杂色曲霉毒素的酶联免疫吸附试剂盒制备及检测方法
【专利摘要】本发明为杂色曲霉毒素的酶联免疫吸附检测专用试剂盒。其检测快速、灵敏、准确、可定量，操作简便，且对样品纯度要求不高，特异性强，特别适用于大批量样品的检测，为此，本发明还提供了专用试剂盒的制备及检测方法。其中包括洗涤液，显色液，终止液。其特征在于：包有杂色曲霉毒素固相抗原的包被板、杂色曲霉毒素（ST）标准品，杂色曲霉毒素单克隆抗体、杂色曲霉毒素酶标抗体。
【专利说明】杂色曲霉毒素的酶联免疫吸附试剂盒制备及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体为对杂色曲霉毒素酶联免疫吸附检测专用试剂盒的制备及专业检测。
【背景技术】
[0002]杂色曲霉素(ST)主要是杂色曲霉和构巢曲霉的最终代谢产物，同时又是黄曲霉和寄生曲霉生成黄血霉毒素过程后期的中间产物。据报道，感染了杂色曲霉的玉米在27°C的环境下，21天可产生杂色曲霉毒素12 g/kg以上。杂色曲霉毒素在1954年由杂色曲霉培养物中首先分离出的，但并未引起人们的足够重视，至发现黄曲霉毒素的强致癌性后，才开始注意。用14-标记方法已证实杂色曲霉毒素能转变成黄曲霉毒素马，而且有人认为杂色曲霉毒素可能是非洲某些地区肝癌的病因。
[0003]能产生ST的菌种主要是杂色曲霉、构巢曲霉和离蠕孢霉。此外，谢瓦曲霉、赤曲霉、焦曲霉、阿姆斯特丹曲霉、黄褐曲霉、四脊曲霉、变色曲霉、爪曲霉、毛壳霉及黄曲霉和寄生曲霉等也可产生ST。上述这些霉菌广泛存在于自然界，可污染大麦、小麦、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火腿、奶酪等粮食、食品和饲草，尤其对小麦、玉米、花生等饲料和饲草污染更为严重。产毒量最高的是杂色曲霉，其次是构巢曲霉和离蠕孢霉，前者产生ST的量约为后者的2倍。
[0004]本发明为杂色曲霉毒素的酶联免疫吸附检测专用试剂盒。其检测快速、灵敏、准确、可定量，操作简便，且对样品纯度要求不高，特异性强，特别适用于大批量样品的检测。
【发明内容】
[0005]本发明提供了专用试剂盒的制备及检测方法。其中包括洗涤液，显色液，终止液。其特征在于:包有杂色曲霉毒素固相抗原的包被板、杂色曲霉毒素(ST)标准品，杂色曲霉毒素单克隆抗体、杂色曲霉毒素酶标抗体。
[0006]检测时，取包被板，加入标准品/样本50 μ L到对应的微孔中，再加入酶标记物50 μ L/孔，然后再加入50 μ L/孔抗体工作液，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应30 min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加洗涤液250 μ L/孔，每次浸泡15~30s，充分洗涤4飞次，用吸水纸拍干。加入显色液100 yL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境反应15 min。每孔各加50 μ L终止液，设定酶标仪在450 nm处，测定OD值(建议用450/630 nm双波长检测，在5 min内读完数据)。从标准曲线中计算样品中ST的含量。测得的标准液或样品吸光度的平均值(B)除以第一个标准液(O标准液)的吸光度(B。)值再乘以100%，得到百分吸光度值，
百分吸光度值(％) = B/B0X100%
以标准品浓度的10为底的对数为X轴，百分吸光值为Y轴，绘制标准曲线。将样本的百分吸光值代入标准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，作为10的幂，乘以稀释倍数，即为样品中所含杂色曲霉毒素的量。【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1为杂色曲霉毒素标准曲线图。
【具体实施方式】
[0008]实施例1样本前处理方法
准确称取5.00 g样品，加45 mL乙腈，5 mL含有4%KC1的40%硫酸溶液后，在振荡机上振荡30 min倾出清液，再用10 mL乙腈分两次洗残渣，收集乙腈液并与上述提取液合并，合并的提取液用石油醚脱脂三(石油醚用量为20，15，10 mL)，脱脂后的提取液加水25mL，用氯仿萃取三次(氯仿用量为20，15，10mL)，收集的氯仿层在低温(_6°C)下冷冻，然后过滤去冰，去脂，用旋转蒸发器蒸干(温度40°C以下)，残渣用样品稀释液溶解后供色谱测定用。
[0009]实施例2杂色曲霉毒素的酶联免疫吸附试剂盒制备
1、杂色曲霉毒素固相抗原的包被板制作，包括包被原的制作封闭、液的配置、以及孵育。把包被原加入包被液用作固相抗原的包板制作。包被液:1.6 g碳酸钠加上2.9 g碳酸氢钠，加双蒸水至1000 mL，调节pH至9.6。封闭液:1 gBSA，IOOmLPBS。包板时每孔100ML包板液，37°C下孵育2 h，后取出洗板两次，加封闭液，每孔180 μ?，37°C下孵育1.5 h，取出甩干，加干燥剂2~8°C保存；
2、包被原的偶联:
碳二亚胺(EDC)法偶联杂色曲霉毒素半抗原与蛋白载体:取5 mg杂色曲霉毒素半抗原和2.5 mg cBSA溶解在250 μ? TE buffer (pH 8.0)中，充分震荡使其溶解，再取EDC.HCl79 mg充分溶解于250 μ?ΤΕ buffer (pH 8.0)中。将杂色曲霉毒素半抗原和cBSA的混合溶液边震荡边逐滴加入EDC溶液，在37°C摇床中反应2 h以上。先用S^hadex柱分离偶联产物和未结合的杂色曲霉毒素半抗原小分子，再透析纯化，将0.5 mL溶液在I3BS中透析3 d，每天换液两次，每次换液200 mL。透析产物杂色曲霉毒素半抗原偶联蛋白小剂量分装，于-20°C保存，备用；
3、杂色曲霉毒素单克隆抗体制备方法:
I材料和方法
(1)试剂 人工抗原:杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白复合物，弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂，L-谷氨酰胺，牛血清白蛋白第五部分，聚乙二醇_1000，2，6，10，14-四甲基十五烷(Pristane ),邻苯二胺,二甲基亚砜,Tris, Hepes pH缓冲剂,免疫球蛋白，辣根过氧化氢酶标物，小鼠IgG和羊抗小鼠IgG等，其它常规化学试剂均为优级纯、分析纯试剂；
(2)免疫动物
8周龄BALB/c雄性小鼠用人工抗原杂色曲霉毒素-BSA行二次免疫；每只小鼠基础免疫剂量为100 Pg，腹腔注射:24d后加强免疫，尾静脉注射，4 d后取脾融合；
(3)细胞融合
免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp-2/O以10:1混合。用50%分子量为1000聚乙二醇作融合剂，融合细胞用含20%小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，接种于似小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于50% C02, 37°C条件下培养，7 d后，每培养孔更换2/3HT培养液。9 d后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆化；
(4)腹水抗体纯化
用硫酸铵盐析法纯化腹水抗体；
(5)杂交瘤筛选及抗体检测
杂交瘤筛选用固相抗原间接竞争性ELISA法进行:包被抗原杂色曲霉毒素-BSA的浓度为15 Pg/mL，每孔加量120 PL ;每孔所含抗体抗原反应物由80 PL培养上清液+2 μ?经紫外分光光度计标定浓度的杂色曲霉毒素(10 Pg/mL)组成；检测对照孔中的抗原部分则用20 PL毒素稀释液(20%Me0H-PBS)代替；酶底物用邻苯二胺(OPD);其它按标准方法进行；
(6)抗体的特性
①抗体滴度:
用固相抗原间接非竞争性ELISA测定，测试条件为:包被抗原为杂色曲霉毒素-BSA，浓度15 Pg/mL，每孔加量150 μ?:抗体从100倍开始对倍稀释,每孔加量130μ? ;抗体稀释液为0.1%的BSA-PBS ;阴性对照孔用SP-2/0骨髓瘤细胞培养上清液；封闭液为1%BSA_PBS，每孔加量250 μ? ;酶底物用OPD。其它按标准方法进行；
②检测标准毒素灵敏度:
先用棋盘滴定法筛选出包 被抗原浓度和抗体工作稀释度的优化组合，以此为测试条件，用固相抗原间接竞争性ELISA法做出杂色曲霉毒素的标准抑制曲线，并对结果进行数理统计分析。其中ELISA测试条件为:包被包被原杂色曲霉毒素-BSA偶联蛋白的浓度为5Kg/mL，每孔加量150 μ? ;抗体工作液稀释比为1:25600 ;抗体稀释液为0.1% BSA-PBS ;抗体抗原反应液为每孔65 PL抗体+65 PL相应浓度杂色曲霉毒素；封闭液为1%BSA-PBS,每孔加量250 μ? ;酶底物为OPD ;阴性对照用Sp-2/O骨髓瘤细胞培养上清液。其它按标准方法进行；
③抗体的特异性:
用固相抗原间接竞争性ELISA法测定，参试毒素为杂色曲霉毒素，构巢曲霉，黄曲霉，寄生曲霉，黄曲霉毒素马，其它测试条件同②；
④抗体亚类分析:
用免疫双扩散法进行；
⑤抗体的亲和力:
Friguet法。对应小鼠IgG标准曲线滴定出抗体IgG含量，再对应抗体滴度曲线求出平衡态下，抗体使抗原达到半饱和时的游离抗体克分子浓度[Ab]，代入下式求出抗体的亲和常数 K (L/moL),
Ka = I / [Ab]
(7)样品中杂色曲霉毒素提取与纯化；
II结果与讨论
细胞融合一与杂交瘤细胞的筛选细胞融合后，约57.6%的孔中长出杂交瘤克隆，其中抗体检测阳性率约为88%。从中选择对抗原有强抑制作用的孔，经多次亚克隆、建立了 5个稳定分泌抗杂色曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株各细胞株经两次亚克隆以后，阳性率已达到100 %。2H8第3次克隆化时有反复(疑为假明性)，所以进行了 4次亚克隆。将上述抗体纯化，即可。
[0010]4、杂色曲霉毒素的标准品由高标稀释而成，稀释液为PBS。0.1M PBS:1000 mL蒸馏水中加 NaCl 9 g, Na2HPO4.Iffi2O6 g, NaH2PO4.2H20 0.4 g, pH:7.2。
[0011]5、杂色曲霉毒素的酶标抗体的酶由辣根过氧化酶标记。该酶标抗体用交联法制作，联剂是25%的戊二醛水溶液。原理是利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的0D235nm/0D28(lnm < 3时，即为好的交联剂。该发明采用一步法制作，即把辣根过氧化酶、戊二醛和杂色曲霉抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有闻分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万)，酶分子量小(4万)，抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体-戊二醛或抗体-戊二醛-抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作:
①抗IgG-杂色曲霉毒素的制备:将10 mg杂色曲霉毒素溶于含有5 mg抗IgG的ImLPBS (0.01 moL/L pH7.0)中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加1%戊二醛溶液4 ml，使戊二醛的最终浓度为0.2%，移至室温中静置2tT3h后，以0.01moL/L pH7.0 PBS液4°C充分透析或以S印hadexG25柱除去过量的戊二醛，4°C保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱);②抗IgG-HRP的制备:将12 mgHRP溶于含5 mg抗IgG的I mLPBS (0.lmol/L ρΗ6.8)中，缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4 mL，置室温2h?3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分装后保存于低温冰箱，避免反复冻融，或冷冻干燥保存。
[0012]6、洗涤液的制备:
十二水磷酸氢钠68.8 g加磷酸二氢钠6.9 g,氯化钠45 g, Tween-20 0.5 mL,加双蒸水至1L,调节pH至7.4。
[0013]7、显色液的制备:
显色液A:无水乙酸钠8.2 g，β-糊精2.5 g，过氧化氢脲428.6 g，加双蒸水至I L，调节pH至5.0，4°C保存，使用时达室温。显色液B:100 mgTMB溶于10 mLDMSO中，棕色瓶保存。使用时将14.6 mL显色液A与0.45 mL显色液B混合15分钟。
[0014]8、终止液制备:
2M硫酸:0.11 L 18M的浓硫酸加水稀释到I L。
[0015]实施例3测定步骤:
1、将所需试剂和微孔板从冷藏环境中取出，在室温下平衡30min，每种液体使用前均须摇匀。注意标准液均需做2个平行试验；
2、加标准品:加标准品/样本50μ L到对应的微孔中，再加入酶标记物50 μ L/孔，然后再加入50μ L/孔抗体工作液，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应30 min ；
3、洗板:小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加洗涤液2501117孔，每次浸泡15?30 s,充分洗涤4飞次，用吸水纸拍干；
4、显色:加入显色液IOOyL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境反应 15 min ；
5、测定:每孔各加50μ L终止液，设定酶标仪在450 nm处，测定OD值(建议用450/630nm双波长检测,在5 min内读完数据)； 6、结果分析:
所测得的标准液或样品吸光度的平均值(B)除以第一个标准液(O标准液)的吸光度(B。)值再乘以100%，得到百分吸光度值，
百分吸光度值(％) = B/B0X100%
以标准品浓度的10为底的对数为X轴，百分吸光值为Y轴，绘制标准曲线。将样本的百分吸光值代入标准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，作为10的幂，乘以稀释倍数，即为样品中所含杂色曲霉毒素的量。
【权利要求】
1.杂色曲霉毒素试剂盒的制备，包括洗涤液，显色液，终止液；其特征在于:包有杂曲霉毒素固相抗原的包被板、杂色曲霉毒素(ST)标准品，杂色曲霉毒素单克隆抗体、杂色曲霉毒素酶标抗体。
2.杂色曲霉毒素固相抗原的包被板制作，包括包被原的制作、封闭液的配置、以及孵育；包被原的偶联:根据杂色曲霉的结构特征偶联载体蛋白BSA方法如下: 碳二亚胺(EDC)法偶联杂色曲霉毒素半抗原与蛋白载体； 取5 mg杂色曲霉毒素半抗原和2.5 mg cBSA溶解在250 μ?ΤΕ buffer (pH 8.0)中，充分震荡使其溶解，再取EDOHCl 79 mg充分溶解于250 μ? TE buffer (pH 8.0)中；将杂色曲霉毒素半抗原和cBSA的混合溶液边震荡边逐滴加入EDC溶液，在37°C摇床中反应2 h以上；先用S^hadex柱分离偶联产物和未结合的杂色曲霉毒素半抗原小分子；再透析纯化，将0.5 mL溶液在PBS中透析3 d，每天换液两次，每次换液200 mL ;制得的杂色曲霉毒素偶联物透析产物小剂量分装，于-20°C保存，备用；包被原加入包被液用作固相抗原的包板制作；包被液:1.6 g碳酸钠加上2.9 g碳酸氢钠，加双蒸水至1000 mL，调节pH至9.6 ;封闭液:1 g BSA，100 mL PBS ；包板时每孔100 PL包板液，37°C下孵育2 h，后取出洗板两次，加封闭液，每孔180 μ?,37°0下孵育1.5 h，取出甩干，加干燥剂疒8°C保存。
3.根据权利要求书第一条所述，杂色曲霉毒素单克隆抗体制备方法 I材料和方法 (1)试剂 人工抗原:杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白复合物，弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂，L-谷氨酰胺，牛血清白蛋白第五部分，聚乙二醇-1000，2，6，10，14-四甲基十五烷(Pristane ),邻苯二胺,二甲基亚砜，Tris, Hepes pH缓冲剂,免疫球蛋白，辣根过氧化氢酶，鼠抗IgG等，其它常规化学试剂均为优级纯、分析纯试剂； (2)免疫动物 8周龄BALB/c雄性小鼠用人工抗原杂色曲霉毒素-BSA进行二次免疫；每只小鼠基础免疫剂量为100 Pg腹腔注射；24 d后加强免疫，剂量为每只小鼠100 Pg，尾静脉注射，4 d后取脾融合； (3)细胞融合 免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp-2/O以10:1混合； 用50%分子量为1000的聚乙二醇作融合剂，融合细胞用含20%小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，接种于类似 小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于50% C02，37°C条件下培养7 d后，每培养孔更换2/3HT培养液；9 d后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆化； (4)腹水抗体纯化 用硫酸铵盐析法纯化腹水抗体； (5)杂交瘤筛选及抗体检测 杂交瘤筛选用固相抗原间接竞争性ELISA法进行:包被抗原杂色曲霉毒素-BSA的浓度为15 Pg/mL，每孔加量120 PL ;每孔所含抗体抗原反应物由80 PL培养上清液+2 μ?经紫外分光光度计标定浓度的杂色曲霉毒素(10 Pg/mL)组成；检测对照中的抗原部分则用20KL毒素稀释液(20%Me0H-PBS)代替；酶底物用邻苯二胺(OPD);其它按标准方法进行；(6)抗体的特性 ①抗体滴度: 用固相抗原间接非竞争性ELISA测定，测试条件为:包被抗原为杂色曲霉毒素-BSA，浓度15 Pg/mL，每孔加量150 PL ;抗体从100倍开始对倍稀释，每孔加量130 PL ;抗体稀释液为0.1%的BSA-PBS ;阴性对照孔用SP-2/0骨髓瘤细胞培养上清液；封闭液为1% BSA-PBS,每孔加量250 μ? ;酶底物用OPD，其它按标准方法进行； ②检测标准毒素灵敏度: 先用棋盘滴定法筛选出包被抗原浓度和抗体工作稀释度的优化组合，以此为测试条件，用固相抗原间接竞争性ELISA法做出杂色曲霉毒素的标准抑制曲线，并对结果进行数理统计分析；其中ELISA测试条件为:包被抗原杂色曲霉毒素-BSA的浓度为5 Pg/mL,每孔加量150 μ? ;抗体工作稀释度1:25600 ;抗体稀释液为0.1% BSA-PBS ;抗体抗原反应液为每孔65 PL抗体+65 PL相应浓度杂色曲霉毒素；封闭液为1% BSA-PBS，每孔加量250 μ? ;酶底物为OPD ;阴性对照用Sp-2/O骨髓瘤细胞培养上清液，其它按标准方法进行； ③抗体的特异性: 用固相抗原间接竞争性ELISA法测定，参试毒素为杂色曲霉毒素，构巢曲霉，黄曲霉，寄生曲霉，黄曲霉毒素马；其它测试条件同②； ④抗体亚类分析: 用免疫双扩散法进行； ⑤抗体的亲和力: Friguet法，对应小鼠IgG标准曲线滴定出抗体IgG含量，再对应抗体滴度曲线求出平衡态下，抗体使抗原达到半饱和时的游离抗体克分子浓度[Ab]，代入下式求出抗体的亲和常数 K (L/moL),
Ka = I /[Ab] (7)样品中杂色曲霉毒素提取与纯化 II结果与讨论 (I)细胞融合与杂交瘤细胞的筛选细胞融合后，约57.6%的孔中长出杂交瘤克隆，其中抗体检测阳性率约为88% ;从中选择对抗原有强抑制作用的孔，经多次亚克隆，建立了 5个稳定分泌抗杂色曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，各细胞株经两次亚克隆以后，阳性率已达到100% ;第3次克隆化时有反复(疑为假明性)，所以进行了 4次亚克隆；将上述抗体纯化，即可。
4.根据权利要求书第一条所述，杂色曲霉毒素的标准品由高标稀释而成，稀释液为PBS ；0.1M PBS:1000 mL 蒸馏水中加 NaCl 9 g, Na2HP04.12H20 6 g, NaH2P04.2H20 0.4g，pH:7.2o
5.根据权利要求书第一条所述，杂色曲霉毒素的酶标抗体的酶由辣根过氧化酶标记；该酶标抗体用交联法制作，交联剂是25%的戊二醛水溶液，原理是利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记；标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的0D235nm/0D28(lnm < 3时，即为好的交联剂；该发明采用一步法制作，即把辣根过氧化 酶、戊二醛和杂色曲霉抗体一起加入进行交联；然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物；由于抗体分子量大(16)，酶分子量小(4万)，抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体-戊二醛或抗体-戊二醛-抗体多而造成酶标物的活性小；一步法操作:①抗IgG-杂色曲霉毒素的制备:将10mg杂色曲霉毒素溶于含有5 mg抗IgG的I mLPBS (0.01 moL/L pH7.0)中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加1%戊二醛溶液4 mL，使戊二醛的最终浓度为0.2%，移至室温中静置2 h~3 h后，以0.01 moL/L pH 7.0 PBS液4°C充分透析或以S印hadexG25柱除去过量的戊二醛，4°C保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱)抗 IgG-HRP 的制备:将 12 mg HRP 溶于含 5 mg 抗 IgG 的 I mLPBS (0.1 moL/L pH 6.8)中，缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4 mL,置室温2tT3h，充分透析或以S^hadexG25除戊二醛，小量分装后保存于低温冰箱，避免反复冻融或冷冻干燥保存。
6.根据权利要求书所述，杂色曲霉毒素的检测步骤如下:取包被板，加入标准品/样本50 μ L到对应的微孔中，再加入酶标记物50 μ L/孔，然后再加入50 μ L /孔抗体工作液，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应30 min ;小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加洗涤液250 μL/孔，每次浸泡15~30 S，充分洗涤4飞次，用吸水纸拍干；加入显色液100μ L /孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25°C避光环境反应15 min;每孔各加50 μ L终止液，设定酶标仪在450 nm处，测定OD值(建议用450/630 nm双波长检测，在5 min内读完数据)；从标准曲线中计算样品中ST的含量
【文档编号】G01N33/577GK103792360SQ201210435692
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年11月5日 优先权日:2012年11月5日
【发明者】杜道林, 祝文珍 申请人:江苏维赛科技生物发展有限公司