专利名称：：一种裸花紫珠中鞣质的含量测定方法
技术领域：
：本发明涉及中药
技术领域：
。更具体地说涉及裸花紫珠中或裸花紫珠提取物中鞣质的含量测定方法。裸花紫珠为马鞭草科植物裸花紫珠(CallicarpanudiflomHook.etAm.)的干燥叶，主要具有收敛止血、清热解毒的功效，可用于各种内外出血症，对肺胃之出血尤为多用，也可治疗烧烫伤及热毒疮癌。目前己有裸花紫珠片、裸花紫珠胶囊、裸花紫珠栓等制剂，但质量标准中含量仅以总黄酮为控制标准。鞣质(tannins)又称单宁，是存在于植物体内的一类结构比较复杂的多元酚类化合物。现代研究表明，鞣质具有收敛性，内服可用于治疗胃肠道出血，溃疡和水泻等症；外用于创伤、灼伤，可使创伤后渗出物中蛋白质凝固，形成痂膜，可减少分泌和防止感染，鞣质能使创面的微血管收縮，有局部止血作用。鞣质可用作生物碱及某些重金属中毒时的解毒剂。鞣质具有较强的还原性，可清除生物体内的超氧自由基，延缓衰老。此外，鞣质还具有抗变态反应、抗炎、驱虫、降血压等作用。因此，通过建立裸花紫珠中鞣质的含量测定标准以及用多量化指标严格控制裸花紫珠提取物的质量标准，将有利于提高裸花紫珠药材及制剂的质控标准，保证工艺稳定、药效可靠。
发明内容本发明的目的是建立一种准确、可靠的裸花紫珠中鞣质的含量测定方法。本发明的再一个目的是建立一种准确、可靠的裸花紫珠提取物中鞣质的含量测定方法。本发明所述的裸花紫珠中鞣质的含量测定方法包括下列步骤(1).由裸花紫珠药材提取得到裸花紫珠提取物；(2).裸花紫珠提取物的预处理将裸花紫珠提取物溶解，制成样品溶液；(3).标准曲线的制作用没食子酸作为对照品，配制成梯度的标准溶液，加入显色液显色，在760nm波长下，分别测定该标准溶液的吸光度值，根据吸光度值与浓度之间的对应关系建立标准曲线；(4).样品溶液总酚的含量测定取一份上述样品溶液，加入显色液显色，在760nm波长下测定吸光度值，根据该吸光度值，由标准曲线得对应的浓度，该浓度值即为样品溶液总酚的含量；(5).样品溶液不被吸附的多酚的含量测定再取一份上述样品溶液，加入干酪素进行处理后，加入显色液显色，在760nm波长下测定吸光度值，根据该吸光度值，由标准曲线得对应的浓度，该浓度值即为样品溶液不被吸附的多酚的含量；(6).计算裸花紫珠中鞣质的含量先由样品溶液总酚的含量减去样品溶液不被吸附的多酚的含量计算出样品溶液鞣质的含量，然后根据稀释倍数换算出裸花紫珠提取物中鞣质的含量，最后根据提取收率换算出裸花紫珠中鞣质的含量。其中，步骤(l)中由裸花紫珠药材提取得到裸花紫珠提取物包括下列步骤将裸花紫珠药材在水、稀醇或稀酮溶剂中加热煎煮，倒出煎液，过滤得滤液，将所得滤液通过大孔吸附树脂柱层析，用水洗涤柱体，弃去水洗液，再用10%90%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，将乙醇洗脱液浓縮，得裸花紫珠提取物；上述提取方法中，加热的时间可以为30150分钟；所述的大孔吸附树脂可以为聚苯乙烯类大孔吸附树脂，所述聚苯乙烯类大孔吸附树脂可以优选JD-1、DlOl、AB-8、X-5或D402;大孔吸附树脂柱的径高比可以为1:51:10。本发明所述的裸花紫珠提取物中鞣质的含量测定方法包括下列步骤(1).裸花紫珠提取物的预处理将裸花紫珠提取物溶解，制成样品溶液；(2).标准曲线的制作用没食子酸作为对照品，配制成梯度的标准溶液，加入显色液显色，在760nm波长下，分别测定该标准溶液的吸光度值，根据吸光度值与浓度之间的对应关系建立标准曲线；O、娃品、狡、戚tt船的今是、),*.玩V—々A卜古至总、狡、谅"hn入后在、戚后.色，在760nm波长下测定吸光度值，根据该吸光度值，由标准曲线得对应的浓度，该浓度值即为样品溶液总酚的含量；(4).样品溶液不被吸附的多酚的含量测定再取一份上述样品溶液，加入干酪素进行处理后，加入显色液显色，在760nm波长下测定吸光度值，根据该吸光度值，由标准曲线得对应的浓度，该浓度值即为样品溶液不被吸附的多酚的含量；(5).计算裸花紫珠提取物中鞣质的含量先由样品溶液总酚的含量减去样品溶液不被吸附的多酚的含量计算出样品溶液鞣质的含量，然后根据稀释倍数换算出裸花紫珠提取物中鞣质的含量。在上述测定裸花紫珠中和裸花紫珠提取物中鞣质的含量的步骤中，溶解所述的裸花紫珠提取物以及所述的没食子酸的溶剂为水；所述的显色液为水、磷钼钨酸试液和碳酸钠溶液；其中，所述的碳酸钠溶液的浓度为20%29%。为了达到本发明的目的，发明人对裸花紫珠药材及其提取物中鞣质含量的测定方法进行了稳定性、重现性、回收率的试验考察，结果表明该试验方法具有良好的稳定性和可靠性。本发明首次建立了裸花紫珠药材及其提取物中鞣质的含量测定方法，进一步提高了裸花紫珠药材以及裸花紫珠制剂的质量控制标准。此外，本发明的方法对于其它药材及制剂中鞣质的质控标准也有一定的借鉴作用。下面将结合具体实施例对本发明的具体实施方式以及本发明方法的稳定性、重现性、回收率等试验进行详细地说明。图1表示没食子酸对照品经显色后在400nm800nm波长下的吸收曲线；图2表示样品溶液经显色后在400nm800nm波长下的吸收曲线；图3表示样品溶液先经干酪素处理、再经显色后，在400nm800nm波长下的吸收曲线。具体实施方式实施例一(一)、裸花紫珠提取物中鞣质的含量测定方法仪器、试剂与对照品仪器TU-1901双光束紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；D2F-6030A型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。试剂磷钼钨酸试液(自制)，甲醇，碳酸钠(分析纯)，干酪素(化学纯)。对照品没食子酸(纯度为99.9%)。裸花紫珠提取物的制备取100kg裸花紫珠药材，加水1500kg，浸泡30分钟，加热煮沸30分钟，倒出煎液，药渣再煎2次，每次加水1500kg，煮沸60分钟，合并三次煎液，过滤，滤液通过比表面积为350450m2/g、骨架密度为l1.2g/ml，平均孔径为3565nm，空隙率为6068%的JD-1(WLD)型聚苯乙烯类大孔吸附树脂柱，树脂柱的径高比为l:5，弃去流出液，用5倍柱体积的水洗涤柱体，弃去洗涤液，用10%的乙醇洗脱至洗脱液中无黄酮检出。收集洗脱液，回收乙醇后减压浓縮至相对密度为1.2，冷冻干燥，检验分装即得裸花紫珠提取物。提取物的收率为2.53%。溶液的配制①对照品溶液的制备取没食子酸对照品适量，精密称定，加水制成每lml含没食子酸0.0541mg的溶液，作为对照品溶液。②样品溶液的制备取裸花紫珠提取物约0.7g，置250ml容量瓶中，加水150ml浸提过夜，超声处理10分钟后加水定容至刻度，摇匀，静置后再稀释5倍，即得样品溶液。p克^舁的确定取上述lml对照品溶液，置25ml棕色量瓶中，加水llml，再加入磷钼钨酸试液lml，用27%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，在400nm800nm的波长下测定吸光度值。扫描曲线见图1。取上述样品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，加磷钼钨酸试液lml，再加入水10ml，用27%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，在400nm800nm的波长下测定吸光度值。扫描曲线见图2。取上述样品溶液25ml，加至已盛有干酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，3(TC水浴中振摇1小时，滤过，取续滤液2ml，置25ml棕色量瓶中，加磷钼钨酸试液lml，再加入水10ml，用27%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，在400nm800nm的波长下测定吸光度值。扫描曲线见图3。从图l、图2及图3的扫描曲线中可以看出，对照品和样品溶液均在波长为760nm处的吸收度值最大，因此，本实验中选取760nm作为裸花紫珠提取物中鞣质含量的测定波长。标准曲线的制作精密量取对照品溶液0.5ml、l.Oml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，分别加水11.5ml、llml、10ml、9ml、8ml、7ml，再各加入磷钼钨酸试液lml，用27%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应的试剂为空白，在760nm处测定吸光度值。以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准线回归方程为Y=-0.130X+0.146R2=0.9978。结果表明，在上述范围内呈良好的线性关系。样品溶液总酚的含量测定精密量取样品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，加磷钼钨酸试液lml，再加入水10ml，用27%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应的试剂为空白，在760nm处测定吸光度值。样品溶液不被吸附的多酚的含量测定精密量取样品溶液25ml及空白对照一份(蒸馏水)，加至已盛有干酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，3(TC水浴中振摇1小时，滤过，取续滤液2ml，照总酚测定方法测定吸光度值。该样品溶液的鞣质含量=总酚的含量-不被吸附的多酚的含量，然后根据稀释倍数即可换算出裸花紫珠提取物中鞣质的含量。(二)、精密度试验精确量取没食子酸对照品溶液2ml，按上述方法进行测定。连续测定6次，吸光度值分别为0.818、0.822、0.819、0.821、0.815、0.826，精密度值以其相对标准偏差RSD来估计，RSD为0.459%。(三)、重复性试验称取裸花紫珠提取物6份，按样品溶液的制备方法进行制备，按上述方法进行测定。重复测定6份样品中鞣质含量。样品溶液的鞣质含量=总酚含量-不被吸附的多酚含量，然后根据稀释倍数换算出裸花紫珠提取物中鞣质含量分别为12.64%、11.97%，12.38%、12.06%、11.85%、12.35%，重复性以其RSD来估计，RSD=2.042%。(四)、稳定性试验称取裸花紫珠提取物，按样品溶液的制备方法进行制备，按上述的方法在30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟进行检测，其吸光度值分别为0.826、0.828、0.824、0.820、0.817、0.814。i式验结果表明，样品在3小时内稳定，在3045分钟内测定为佳，吸光度值随时间变化逐渐变小。(五)、回收率试验称取裸花紫珠提取物6份，分别置于250ml棕色量瓶中，加水150ml，再分别加入lmg/ml的没食子酸对照品溶液35ml，然后按样品溶液制备方法进行制备，并测定，计算回收率。结果平均回收率为99.36%。RSD=1.44%。实验数据见表一。表一、回收率试验<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例二裸花紫珠提取物的制备取100kg裸花紫珠药材，加水1000kg，浸泡50分钟，加热煮沸90分钟，倒出煎液，药渣再煎2次，每次加水1500kg，煮沸90分钟，合并三次煎液，过滤，将滤液减压浓縮至相对密度为1.1，冷冻干燥，检验分装即得裸花紫珠提取物。裸花紫珠提取物的收率为9.7%。对照品溶液的配制取没食子酸对照品适量，精密称定，加水制成每lml含没食子酸0.0541mg的溶液，作为对照品溶液。样品溶液的配制取裸花紫珠提取物约0.7g，置250ml容量瓶中，加水150ml浸提过夜，超声处理10分钟后加水定容至刻度，摇匀，静置后再稀释5倍，即得样品溶液。标准曲线的制作精密量取对照品溶液0.5ml、l.Oml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，分别加水11.5ml、llml、10ml、9ml、8ml、7ml，再各加入磷钼钨酸试液lml，用20%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应的试剂为空白，在760nm处测定吸光度值。样品溶液总酚的测定精密量取样品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，加磷钼钨酸试液lml，再加入水10ml，用20%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应的试剂为空白，在760nm处测定吸光度值。样品溶液不被吸附的多酚的测定精密量取待测液25ml及空白对照一份(蒸馏水)，加至己盛有干酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，3(TC水浴中振摇1小时，滤过，取续滤液2ml，照总酚测定方法测定吸光值。样品溶液的鞣质含量=总酚含量-不被吸附的多酚含量，然后根据稀释倍数换算出裸花紫珠提取物中鞣质含量为9.03%。实施例三裸花紫珠提取物的制备取100kg裸花紫珠药材，加稀醇1000kg，浸泡50分钟，加热煮沸90分钟，倒出煎液，药渣再煎2次，每次加水1500kg，煮沸90分钟，合并三次煎液，过滤，滤液通过比表面积为350~450m2/g、骨架密度为l1.2g/ml，平均孔径为3565nm，空隙率为6068X的D101型聚苯乙烯类大孔吸附树脂柱，树脂柱的径高比为1:7，弃去流出液，用4倍柱体积的水洗涤柱体，弃去洗涤液，用50%乙醇洗脱至洗脱液中无黄酮检出。收集洗脱液，回收乙醇后减压浓縮至相对密度为1.1，冷冻干燥，检验分装即得裸花紫珠提取物。提取物的收率为3.23%。对照品溶液的配制取没食子酸^t照品适量，精密称定，加水制成每lml含没食子酸0.0541mg的溶液，作为对照品溶液。样品溶液的配制取裸花紫珠提取物约0.7g，置250ml容量瓶中，加水150ml浸提过夜，超声处理10分钟后加水定容至刻度，摇匀，静置后再稀释5倍，即得样品溶液。标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.5ml、l.Oml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，分别加水11.5ml、llml、10ml、9ml、8ml、7ml，再各加入磷钼钨酸试液lml，用27%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应的试剂为空白，在760nm处测定吸光度值。样品溶液总酚的测定精密量取样品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，加磷钼钨酸试液lml，再加入水10ml，用27%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应的试剂为空白，在760nm处测定吸光度值。样品溶液不被吸附的多酚的测定精密量取样品溶液25ml及空白对照一份(蒸馏水)，加至已盛有干酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，30'C水浴中振摇1小时，滤过，取续滤液2ml，照总酚测定方法测定吸光度值。样品溶液的鞣质含量=总酚含量-不被吸附的多酚含量，然后根据稀释倍数换算出裸花紫珠提取物中鞣质含量为12.54%。实施例四裸花紫珠提取物的制备取100kg裸花紫珠药材，加稀酮2000kg，浸泡40分钟，加热煮沸150分钟，取出煎液，药渣再煎2次，每次加水1000kg，煮沸60分钟，合并三次煎液，过滤，滤液通过比表面积为350450m2/g、骨架密度为l1.2g/ml，平均孔径为3565nm，空隙率为6068%的AB-8型聚苯乙烯类大孔吸附树脂柱，树脂柱的径高比为1:10，弃去流出液，用6倍柱体积的水洗涤柱体，弃去洗涤液，用90%乙醇洗脱至洗脱液中无黄酮检出。收集洗脱液，回收乙醇后减压浓縮至相对密度为1.08，冷冻干燥，检验分装即得裸花紫珠提取物。提取物的收率为3.03%。对照品溶液的配制取没食子酸对照品适量，精密称定，加水制成每lml含没食子酸0.0541mg的溶液，作为对照品溶液。样品溶液的配制取裸花紫珠提取物约0.7g，置250ml容量瓶中，加水150ml浸提过夜，超声处理10分钟后加水定容至刻度，摇匀，静置后再稀释5倍，即得待测液。标准曲线的制作精密量取对照品溶液0.5ml、l.Oml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，分别加水11.5ml、llml、10ml、9ml、8ml、7ml，再各加入磷钼钨酸试液lml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应的试剂为空白，在760nm处测定吸光度值。样品溶液总酚的测定精密量取样品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，加磷钼钨酸试液lml，再加入水10ml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应的试剂为空白，在760nm处测定吸光度值。样品溶液不被吸附的多酚的测定精密量取样品溶液25ml及空白对照一份(蒸馏水)，加至已盛有干酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，30'C水浴中振摇1小时，滤过，取续滤液2ml，照总酚测定方法测定吸光度值。样品溶液的鞣质含量=总酚含量-不被吸附的多酚含量，然后根据稀释倍数换算出裸花紫珠提取物中鞣质含量为10.17%。应该理解，本发明裸花紫珠提取物的制备方法不仅限于实施例中所描述的几种方法，本发明领域的技术人员根据公知技术可以得到很多种提取物的制备方法。显然，这些方法变化的实施例都应该落在本发明的保护范围之内。权利要求1.一种裸花紫珠中鞣质的含量测定方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1).由裸花紫珠药材提取得到裸花紫珠提取物；(2).裸花紫珠提取物的预处理将裸花紫珠提取物溶解，制成样品溶液；(3).标准曲线的制作用没食子酸作为对照品，配制成梯度的标准溶液，加入显色液显色，在760nm波长下，分别测定该标准溶液的吸光度值，根据吸光度值与浓度之间的对应关系建立标准曲线；(4).样品溶液总酚的含量测定取一份上述样品溶液，加入显色液显色，在760nm波长下测定吸光度值，根据该吸光度值，由标准曲线得对应的浓度，该浓度值即为样品溶液总酚的含量；(5).样品溶液不被吸附的多酚的含量测定再取一份上述样品溶液，加入干酪素进行处理后，加入显色液显色，在760nm波长下测定吸光度值，根据该吸光度值，由标准曲线得对应的浓度，该浓度值即为样品溶液不被吸附的多酚的含量；(6).计算裸花紫珠中鞣质的含量先由样品溶液总酚的含量减去样品溶液不被吸附的多酚的含量计算出样品溶液鞣质的含量，然后根据稀释倍数换算出裸花紫珠提取物中鞣质的含量，最后根据提取收率换算出裸花紫珠中鞣质的含量。2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于步骤(l)中由裸花紫珠药材提取得到裸花紫珠提取物包括下列步骤将裸花紫珠药材在水、稀醇或稀酮溶剂中加热煎煮，倒出煎液，过滤得滤液，将所得滤液通过大孔吸附树脂柱层析，用水洗涤柱体，弃去水洗液，再用10%90%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，将乙醇洗脱液浓縮，得裸花紫珠提取物。3.根据权利要求2所述的含量测定方法，其特征在于所述的加热煎煮的时间为30150分钟。4.根据权利要求2所述的含量测定方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂为聚苯乙烯类大孔吸附树脂。5.根据权利要求4所述的含量测定方法，其特征在于所述的聚苯乙烯类大孔吸附树脂为JD-1、DlOl、AB-8、X-5或D402。6.根据权利要求2所述的含量测定方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂柱的径高比为1:51:10。7.—种裸花紫珠提取物中鞣质的含量测定方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1).裸花紫珠提取物的预处理将裸花紫珠提取物溶解，制成样品溶液；(2).标准曲线的制作用没食子酸作为对照品，配制成梯度的标准溶液，加入显色液显色，在760nm波长下，分别测定该标准溶液的吸光度值，根据吸光度值与浓度之间的对应关系建立标准曲线；(3).样品溶液总酚的含量测定取一份上述样品溶液，加入显色液显色，在760nm波长下测定吸光度值，根据该吸光度值，由标准曲线得对应的浓度，该浓度值即为样品溶液总酚的含量；(4).样品溶液不被吸附的多酚的含量测定再取一份上述样品溶液，加入干酪素进行处理后，加入显色液显色，在760nm波长下测定吸光度值，根据该吸光度值，由标准曲线得对应的浓度，该浓度值即为样品溶液不被吸附的多酚的含量；(5).计算裸花紫珠提取物中鞣质的含量先由样品溶液总酚的含量减去样品溶液不被吸附的多酚的含量计算出样品溶液鞣质的含量，然后根据稀释倍数换算出裸花紫珠提取物中鞣质的含量。8.根据权利要求1至7任一项所述的含量测定方法，其特征在于溶解所述的裸花紫珠提取物和所述的没食子酸的溶剂为水。9.根据权利要求1至7任一项所述的含量测定方法，其特征在于所述的显色液为水、磷钼钨酸试液和碳酸钠溶液。10.根据权利要求9所述的含量测定方法，其特征在于所述的碳酸钠溶液的浓度为20%~29%。全文摘要本发明涉及一种裸花紫珠中鞣质的含量测定方法。本发明采用分光光度法对裸花紫珠中鞣质的含量进行测定，进一步提高了裸花紫珠药材及制剂的可控性，确保了裸花紫珠提取物的质量。文档编号G01N21/31GK101625313SQ20091000608公开日2010年1月13日申请日期2009年1月22日优先权日2009年1月22日发明者严冬兰,关继峰,宁云山申请人:九芝堂股份有限公司