串珠镰刀菌素酶联免疫检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明为串珠镰刀菌素酶联免疫检测试剂盒，其检测快速、灵敏、准确、操作简便，适用于大批量样品的检测，为此本发明还提供了试剂盒的制备及检测方法。其特征在于：包括包被板、串珠镰刀菌素标准品、串珠镰刀菌素单抗冻干品和酶标记的羊抗鼠抗体冻干品；检测时取包被板，加入50μL的串珠镰刀菌素标准品或处理好的样品到微孔中，加50μL辣根过氧化物酶（HRP）-羊抗鼠抗体，加50μL抗串珠镰刀菌素抗体，室温下反应30min，用洗涤液洗3次～5次，用吸水纸拍干，加50μL显色液A和50μL显色液B，暗处静置15分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的串珠镰刀菌素含量。
【专利说明】串珠镰刀菌素酶联免疫检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于食品安全检测领域，具体涉及食品中有害残留物质的检测方法，特别是一种串珠镰刀菌素酶联免疫检测试剂盒的发明。
【背景技术】
[0002]串珠镰刀菌素是某些镰刀菌的代谢产物，因最初是由Cole等人于1973年自串珠镰刀菌的培养物中提取出来的，而被命名为串珠镰刀菌素串珠镰刀菌素。该菌素为水溶性，对动物各器官，特别对心血管有极强的毒性作用。串珠镰刀菌的化学名为3，4_ 二酮-1-羟基环丁烯，自然界中以钠盐或钾盐的方式存在。它是淡黄色针状结晶，具有水溶性。串珠镰刀菌素的毒性很强，小鸡经口 LD5tl为4.0 mg/kg。急性中毒的大鼠可导致进行性肌肉衰弱。呼吸困难，发绀，昏迷和死亡。有人认为某些疾病与摄食玉米有关。该毒素的毒理作用是选择性抑制氧化戊二酸盐脱氢酶和丙酮酸盐脱氢酶系统。Wilson等发现了串珠镰刀菌素的肝毒性和致肝癌性。在食品和饲料中，串珠镰刀菌素的检测方法有薄层色谱法，气象色谱法，气-质联机和高效液相色谱法。由于以上诸分析法样品前处理比较复杂，操作时需专门的技术人员、检测费用昂贵，不利于推广应用。
【发明内容】
[0003]本发明为串珠镰刀菌素酶联免疫检测试剂盒。其检测快速、灵敏、准确、可定量，操作简便，且对样品纯度要求不高，特异性强，特别适用于大批量样品的检测，为此，本发明还提供了专用试剂盒的制备及检测方法。其特征在于:包有串珠镰刀菌素固相抗原的包被板制备(包括串珠镰刀菌素酶标二抗，洗涤液，显色液，终止液等的制备)，串珠镰刀菌素单克隆抗体的制备。
[0004]串珠镰刀菌素一牛血清白蛋白偶联物的制备:将串珠镰刀菌素溶解在3 mL-100mL吡啶中，加入羧甲基羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加入10 mL-100 mL蒸馏水，用氢氧化钠溶液调PH为8.5-9.5左右，再用二氯甲烷提取3次-5次，每次10 mL-20mL,弃去二氯甲烷，水层用盐酸溶液调pH为2.5-3.5左右，再用二氯甲烷提取3次-6次，每次10 mL-20 mL，收集二氯甲烷，过无水硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹干，得到串珠镰刀菌素中间产物。取串珠镰刀菌素中间产物，加入3 mL-50 mL 二氧六环，加入氯甲酸乙丁酯，5°C _12°C下搅拌反应30分钟-45分钟，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于5 mL-50 mL蒸馏水和5 mL-50 mL 二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为8_9，50C _12°C下搅拌反应5小时-6小时，然后，以蒸馏水进行透析，换液3次-5次，冷冻干燥，偶联物_20°C _40°C保存；上述反应成分的比例为:串珠镰刀菌素:羧甲基羟胺盐酸盐=(10-1000)mg:(10-2000)mg,串珠镰刀菌素中间产物:氯甲酸乙丁酯:BSA = (10-1000)mg:(10-1000) μ L:( 10-3000) mg。
[0005]串珠镰刀菌素一卵清蛋白偶联物的制备:将串珠镰刀菌素溶解在3 mL-100 mL吡啶中，加入羧甲基羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加入10 mL-100 mL蒸馏水，用氢氧化钠溶液调pH为8.5-9.5左右，再用二氯甲烷提取3次-5次，每次10 mL-20 mL,弃去二氯甲烷，水层用盐酸溶液调PH为2.5-3.5左右，再用二氯甲烷提取3次-6次，每次10 mL-20 mL，收集二氯甲烷，过无水硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹干，得到串珠镰刀菌素中间产物；取串珠镰刀菌素中间产物，加入3 mL-50 mL 二氧六环，加入氯甲酸乙丁酯，5°C -12°C下搅拌反应30分钟-45分钟，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于5 mL-50 mL蒸馏水和5 mL-50 mL 二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为8_9，5°C - 12°C下搅拌反应5小时-6小时，然后，以蒸馏水进行透析，换液3次-5次，冷冻干燥，偶联物_20°C _40°C保存；上述反应成分的比例为:串珠镰刀菌素:羧甲基羟胺盐酸盐=(10-1000)mg:(10-2000)mg,串珠镰刀菌素中间产物:氯甲酸乙丁酯:0VA = (10-1000)mg:(10-1000) μ L:( 10-3000) mg。
[0006]所述抗串珠镰刀菌素单克隆抗体及其溶液的制备:取串珠镰刀菌素一牛血清白蛋白偶联物用生理盐水配成0.1 μ g/μ L抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为10 μ g/只-100 μ g/只小鼠，以后每隔2周-4周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量10 μ g/只-100 μ g/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0以10:1比例混合，离心，去除上清，在50 s-90 s内将0.1 mL-10 mL 50%聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，I分钟-3分钟后加入10 mL-50 mL DMEM培养液，终止融合，水浴静止10分钟-30分钟后离心，去除上清；将融合细胞用含5-30%小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为I X IO4-1 X IO6饲养细胞接种于小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5%-10% CO2, 350C _45°C条件下培养，5天-10天后，每培养孔更换 HT培养液。10天-20天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果。阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法 进行，以串珠镰刀菌素一卵清蛋白偶联物为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)代A对照-A空白)>2.1 ;对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/mL，再取I mL稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对10周龄-13周龄BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3 mL/只-0.5 mL/只，8天-10天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5 X IO6细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于_20°C~_40°C保存；上述反应成分的比例为:串珠镰刀菌素一牛血清白蛋白偶联物:生理盐水=(10-1000) Ug:(0.1-10) mL。
[0007]酶标板制备:
1、串珠镰刀菌素固相抗原的包被板制作，包括包被原的制作、封闭液的配置、以及孵育。把包被原加入包被液用作固相抗原的包板制作。包被液:称取1.6 g碳酸钠加上2.9g碳酸氢钠，加双蒸水至1000 mL，调节pH至9.6。封闭液:称取I g100 mL PBS缓冲液中。包板时每孔100 111^包板液，371:下孵育2 h，后取出洗板两次，加封闭液，每孔180 yL，37°C下孵育1.5 h，取出甩干，加干燥剂2 - 8°C保存；
2、串珠镰刀菌素的标准品由高标稀释而成，稀释液为PBS缓冲液。0.1MPBS:1000mL 蒸馏水中 Nacl 9 g, Na2HPO4.1ffi2O 6 g，NaH2PO4.2H20 0.4 g , pH -J.2 ；
3、串珠镰刀菌素的酶标二抗的酶由辣根过氧化酶标记；
4、洗涤液的制备:十二水磷酸氢钠68.8 g加磷酸二氢钠6.9 g，氯化钠45 g, Tween-20
0.5 mL,加双蒸水至I L,调节pH至7.4 ;
5、显色液的制备:显色液A:无水乙酸钠8.2 g, β-糊精2.5 g,过氧化氢脲428.6 mg,加双蒸水至I L，调节PH至5.0，4°C保存，使用时达室温。显色液B:100 mg TMB溶于10 mLDMSO中，棕色瓶保存。使用时将14.6 mL显色液A与0.45 mL显色液B混合15分钟；
6、终止液制备:2M硫酸，取I份浓硫酸加到8份去离子水中，即为2M硫酸。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]附图1为本发明串珠镰刀菌素标准品的吸光度曲线示意图。
具体实施方案
[0009]样本前处理
处理前须知:
Ca)实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头；
(b)实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果；
(c)未处理的样本冷冻保存；
Cd)处理后的样本可在2-8°C避光保存24 h ;所有样品应于2-8°C避光保存。
[0010]前处理步骤:
1、玉米等粮食作物处理方法
(1)取3g粉碎样品，加入30 mL样品提取液(用去离子水将甲醇按7:3体积比进行稀释，即7份甲醇加3份去离子水，用于提取样本中的串珠镰刀菌素)；
(2)剧烈振荡5min ；
(3)4000 r/min离心5 min,或用普通滤纸过滤；
(4)上清液或滤液用去离子水按1:19比例稀释；取稀释后液体待测。
[0011]2、饲料处理方法
(1)取3g粉碎样品，加入30 mL样品提取液(用去离子水将甲醇按7:3体积比进行稀释，即7份甲醇加3份去离子水，用于提取样本中的串珠镰刀菌素)；
(2)剧烈振荡5min ；
(3)4000 r/min离心5 min,或用普通滤纸过滤；
(4)上清液或滤液用去离子水按1:49比例稀释；取稀释后液体待测。
[0012]测定步骤:
1、将所需试剂和微孔板从冷藏环境中取出，在室温下平衡30min，每种液体使用前均须摇匀。注意标准液均需做2个平行试验；
2、加标准品:加标准品/样本50μ L到对应的微孔中，再加入酶标记物50 μ L/孔，然后再加入50 μ L/孔抗体工作液，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应30 min ；
3、洗板:小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加洗涤液250μ L/孔，每次浸泡15?30s，充分洗漆4?5次,用吸水纸拍干；
4、显色:加入显色A，B液各50μ L/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境反应15 min ；
5、测定:每孔各加50μ L终止液，设定酶标仪在450 nm处，测定OD值(建议用450/630nm双波长检测,在5 min内读完数据)；
6、结果分析
所测得的标准液或样品吸光度的平均值(B)除以第一个标准液(O标准液)的吸光度(B。)值再乘以100%，得到百分吸光度值，
百分吸光度值(％) = B/B0X100%
以标准品浓度的10为底的对数为X轴，百分吸光值为Y轴，绘制标准曲线。然后将样本的百分吸光值代入标准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，为10的幂，乘以稀释倍数，即为样品中所含串珠镰刀菌素的量。
【权利要求】
1.串珠镰刀菌素酶联免疫检测试剂盒的制备，包括洗涤液，显色液，终止液；其特征在于:包有串珠镰刀菌素固相抗原的包被板、串珠镰刀菌素标准品，串珠镰刀菌素单克隆抗体、串珠镰刀菌素酶标二抗。
2.串珠镰刀菌素固相抗原的包被板制作，包括包被原的制作、封闭液的配置、以及孵育；把包被原加入包被液用作固相抗原的包板制作；包被液:称取1.6 g碳酸钠加上2.9 g碳酸氢钠，加双蒸水至1000 mL，调节pH至9.6 ;封闭液:称取I g100 mL PBS缓冲液中；包板时每孔100 μ L包板液，37°C下孵育2 h,后取出洗板两次,加封闭液,每孔180yL，37°C下孵育1.5 h，取出甩干，加干燥剂2 - 8°C保存。
3.根据权利要求书第一条所述，串珠镰刀菌素的标准品由高标稀释而成，稀释液为PBS 缓冲液；0.1M PBS:1000 mL 蒸馏水中加 NaCl 9g, Na2HPO4.12H20 6g，NaH2PO4.2H200.4g, PH:7.2。
4.根据权利要求书第一条所述，串珠镰刀菌素的酶标二抗的酶由辣根过氧化酶标记。
5.根据权利要求书所述，串珠镰刀菌素的检测步骤如下:取包被板，加入标准品/样本50 μ I到对应的微孔中，再加入酶标记物50 μ L/孔，然后再加入50 μ L/孔抗体工作液，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应30 min ;小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加洗涤液250 μ L /孔，每次浸泡15?30 S，充分洗涤4?5次，用吸水纸拍干；加入显色Α,Β液50 μ L/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25°C避光环境反应15 min ;每孔各加50 μ L终止液，设定酶标仪在450 nm处，测定OD值(建议用450/630 nm双波长检测，在5min内读完数据)；从标准曲线中计算样品中串珠镰刀菌素的含量。
【文档编号】G01N33/531GK103808920SQ201210436706
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月6日 优先权日:2012年11月6日
【发明者】杜道林, 尚苏林 申请人:江苏维赛科技生物发展有限公司