专利名称：：一种珍珠粉的高效液相指纹图谱鉴定方法
技术领域：
：本发明涉及一种珍珠粉的高效液相指纹图谱鉴定方法。(二)
背景技术：
：珍珠粉及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，但现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法都不足以解决这一问题，建立珍珠粉指纹图谱将能较为全面地反映珍珠粉及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对质量进行整体描述和评价。在此基础上，如果能进一步开展谱效学研究，可使珍珠粉质量与其药效真正结合起来，有助于阐明珍珠粉作用机理。总之，研究和建立珍珠粉的指纹图谱，为珍珠粉的鉴别和品质评价、质量控制、制定质量标准提供了重要依据。目前，中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描(TLCS)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和高效毛细管电泳法(HPCE)等色谱法以及紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、质谱法(MS)、核磁共振法(NMR)和X-射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点；中药成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，且积累较丰富的应用经验，因此本发明首选高效液相色谱法作为珍珠粉指纹图谱的分析手段。(三)
发明内容本发明目的是提供一种珍珠粉的高效液相指纹图谱鉴定方法。本发明采用的技术方案是—种珍珠粉的高效液相指纹图谱鉴定方法，所述方法包括(1)珍珠粉标准指纹图谱的建立①珍珠粉标准品溶液的配制精密称取纯珍珠粉250750mg，于1020ml耐温耐压瓶中，准确加入6M的盐酸110ml，加盖密封，置于80°C120。C下，水解1236小时；取出，放冷，开瓶，将水解液移至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣以水溶解，移入10ml量瓶中，定容，摇匀，微孔滤膜精滤，取滤液100ul至2ml小瓶中，依次准确加入体积浓度14%的三乙胺乙腈溶液、体积浓度1.25%的异硫氰酸苯酯乙腈溶液各50ul，再加正亮氨酸内标溶液10ul，加盖，混匀，置于28°C±0.5°C下衍生90分钟，取出，加正己烷400ul，振摇，静置10min，取下层溶液，即得珍珠粉标准品溶液；②参照物正亮氨酸内标溶液的制备准确称取正亮氨酸适量，加0.lmol/L盐酸溶液使溶解，制成浓度为lmg/ml的内标液；③色谱条件采用Ve皿sil-AA分析柱(4.6mmX250mm，5iim)，以用醋酸调节至pH=6.50的0.1M的醋酸钠水溶液为流动相A(该流动相温度与室温平衡时，应保持26°C±2°C)，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为254nm;柱温45。C;体积流量为lml/min;理论板数按正亮氨酸峰计算应不得低于1.1X105。测定精密吸取珍珠粉标准品溶液及正亮氨酸内标溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，制定珍珠粉标准指纹图谱所述珍珠粉标准指纹图谱中，共有9个特征峰，各特征峰对应的相对保留时间、各峰相对峰面积的均值和区间如下1#峰0.25，0.29，0.260.32;2#峰:0.28，0.10，0.090.12;3#峰:0.42，0.32，0.280.35;4#峰:0.44，0.99，0.901.1;5#峰0.52，0.13，0.120.14;6#峰0.59，1，1;7#峰0.94，0.22，0.210.24;8#峰:1.ll，O.14，0.130.15;9#峰:1.21，0.18，0.170.20;相对保留时间标的个峰的出峰保留时间与内标物正亮氨酸出峰保留时间的比值。相对峰面积标的个峰的面积与Ala丙氨酸(图示6#峰，相对保留时间0.59)峰面积的比值。(2)按照步骤(1)相同方法测定待测珍珠粉指纹图谱；(3)将待测珍珠粉指纹图谱与珍珠粉标准指纹图谱进行比对，按照下述标准进行判定①峰貌判定19#特征峰缺失数量不得多于1个，且19#特征峰的峰大小关系应符合4#峰或6#峰>1#峰或3#峰>7#峰或9#峰>8#峰或5#峰或2#峰，不满足上述条件为非珍珠粉；②相对峰面积指纹特征判定当样品有个峰的相对峰面积超出上下限10%为非珍珠粉；③以均值为标准对照组，通过Excel软件函数C0RREL计算样品组与标准对照组的相关系数；相关系数不小于0.996为珍珠粉，小于0.996为非珍珠粉。所述步骤(1)第③步中梯度洗脱步骤各时间段流动相A和流动相B体积含量变化如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本发明的有益效果主要体现在采用本发明方法对珍珠粉进行分析鉴定，速度快、灵敏度高，为珍珠粉的鉴别和品质评价、质量控制、制定质量标准提供了重要依据。(四)图1为珍珠粉标准指纹图谱。(五)具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1:珍珠粉标准指纹图谱的建立(1)珍珠粉标准品溶液的配制精密称取纯珍珠粉500mg，于15ml耐温耐压瓶中，准确加入6M的盐酸5ml，加盖密封，置于ll(TC下，水解24小时；取出，放冷，开瓶，将水解液移至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣以水溶解，移入10ml量瓶中，定容，摇匀，用孔径为0.45微米的微孔滤膜精滤，取滤液100ul至2ml小瓶中，依次准确加入体积浓度14%的三乙胺乙腈溶液(乙腈为溶剂)、体积浓度1.25%的异硫氰酸苯酯乙腈溶液(乙腈为溶剂)各50ul，再加正亮氨酸内标溶液10ul，加盖，混匀，置于28°C±0.5t:下衍生90分钟，取出，加正己烷400ul，振摇，静置10min，取下层溶液，即得珍珠粉标准品溶液；(2)参照物正亮氨酸内标溶液的制备准确称取正亮氨酸适量，加0.lmol/L盐酸溶液使溶解，制成浓度为lmg/ml的内标液；(3)色谱条件采用Ve皿sil-AA分析柱(4.6mmX250mm，5ym)，以用醋酸调节至pH=6.50的0.1M的醋酸钠水溶液为流动相A(该流动相温度与室温平衡时，应保持26°C±2°C)，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长为254nm;柱温45。C;体积流量为lml/min;理论板数按正亮氨酸峰计算应不得低于1.1X105:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(4)测定精密吸取珍珠粉标准品溶液及正亮氨酸内标溶液2L，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，制定珍珠粉标准指纹图谱所述珍珠粉标准指纹图谱(见图1)中，共有9个特征峰，各特征峰对应的相对保留时间、各峰相对峰面积的均值和区间如下1#峰0.25，0.29，0.260.32;2#峰0.28，0.10，0.090.12;3#峰0.42，0.32，0.280.35;4#峰0.44，0.99，0.901.1;5#峰:0.52，0.13，0.120.14;6#峰0.59，1，1;7#峰0.94，0.22，0.210.24;8#峰1.11，0.14，0.130.15;9#峰:1.21，0.18，0.170.20。实施例2:参照实施例1方法，精密称取浙江山下湖珍珠集团股份有限公司生产的千足牌珍珠粉500mg，于15ml耐温耐压瓶中，准确加入6M的盐酸5ml，加盖密封，置于ll(TC下，水解24小时；取出，放冷，开瓶，将水解液移至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣以水溶解，移入10ml量瓶中，定容，摇匀，微孔滤膜精滤，取滤液lOOul至2ml小瓶中，依次准确加入体积浓度14%的三乙胺乙腈溶液、体积浓度1.25%的异硫氰酸苯酯乙腈溶液各50ul，再加正亮氨酸内标溶液10ul，加盖，混匀，置于28°C±0.5t:下衍生90分钟，取出，加正己烷400ul，振摇，静置10min，取下层溶液，即得千足牌珍珠粉试品溶液。精密吸取试品溶液2ul，注入液相色谱仪，进行色谱分析。各峰对应的相对保留时间和相对峰面积的均值如下1#峰0.25，0.2954;2#峰0.28，0.1060;3#峰0.42，0.3357;4#峰0.44，0.9898;5#峰0.52，0.1316;6#峰0.59，1，1;7#峰0.94，0.2269;8#峰1.ll，O.1440;9#峰1.21，0.1894。通过与珍珠粉标准指纹图谱对比发现，千足牌珍珠粉19#特征峰无缺失，且19#特征峰的峰大小关系符合4#峰或6#峰>1#峰或3#峰>7#峰或9#峰>8#峰或5#峰或2#峰，无个峰的相对峰面积超出其上下限10%，另外通过Excel软件函数CORREL计算样品组与标准对照组的相关系数为0.9999，综上证明千足牌珍珠粉为纯珍珠粉。实施例3:参照实施例1方法，精密称取市售蚌壳粉500mg，于15ml耐温耐压瓶中，准确加入6M的盐酸5ml，加盖密封，置于11(TC下，水解24小时；取出，放冷，开瓶，将水解液移至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣以水溶解，移入10ml量瓶中，定容，摇匀，用孔径为0.45微米的微孔滤膜精滤，取滤液100ul至2ml小瓶中，依次准确加入体积浓度14%的三乙胺乙腈溶液、体积浓度1.25%的异硫氰酸苯酯乙腈溶液各50ul，再加正亮氨酸内标溶液10ul，加盖，混匀，置于28°C±0.5t:下衍生90分钟，取出，加正己烷400ul，振摇，静置10min，取下层溶液，即得蚌壳粉试品溶液。精密吸取试品溶液2ul，注入液相色谱仪，进行色谱分析。各峰对应的相对保留时间和相对峰面积的均值如下1#峰0.25，0.2142;2#峰0.28，0.0762;3#峰0.42，0.2152;4#峰0.44，0.8843;5#峰0.52，0.1064;6#峰0.59，1，1;7#峰0.94，0.2019;8#峰1.ll，O.1285;9#峰1.21，0.1306。通过与珍珠粉标准指纹图谱对比发现，该蚌壳粉19#特征峰无缺失，且19#特征峰的峰大小关系符合4#峰或6#峰>1#峰或3#峰>7#峰或9#峰>8#峰或5#峰或2#峰，但1#、2#、3#、5#、9#的相对峰面积超出上下限10%，另外通过Excel软件函数CORREL计算样品组与标准对照组的相关系数为0.9949，综上验证了蚌壳粉非珍珠粉。权利要求一种珍珠粉的高效液相指纹图谱鉴定方法，所述方法包括(1)珍珠粉标准指纹图谱的建立①珍珠粉标准品溶液的配制精密称取纯珍珠粉250～750mg，于10～20ml耐温耐压瓶中，准确加入6M的盐酸1～10ml，加盖密封，置于80℃～120℃下，水解12～36小时；取出，放冷，开瓶，将水解液移至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣以水溶解，移入10ml量瓶中，定容，摇匀，微孔滤膜精滤，取滤液100ul至2ml小瓶中，依次准确加入体积浓度14％的三乙胺乙腈溶液、体积浓度1.25％的异硫氰酸苯酯乙腈溶液各50ul，再加正亮氨酸内标溶液10ul，加盖，混匀，置于28℃±0.5℃下衍生90分钟，取出，加正己烷400ul，振摇，静置10min，取下层溶液，即得珍珠粉标准品溶液；②参照物正亮氨酸内标溶液的制备准确称取正亮氨酸适量，加0.1mol/L盐酸溶液使溶解，制成浓度为1mg/ml的内标液；③色谱条件采用Venusil-AA分析柱，以用醋酸调节至pH＝6.50的0.1M的醋酸钠水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为254nm；柱温45℃；体积流量为1ml/min；④测定精密吸取珍珠粉标准品溶液及正亮氨酸内标溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，制定珍珠粉标准指纹图谱所述珍珠粉标准指纹图谱中，共有9个特征峰，各特征峰对应的相对保留时间、各峰相对峰面积的均值和区间如下1#峰0.25，0.29，0.26～0.32；2#峰0.28，0.10，0.09～0.12；3#峰0.42，0.32，0.28～0.35；4#峰0.44，0.99，0.90～1.1；5#峰0.52，0.13，0.12～0.14；6#峰0.59，1，1；7#峰0.94，0.22，0.21～0.24；8#峰1.11，0.14，0.13～0.15；9#峰1.21，0.18，0.17～0.20；(2)按照步骤(1)相同方法测定待测珍珠粉指纹图谱；(3)将待测珍珠粉指纹图谱与珍珠粉标准指纹图谱进行比对，按照下述标准进行判定①峰貌判定1～9#特征峰缺失数量不得多于1个，且1～9#特征峰的峰大小关系应符合4#峰或6#峰＞1#峰或3#峰＞7#峰或9#峰＞8#峰或5#峰或2#峰，不满足上述条件为非珍珠粉；②相对峰面积指纹特征判定当样品有个峰的相对峰面积超出上下限10％为非珍珠粉；③以均值为标准对照组，通过Excel软件函数CORREL计算样品组与标准对照组的相关系数；相关系数不小于0.996为珍珠粉，小于0.996为非珍珠粉。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)第③步中梯度洗脱步骤各时间段流动相A和流动相B体积含量变化如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>全文摘要本发明提供了一种珍珠粉的高效液相指纹图谱鉴定方法，所述方法包括珍珠粉标准指纹图谱的建立、待测珍珠粉指纹图谱的测定和结果判定等步骤；采用本发明方法对珍珠粉进行分析鉴定，速度快、灵敏度高，为珍珠粉的鉴别和品质评价、质量控制、制定质量标准提供了重要依据。文档编号G01N30/36GK101696960SQ20091015441公开日2010年4月21日申请日期2009年10月23日优先权日2009年10月23日发明者冯旭俊,李小龙,谢乾程申请人:浙江英格莱制药有限公司;