专利名称：一种三氟乙酸去除装置及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于色谱和质谱在线联用接口技术领域，具体涉及一种基于双极膜电渗析原理的三氟乙酸去除装置。
背景技术：
三氟乙酸是常用的液相色谱流动相添加剂，可以改善碱性小分子及蛋白质、多肽等生物分子在反相色谱柱上的分离效果或者峰形。另一方面，质谱具有灵敏度高、能提供结构信息等优点，液相色谱-质谱联用技术已成为生物药物分析的主流分析方法。然而，含三氟乙酸的液相色谱系统却不能直接与质谱联用，因为三氟乙酸的存在会抑制电喷雾质谱的离子化过程，严重降低检测灵敏度。产生离子抑制作用的原因，一方面是三氟乙酸溶液电导高、表面张力大，造成电喷雾不稳定；另一个原因是三氟乙酸阴离子会与目标分子离子形成稳定离子对，抑制目标分子的检测信号。解决这一问题最常用的方法是在色谱柱与质谱之间通过一个三通引入含丙酸的异丙醇，高浓度的丙酸可以与三氟乙酸形成竞争，从而破坏三氟乙酸与目标分子形成的离子对，释放出目标分子离子而被质谱检测。这种方法的显著缺点是会造成样品的稀释，且三氟乙酸实际上仍存在于流动相中。另一个解决方案是用毛细管液相色谱替代常规色谱，通过引入低表面张力的鞘液以及鞘气来提高电喷雾稳定性。此方案的不足在于只适用于毛细管液相色谱，通用性差。
发明内容
针对已有解决方案的不足，本发明提供一种基于双极膜电渗析的可用作液相色谱-质谱联用通用接口的连续型三氟乙酸去除装置。本发明提供的三氟乙酸去除装置，其特征在于，包括第一钛电极(6)、第一聚碳酸酯薄片G)、双极膜(1)、聚四氟乙烯薄膜(3)、阴离子交换膜O)、第二聚碳酸酯薄片(5)以及第二钛电极(7)，上述各组件上下对齐叠加，其中，双极膜(1)包括位于上表面的阳离子交换层和位于下表面的阴离子交换层，双极膜(1)的阴离子交换层与聚四氟乙烯薄膜(3) 上表面紧密贴合，聚四氟乙烯薄膜C3)上沿长边方向加工一个穿透的微通道(8)，第一聚碳酸酯薄片(4)上沿长边方向加工一个穿透的第一通道(9)，第二聚碳酸酯薄片( 上沿长边方向加工穿透的第二通道(10)，在第二聚碳酸酯薄片( 的上表面沿长边方向的中线上从边缘开始加工第一微槽(11)和第二微槽(12)，通过在阴离子交换膜( 的上表面指压一根毛细管，将阴离子交换膜O)的部分膜分别内陷于第一微槽(11)和第二微槽(12)中，并用环氧树脂结构胶将第一聚醚醚酮毛细管(1 和第二聚醚醚酮毛细管(14)分别固定于第一微槽(11)和第二微槽(1 中，第一聚醚醚酮毛细管(1 和第二聚醚醚酮毛细管(14)与微通道⑶相通。在第一钛电极(6)上加工第一孔(1 和第二孔(16)，在第二钛电极(7)上加工第三孔(17)和第四孔(18)，上述第一孔(15)和第二孔(16)与第一通道(9)相通，第三孔(17)和第四孔(18)与第二通道(10)相通。所述组件夹在具有相同尺寸的第一铝块(19)和第二铝块00)之间，四角用长于所有组件总厚度的螺丝固定，且在第一铝块(19)和第二铝块00)上加工分别与第一、二、 三和四孔相通的孔洞。本发明利用双极膜电渗析原理构建了连续型三氟乙酸去除装置。该装置能够解决含三氟乙酸的体系与质谱不兼容的问题，可以用作含三氟乙酸流动相的液相色谱系统与质谱在线联用的通用接口。该装置利用电渗析原理可以高效除去三氟乙酸，同时利用双极膜 (1)电解产生的氢氧根离子，可以对阴离子交换膜( 进行再生，因此，该装置无需额外的再生步骤而可以连续使用。以该装置为接口的液相色谱-三氟乙酸去除装置-质谱联用系统适用于碱性小分子和蛋白质的定性和定量分析。下面通过该装置去除三氟乙酸能力及其作为液相色谱-质谱联用接口在碱性小分子和蛋白质分析中的应用方面的研究证明本发明的有益效果和实用性。一.该装置去除三氟乙酸能力该装置利用电渗析原理去除三氟乙酸，提高电压和降低通过该装置的流动相的流速均有利于三氟乙酸的去除，但同时也加快了氢氧根离子的生成速度。在高PH条件下，样品可能带上负电荷而被吸附或除去，同时高PH不利于样品的离子化。所以，本研究系统考察了不同电压、不同流速条件下该装置对三氟乙酸的去除能力，并对流动相PH的变化进行了监测。水和乙腈是常用的反相色谱流动相，研究选择含0. 和0.5%三氟乙酸的水溶液及乙腈/水混合溶液作为研究对象，利用电导检测器记录流动相流经装置后的电导值，同时利用PH试纸测定了流动相的pH。研究结果如图2所示，其中，(a)和(b)溶液为含0.5% 三氟乙酸的水溶液，(c)和(d)溶液为含0. 5%三氟乙酸的乙腈/水混合溶液(乙腈与水体积比为50/50)，(e)和(f)溶液为含0. 三氟乙酸的水溶液，(g)和(h)溶液为含0. 1% 三氟乙酸的乙腈/水混合溶液(乙腈与水体积比为50/50)。从图2可以看出，不同溶液的电导和PH随流动相流速和电压的变化趋势相似。在某一特定的流速下，随着电压的升高， 装置对三氟乙酸的去除能力增加，表现为溶液电导降低。当电压升高到一定值时，溶液电导接近纯水的电导，证明了装置的高效去除三氟乙酸能力。但之后随着电压进一步增加，溶液电导开始随着电压的升高而升高。这是由于此时三氟乙酸已被基本去除干净，电压升高促进了氢氧根离子的生成，引起电导值的增加。不断升高的PH值也验证了这一点。在实际应用时，装置通常会选用电导值变化拐点处的电压，因为采用这个电压既可以保证三氟乙酸被去除干净，又可以提供合适的PH环境使样品带正电荷。综上所述，这一研究证明了该装置高效去除三氟乙酸的能力，同时为实际应用电压的选择提供了重要的依据。二 .该装置作为液相色谱-质谱联用接口在碱性小分子分析中的应用本研究将该装置作为液相色谱-质谱联用接口用于碱性小分子的分析。研究选取了 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)和N-苯甲酰-L-精氨酸(BA)两个化合物作为模型化合物，分离所用的液相色谱柱为反相C8柱。研究首先采用液相色谱-紫外检测器系统优化了两个化合物的分离条件。研究结果表明如果流动相(乙腈/水混合溶液)中不添加三氟乙酸，BAEE和BA在C8柱上保留很弱，两者无法分离，如图3 (a)所示。在流动相乙腈 /75%水，体积比)中加入0.5%三氟乙酸后，BAEE和BA得到基线分离，且峰型较好(见图 3(b))。这一结果证明了三氟乙酸对于分离的有益效果。研究进一步采用液相色谱-三氟乙酸去除装置-质谱联用系统用于两个化合物的分析。流动相流经液相色谱柱后，流速由 0. 2ml/min分流为0. 05ml/min，之后进入三氟乙酸去除装置和质谱中。从得到质谱结果中分别提取BAEE(m/z 307.4)和BA(m/z 279.3)的提取离子色谱图(EIC)，如图3(c)所示。 可以看出，两个化合物的峰形与紫外检测器分析结果相似，表明该装置对分离效果的影响可以忽略不计。研究进一步将该系统用于两个化合物的定量分析研究，方法验证结果如表 1所示。两个化合物线性方程相关系数均大于0. 99，相对标准偏差均小于1%，定量分析结果可靠。本研究证明了该装置作为液相色谱-质谱联用接口用于碱性小分子定性和定量分析的实用性。表1液相色谱-三氟乙酸去除装置-质谱联用系统用于BAEE和BA定量分析方法验证结果，包括线性方程、线性范围、相关系数(R2)、检出限(LOD)和相对标准偏差(RSD)
化合物提取离子线性方程*线性范围LOD**R2RSD%***(m/z)(_(μΜ)BAEE307.4Y=0.855X+ 8.4621-1000.9950.2 0.7BA279.3Y=0.869X+ 8.2290.5-500.9980.2 0.3*Y = log (峰面积)，X = log (化合物浓度)**L0D 基于 S/N = 3 测得***化合物浓度为5 μ Μ, η = 5三.该装置作为液相色谱-质谱联用接口在蛋白质分析中的应用本研究将该装置作为液相色谱-质谱联用接口用于蛋白质的分析。研究选取核糖核酸酶A(RNase A)、细胞色素C(CYC)、溶菌酶(LYS)和肌球蛋白(MYG)作为模型化合物，分离所用的液相色谱柱为反相C18柱。研究首先采用液相色谱-紫外检测器系统优化了四个蛋白质的分离条件。分别采用甲酸和三氟乙酸作为流动相添加剂，优化流动相梯度，得到的研究结果分别如图4(a)和(b)所示。如图中所示，当采用0. 甲酸作为添加剂，RNase A 在死时间出峰，CYC和LYS无法分离，而采用0. 三氟乙酸作为添加剂时，四个蛋白质得到了很好分离且峰形较好。这一结果证明了三氟乙酸能够改善蛋白质的分离效果。研究进一步采用液相色谱-三氟乙酸去除装置-质谱联用系统分析四种蛋白质。四种蛋白质的质谱图如图 4(d)中所示。分别提取 RNase A(m/z 1053. 5)、CYC(m/z 816. 3) ,LYS(m/z 1101.3) 和MYG(m/z 848.6)的EIC图，结果如图4(d)所示。四种蛋白质的峰形与紫外检测器分析结果相似，表明该装置对蛋白质分离效果的影响可以忽略不计。为了证明三氟乙酸的去除有利于改善检测灵敏度，研究将含0. 三氟乙酸的液相色谱系统直接与质谱联用，其他分析条件不变，得到如图4 (c)所示结果。RNase A和LYS无法检出，CYC和MYG峰面积分别为三氟乙酸去除后得到的峰面积的1/2和1/3，证明了三氟乙酸去除装置的有益效果。采用液相色谱-三氟乙酸去除装置-质谱联用系统用于四个蛋白质定量分析的结果列于表2。四种蛋白质线性相关系数和相对标准偏差均较好，可以满足实际定量分析需求。本研究证明了该装置作为液相色谱-质谱联用接口用于蛋白质定性和定量分析的实用性。 表2液相色谱-三氟乙酸去除装置-质谱联用系统用于蛋白质定量分析方法验证结果，包括线性方程、线性范围、相关系数(R2)、检出限(LOD)和相对标准偏差(RSD)
权利要求
1.一种三氟乙酸去除装置，其特征在于，包括第一钛电极(6)、第一聚碳酸酯薄片0)、 双极膜(1)、聚四氟乙烯薄膜(3)、阴离子交换膜O)、第二聚碳酸酯薄片(5)以及第二钛电极(7)，上述各组件上下对齐叠加，其中，双极膜(1)包括位于上表面的阳离子交换层和位于下表面的阴离子交换层，双极膜(1)的阴离子交换层与聚四氟乙烯薄膜(3)上表面紧密贴合，聚四氟乙烯薄膜C3)上沿长边方向加工一个穿透的微通道(8)，第一聚碳酸酯薄片 (4)上沿长边方向加工一个穿透的第一通道(9)，第二聚碳酸酯薄片( 上沿长边方向加工穿透的第二通道(10)，在第二聚碳酸酯薄片(5)的上表面沿长边方向的中线上从边缘开始加工第一微槽(11)和第二微槽(12)，通过在阴离子交换膜O)的上表面指压一根毛细管， 将阴离子交换膜O)的部分膜分别内陷于第一微槽(11)和第二微槽(12)中，并用环氧树脂结构胶将第一聚醚醚酮毛细管(1 和第二聚醚醚酮毛细管(14)分别固定于第一微槽 (11)和第二微槽(1 中，第一聚醚醚酮毛细管(1 和第二聚醚醚酮毛细管(14)与微通道 ⑶相通。
2.如权利要求1所述的三氟乙酸去除装置，其特征在于，在第一钛电极(6)上加工第一孔(15)和第二孔(16)，在第二钛电极(7)上加工第三孔(17)和第四孔(18)，上述第一孔 (15)和第二孔(16)与第一通道(9)相通，第三孔(17)和第四孔(18)与第二通道(10)相ο
3.如权利要求1所述的三氟乙酸去除装置，其特征在于，所述组件夹在具有相同尺寸的第一铝块(19)和第二铝块00)之间，四角用长于所有组件总厚度的螺丝固定，且在第一铝块(19)和第二铝块00)上加工分别与第一、二、三和四孔相通的孔洞。
4.权利要求1所述的三氟乙酸去除装置作为液相色谱系统与质谱在线联用的通用接口的应用。
5.权利要求4所述的液相色谱系统与质谱在线联用的通用接口在碱性小分子和蛋白质分析中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种利用双极膜电渗析构建的可以用作液相色谱与质谱在线联用通用接口的连续型三氟乙酸去除装置，属于液相色谱和质谱在线联用技术领域。该装置能够解决含三氟乙酸流动相的液相色谱系统与质谱不兼容的问题。该装置利用电渗析原理可以高效除去三氟乙酸，同时利用双极膜1电解产生的氢氧根离子，可以对阴离子交换膜2进行再生，因此，该装置无需额外的再生步骤而可以连续使用。以该装置为接口的液相色谱-三氟乙酸去除装置-质谱联用系统适用于碱性小分子和蛋白质的定性和定量分析。
文档编号G01N1/34GK102507296SQ20111034537
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者刘虎威, 周志贵, 廖一平, 张佳玲, 白玉, 邢佳伟 申请人:北京大学