 2mLpH为5.5的lOmM醋酸缓冲溶液(含有50mMNaCl)的电化 学池，进行电化学和电化学发光测量。
权利要求
1、基于三(2，2’-联吡啶)钌固态电化学发光的DNA传感器，其特征在于，其构成如下在玻碳电极上，修饰有碳纳米管/全氟磺酸离子交换膜/三(2，2’-联吡啶)钌。
2、 如权利要求1所述的基于三(2,2，-联吡啶)钌固态电化学发光的 DNA传感器的制备方法，其特征在于步骤如下(l)打磨玻碳电极，使其表面平整光滑，超声并水洗电极表面， 得到预处理的玻碳电极；(2) 将0.5 mg/mL的碳纳米管/全氟磺酸离子交换膜的混合液体 浇筑于(1)中预处理的玻碳电极表面，晾干；(3) 将(2)中所得玻碳电极浸入lmM三(2，2，-联吡啶)钌的溶 液中，通过离子交换固定三(2,2'-联吡啶)钌，制得碳纳米管/全氟磺 酸离子交换膜/三(2,2'-联吡啶)钌修饰玻碳电极；(4) 将(3)中制得的碳纳米管/全氟磺酸离子交换膜/三(2,2'-联吡啶)钌修饰玻碳电极，用水清洗，去除物理吸附的三(2,2'-联吡 啶)钌，得到基于三(2,2'-联吡啶)钌固态电化学发光的DNA传感器。
3、 如权利要求1所述的基于三(2,2，-联吡啶)钌固态电化学发光的 DNA传感器的应用，其特征在于，用其测定双链DNA。
4、 如权利要求3所述的基于三(2,2'-联吡啶)钌固态电化学发光的 DNA传感器测定双链DNA的方法，其特征在于步骤如下(1)将待测DNA样品滴于基于三(2,2，-联吡啶)钌固态电化学发 光的DNA传感器的电极表面，晾干；(2)接着，用此含DNA的传感器作工作电极，浸入pH为5.5 的10 mM的醋酸缓冲溶液的电化学池，对双链DNA进行电化学和电 化学发光测量；该醋酸缓冲溶液含有50mM的NaCl。
5、 如权利要求1所述的基于三(2，2，-联吡啶)钌固态电化学发光的 DNA传感器的应用，其特征在于，用其测定测定热变性双链DNA。
6、 如权利要求5所述的基于三(2,2，-联吡啶)钌固态电化学发光的 DNA传感器测定热变性双链DNA的方法，其特征在于步骤如下(1)将待测双链DNA于水浴中煮沸5 min，之后立即用冰浴冷 却，即得热变性双链DNA;(2) 将(1)中的热变性双链DNA样品滴于基于三(2,2，-联吡啶) 钌固态电化学发光的DNA传感器的电极表面，晾干；(3) 接着，用此含热变性DNA的基于三(2,2，-联吡啶)钌固态电化 学发光的DNA传感器作工作电极，浸入pH为5.5的10mM的醋酸 缓冲溶液的电化学池，进行电化学和电化学发光测量；该醋酸缓冲溶 液含有50mM的NaCl。
7、 如权利要求1所述的基于三(2,2，-联吡啶)钌固态电化学发光的 DNA传感器的应用，其特征在于，用其测定DNA单碱基错配。
8、 如权利要求7所述的基于三(2，2，-联吡啶)钌固态电化学发光的 DNA传感器测定DNA单碱基错配的方法，其特征在于步骤如下(1)将待测基因序列及其互补序列等摩尔比混合，于9(TC水浴 中，杂交反应5min，逐渐冷却至室温，得到杂交双链；所述的待测 基因序列及其互补序列包括完全互补序列或单碱基错配序列；(2) 将(1)中所得杂交双链DNA样品滴于基于三(2,2，-联吡啶) 钌固态电化学发光DNA传感器的电极表面，晾干；(3) 接着，用此含杂交双链DNA的基于三(2,2，-联吡啶)钌固态 电化学发光DNA传感器作工作电极，浸入pH为5.5的10 mM的醋 酸缓冲溶液的电化学池，进行电化学和电化学发光测量；该醋酸缓冲 溶液含有50mM的NaCl。
全文摘要
本发明涉及基于三(2，2’-联吡啶)钌固态电化学发光的DNA传感器及制法和应用，属于分析化学和化学传感器技术领域。利用碳纳米管/全氟磺酸离子交换膜/三(2，2’-联吡啶)钌的修饰玻碳电极，基于三(2，2’-联吡啶)钌介导的鸟嘌呤碱基和腺嘌呤碱基的催化氧化反应制备了DNA电化学发光传感器。此传感器不仅可用于DNA的电化学和电化学发光双检测，也能用于热变性DNA的电化学和电化学发光双检测。此外，该传感器还能用于DNA单碱基错配的电化学和电化学发光检测。该传感器的灵敏度高、操作简单、检测时无需标记；其单碱基错配的检测具有普适性，可用于任意序列DNA片段的检测。
文档编号G01N21/76GK101403699SQ200810051069
公开日2009年4月8日 申请日期2008年8月11日 优先权日2008年8月11日
发明者康建珍, 艳 杜, 汪尔康, 辉 魏 申请人:中国科学院长春应用化学研究所