专利名称：评估血清持久性有机污染物水平的前处理方法
评估血清持久性有机污染物水平的前处理方法
技术领域：
本发明涉及一种测定样本中某种物质含量的方法，具体地说，涉及一种利用气相色谱电子捕获检测器测定脐带血清中持久性有机污染物水平的前处理方法。
背景技术：
测定生物样本中某种物质含量是评估人群暴露量的最客观、直接方式，但在流行病学调查实际操作过程中(特别是儿童人群)能获得生物样本量并不多。因此，在流行病学调查中，需要建立一种简单、方便，并且样本需求量小的评估测定方法。多氯联苯和有机氯农药属于持久性有机污染物，它们具有持久性、脂溶性，主要通过食物链进入人体，也可以通过胎盘进入胎儿体内。动物实验表明这类物质有内分泌干扰作用，会影响后代生长发育。流行病学调查中主要通过测定生物样本(例如血清、血浆、乳汁等)多氯联苯和有机氯农药的含量，了解其暴露水平，进而评估其对婴幼儿生长发育的影响。脐带作为连接母亲与孩子的“桥梁”，在输送营养物质的同时，多氯联苯、有机氯农药等污染物可通过胎盘屏障到达胎儿体内，因此经常通过测定脐带血清中这些物质含量来评估母亲暴露对下一代生长发育的影响。鉴于这个原因，本发明提供一种主要探讨血清中持久性有机污染物水平的前处理方法。现有的评估测定方法主要包括①蛋白变性蛋白变性剂的选择非常重要，在引起蛋白变性的同时又不会导致蛋白过度变性，进而发生蛋白与被分析物质的共沉淀现象。目前多利用甲酸、Na2SO4溶液、乙腈等作为蛋白变性剂；也有用ι-丙醇作变性剂。每种变性剂的效果不同。②萃取血清成分比较复杂，除被测组分以外还有蛋白质、脂类等多种物质。在萃取被测组分的同时还要除去这些物质可能带来的干扰。在现有方法中，多为C18萃取柱和浓硫酸-硅胶柱联用。C18萃取柱不仅可以吸附被测组分，也可以除去血清中蛋白质的干扰；浓硫酸-硅胶柱主要用于去除脂类及其它一些极性物质。③洗脱目前多用正己烷和二氯甲烷混合液作为洗脱剂，正己烷是非极性溶剂，可以洗脱非极性物质；二氯甲烷是极性溶剂，主要用来洗脱极性物质。现有的评估测定方法主要有如下不足①重复性欠佳用Na2SO4溶液、乙腈、甲酸等作变性剂时，常常产生蛋白过量变性， 血清变得粘稠，容易堵塞萃取柱，进而影响后续过程；C18萃取柱和浓硫酸-硅胶柱联用时， 某些有机氯农药会和浓硫酸反应，影响回收率；除此之外，浓硫酸-硅胶柱需要现用现配， 在配置过程中要保证浓硫酸和硅胶充分混勻，在长期配置过程中，很难确保浓硫酸和硅胶的比例及混勻程度均一致。这些因素均会导致重复性不好。②操作过程繁琐在前处理过程中，硅胶要300°C烘干过夜；配置浓硫酸和硅胶混合物质的玻璃容器要丙酮清洗后30(TC烘干过夜；要保证浓硫酸和硅胶充分混合需要不断地搅拌、混勻；这些过程均增加了前处理过程的工作量，需要消耗大量时间。
发明内容本发明的目的是提供一种简单、方便，并且标本需求量小的评估血清持久性有机污染物水平的前处理方法。为实现以上目的，本发明公开如下技术方案一种评估血清持久性有机污染物水平的前处理方法，包括⑴蛋白变性⑵萃取⑶洗脱⑷定容四个步骤，其中蛋白变性蛋白变性剂为I-丙醇和超纯水混合液，体积比为力-丙醇^m = 15 85 ；萃取C18萃取柱和碱性铝柱联用；洗脱洗脱液为正己烷和二氯甲烷混合液，体积比为Viags: Y^gi= 80 20；定容将含有被测物质的洗脱液氮吹，最后用异辛烷定容。本发明的积极效果利用气相色谱电子捕获检测器测定脐带血清中多氯联苯和有机氯农药含量的前处理方法，选用1-丙醇和超纯水混合液(V1^s Ve^= 15 85)作为变性剂，使血清中蛋白变性的同时不会堵塞萃取柱，血清通过萃取柱时可以顺利通过；除使用C18萃取柱外，还使用碱性铝柱以便除掉血清中脂肪酸等其它物质的干扰，同时也解决了在每次配置浓硫酸和硅胶混合物时不一致化的问题。本发明公开的评估测定方法操作简单，样本需求量小，更适合流行病学调查需要。
图1为前处理流程图。
具体实施方式以下结合附图对本发明做详细说明。耗材及试剂①所需试剂Na2SO4 :Sigma Company (America)，分析纯，1-丙醇:Merck Company (Germany),色谱纯；丙酮Merck Company (Germany),色谱纯；正己烧:Merck Company (Germany),色谱纯；二氯甲烷 Jedia Company (Germany)，色谱纯；甲醇Merck Company (Germany)，色谱纯；异辛烧:Merck Company (Germany)，色谱纯；标品J&K Chemical LTD (Sweden)；超纯水。②所需耗材1)SampliQ C18,200mg,3ml ；Agilent company(America)2) SampliQ M^it^s B, 500mg, 3ml ；Agilent company (America)3)4ml 螺纹口样品瓶；Agilent company (America)4)2ml 广口螺纹口玻璃瓶，透明；Agilent company (America)5)4ml螺纹口样品瓶瓶盖，黑色13X425盖，PTFE/硅橡胶隔垫； Agilentcompany(America)
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6)聚丙烯螺纹口瓶盖，带一体的隔垫，蓝色，PTFE/硅橡胶隔垫； Agilentcompany(America)7)4ml 螺纹口样品瓶镉垫，乳白色，PTFE 隔垫；Agilent company (America)8)适用于 anl，12*32mm 广口样品瓶的内插管；Agilent company (America)9) 99. 999 % 高纯氮气；10)99. 99% 氮气；11) feif tt, DB-1701,60m*0. 25mm*0. 25um ；Agilent company (America)12)接头；Agilent company (America)13)真空前处理装置；Agilent company (America)14)真空抽气泵；15)氮吹仪。一、前处理流程图如图1所示，具体操作过程为1)配置标液原内标溶液浓度为200μ g/L，溶剂为异辛烷，为使内标能均勻分散， 配置以丙酮为溶剂、浓度为100μ g/L的中间液，考虑到丙酮的挥发性，中间液体每次做实验之前配置；2)取^il螺纹口样品瓶，依次加入300 μ 1 1-丙醇、20 μ 1中间液体、1700 μ 1超纯水及2ml血清，超声水浴lOmin，使整个体系均勻；3)萃取用C18萃取小柱萃取被测物质。为保证不受污染，先用甲醇及1-丙醇和超纯水混合液(ν ν = 15 8 清洗；然后将超声微波后的混合液加入C18萃取小柱，用 Iml 1-丙醇和超纯水混合液(ν ν = 15 85)清洗細1样品瓶3次，清洗液也加到C18 萃取小柱中，液体成滴滴下；最后用8-lOml超纯水冲洗C18萃取小柱，除去甲醇、丙醇及蛋白等物质残留；4)除水将C18萃取小柱离心20min，转速为4500rpm ；然后打开真空抽气泵抽真空60min，以保证除去C18萃取小柱中残留的水分；5)洗脱用8ml正己烷和二氯甲烷混合液(v ν = 80 20)洗脱。为避免血清中残留蛋白、脂肪酸等物质的干扰，利用接头在C18萃取小柱下接氧化铝萃取小柱。氧化铝萃取小柱在用之前先用体积比为50 50的正己烷和二氯甲烷混合液清洗；6)定容将8ml洗脱液氮吹至500 μ 1，然后用异辛烷将其定容至100 μ 1。二、上样测定测定仪器为气相色谱一电子捕获检测器(7890Α，Agilent companyAmerica)；feif tt :DB-1701,60m*0. 25mm*0. 25um(Agilent company, America)；测定程序不分流进样，进样口温度洲0°C，压力28. Ipsi，流速1. 5mL/min，平均速率 28. 68cm/sec ；炉温 80°C，保持 1. 5min ；程序升温80°C保持0分钟，以10°C /min上升至180°C，在以2°C /min上升至 220°C保持3分钟，接着以12°C /min上升至250°C保持0分钟，然后以15°C /min降至200°C 保持0分钟，最后以4°C /min上升至250°C保持17分钟；检测器温度320°C，尾吹气60mL/ min，采集信号频率20Hz。三、被测组分的定性与定量定性单独上每种被测组分的标样，利用保留时间定性；
定量外标法定量；表-1:标准曲线的配置
权利要求
1. 一种评估血清持久性有机污染物水平的前处理方法，包括(1)蛋白变性(2)萃取 (3)洗脱(4)定容四个步骤，其特征在于蛋白变性蛋白变性剂为1-丙醇和超纯水混合液，体积比为V1^e Vg纯水=15 85; 萃取C18萃取柱和碱性铝柱联用；洗脱洗脱液为正己烷和二氯甲烷混合液，体积比为V正己烧Viws= 80 20； 定容将含有被测物质的洗脱液氮吹，最后用异辛烷定容。
全文摘要
本发明公开了一种评估血清持久性有机污染物水平的前处理方法，包括(1)蛋白变性(2)萃取(3)洗脱(4)定容四个步骤，蛋白变性时蛋白变性剂为1-丙醇和超纯水混合液，体积比为V1-丙醇∶V超纯水＝15∶85；萃取时C18萃取柱和碱性铝柱联用；洗脱时洗脱液为正己烷和二氯甲烷混合液，体积比为V正己烷∶V二氯甲烷＝80∶20；定容时先将含有被测物质的洗脱液氮吹，后用异辛烷定容。该方法简单、方便，并且样本需求量小，适合人群大规模流行病学调查需要，具有很好的应用价值。
文档编号G01N30/06GK102156173SQ201010109678
公开日2011年8月17日 申请日期2010年2月11日 优先权日2010年2月11日
发明者余晓丹, 余晓刚, 张燕萍, 徐健, 曹露露, 沈晓明, 邹向宇, 颜崇淮 申请人:上海交通大学医学院附属新华医院