专利名称：组合式抗虫bt蛋白金标快速检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及组合式抗虫BT蛋白金标快速检测试剂盒。
技术背景在转基因植物的研制开发或在对转基因产品进行筛选或安全性评价时，往往需要对转入的外源性基因进行定性或半定量测定。有时还需要对多种外源性基因进行同时检测。苏云金芽孢杆菌(BT)具有广泛的杀虫活性，目前已发现了 800多种杀虫晶体蛋白。随着DNA重组技术的发展，将Bt杀虫晶体蛋白基因导入其他微生物或植物中，构建可产生杀虫蛋白的工程菌株或抗虫转基因植物成为研究的主要方向(Barton，et al. 1987 ；Fischhoff et al. 1987 ；Vaeck, et al. 1987 ；Perlak, et al. 1990)。大约近 20 种 Bt 杀虫晶·体蛋白基因已转入不同植物。1987年首批转Bt cry基因的抗虫烟草和番爺问世(Barton,et al. 1987 ；Fischhoff, et al. 1987 ；Vaeck,et al. 1987)。1996 年转 Bt 基因棉花、玉米及马铃薯在美国被批准商品化种植(Peferoen 1997)，这标志着苏云金杆菌杀虫晶体蛋白的应用进入新的产业化阶段。但这些BT杀虫晶体蛋白的氨基酸序列差异很大，例如CrylAC与Cry2AB的同源性为45% ；CryIAa与Cry3A的同源性只有25-30%等等(Li et al.，1991 ；Grochulski et al. ,1995)。现有的检测装置，如酶免、放免等方法的装置，受仪器(酶标仪、放免闪烁仪、离心机等)、场地等因素的限制，而且检测时间长(酶免检测时间需20hr、放免需30min Ihr)，检测成本较高，很难推广应用。以往试纸条检测的方法虽可部分克服以上不足(如美国EnviroLogix Incorporated, Strategic Diagnostics, Inc.和北京奥创金标生物技术有限公司生产的试纸条)，但每种试纸条只能检测转基因作物中单一的外源基因，实际操作中容易产生错误结果。例如如果检测者仅有Bt CrylAc检测试纸条，而检测对象中并未转入BTcryIAc基因，而是转入Bt cry 2ab等基因,那么很可能会得出检测对象不存在外源基因的错误结果，造成不必要的损失。因此，实践中迫切需要有一种可同时检测转基因植物中的不同Bt晶体蛋白，且操作简便、结果准确可靠、快速的装置
实用新型内容
本实用新型的目的是建立一种操作简便、结果准确可靠、快速，可同时检测多种转Bt基因成分的组合式试剂盒。本实用新型的技术方案是这样的一种组合式抗虫BT蛋白金标快速检测试剂盒，包括底板、上盖，底板盖入上盖后组成试剂盒；其特征是底板上放置有测试带；上盖设置有观测窗和加样孔；所述底板的上表面设置有4 8个可嵌入一条测试带的凹槽；所述测试带数量是4 8条；所述观测窗和加样孔的数量分别是4 8个。[0011]所述底板或上盖可具有卡槽，以保证底板与上盖扣紧。所述观测窗优选是长方形。试剂盒的形状是扁平的扇面形盒。在本实用新型的一个实例中，可以同时检测6种转Bt基因成分，在底板内可置6条不同的测试带，且上盖设置相应数量的观测窗和加样孔。所述底板内的6条测试带，第一条用于检测BT-Cry IAc蛋白，第二条用于检测BT-CrylAh蛋白，第三条用于检测BT-Cry 2AB蛋白，第四条用于检测BT-Cry 9C蛋白，第五条用于检测BT-Cry 3A蛋白，第六条用于检测BT-Cry IAa蛋白。所述测试带是一种具有检测系统主体膜反应体系功能的检测材料，由高分子纤维膜、塑料等多层材料制成。六种蛋白的测试带均可分为质控区和检测区，质控区可包被羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG多克隆抗体；BT-Cry IAc蛋白测试带的样品检测区包被BT-Cry IAc的单克隆抗体或多克隆抗体；BT-CrylAh蛋白测试带的样品检测区包被BT-Cry IAh的单克隆抗体或多克隆抗体；BT_Cry 2AB蛋白测试带的样品检测区包被BT-Cry 2AB的单克隆抗体或多克隆抗体；BT-Cry 9C蛋白测试带的样品检测区包被BT-Cry 9C的单克隆抗体或多克隆抗体；BT-Cry 3A蛋白测试带的样品检测区包被BT-Cry 3A的单克隆抗体或多克隆抗体；BT-Cry IAa蛋白测试带的样品检测区包被BT-Cry IAa的单克隆抗体或多克隆抗体。当不同外源基因转入植物，并在植物中表达，将产生不同目的蛋白(BT-Cry IAc,BT-CrylAh, BT-Cry 2AB, BT-Cry 9C, BT-Cry 3A 和 BT-Cry IAa)，因此通过检测样品中是否含有上述六种蛋白来确定该基因是否存在。如果外源基因转入植物，发生基因沉默，无目的蛋白产生，将不能达到预期目的(杀虫等)。本实用新型的目的是这样实现的当底板盖入上盖后，每个观测窗和加样孔各分别对应一条测试带，通过盒盖上的加样孔和观测窗可进行加样和观察检测结果，每个观测窗可分别检查一种基因。每个观测窗分为测试区(T)和质控区(C)两部分，可在上盖上用字母C、T标示出；检测时，将送检物品的同一种提取液分别滴加在试剂盒的六个加样孔中，5-10min后，用肉眼通过上盖的观测窗可以直接观察到准确的检测结果。对于每个观测窗来说，用以下方式判断检测结果I、阴性(-)反应状况观测窗质控区(C)出现一条紫红色条带。检测结果待检样品中不含待检基因或其含量在其阈值以下。2、阳性(+)反应状况观测窗质控区(C)出现一条紫红色条带，在测试区(T)内同时出现紫红色条带。检测结果待检基因含量在阈值以上。3、无效反应状况质控区(C)未出现紫红色条带。检测结果表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。本实用新型所述试剂盒的优点在于经济高效一个检测盒可同时检测6种不同的转基因成份，大大降低了使用成本；[0032]简便快速6种不同的转基因成份一步法操作，同时检测，不需其他任何附加仪器设备。直接将待测样品液滴加在加样孔中，5-10min可出结果；检测结果直观不借助任何仪器，用肉眼可观察到结果；应用广泛可检测玉米、棉花、烟草、油菜、大豆、水稻等多种农作物的叶片、种子及
加工产品。由于本实用新型提供的组合式抗虫BT蛋白金标快速检测试剂盒同时可对植物样品进行 BT-Cry IAc,BT-Cry IAh,BT-Cry 2AB、BT-Cry 9C、BT-Cry 3A 和 BT-Cry IAa 分析，检测快速、特异、敏感、方便，特别适用于转基因产品的研制开发和转基因产品的快速筛选，可用于边防、海关植物检测、食品安全检测及种子经营销售部门现场、快速筛查待测样品。
以下结合附图和实施例，进一步举例说明本实用新型的技术内容。
图I和图2是本实用新型组合式抗虫BT蛋白金标快速检测试剂盒的结构示意图，其中图I是底板的俯视图，底板有六条测试带；图中，3是测试带。图2是试剂盒上盖的俯视图，上盖有6个观测窗；图中，I是加样孔，2是观测窗。
具体实施方式
本实用新型组合式抗虫BT蛋白金标快速检测试剂盒中的测试带的制备以制备BT-Cry IAh的测试带来举例说明实施例I制备测试带I. BT-Cry IAh单抗腹水的制备小鼠腹腔注射液体石蜡O. 5mL。I周后，将BT-Cry IAh单抗杂交瘤细胞注射于以上预先处理过的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射杂交瘤细胞I 3X 106。10天后收获腹水，以上过程皆在无菌条件下完成。2. BT-Cry IAh单克隆抗体的纯化I)以DEAE离子交换层析及Sephacryl S 300分子筛对单抗进行纯化；SDS_PAGE平板电泳检测纯化单抗的纯度；ELISA法测定单抗活性；2)纯化过程取小鼠单抗腹水一3，OOOXg离心15min —上清液加50% (NH4)2SO4沉淀，过夜一3，OOOXg离心20min —沉淀溶于O. OlM磷酸盐缓冲液(pH 7. 2) — S-300凝胶柱一DEAE Blue层析柱一0-800mM NaCl梯度洗脱一超滤离心，浓缩单抗；3)单抗纯度测定常规SDS-PAGE电泳，上述方法所纯化的单抗的纯度皆在95%以上；4)蛋白浓度测定紫外分光光度计测定279nm处的OD值，按以下公式计算蛋白含量0D279/1.4 = mg/mL(纯化单抗)。将单抗浓度调节为约lmg/mL ；5)单抗活性测定选用BT-Cry IAh抗原包被ELISA板(I μ g/孔)，及羊抗鼠IgG-HRP复合物，测定各单抗效价(大于I : 5000)。3.羊抗DOAt高效价免疫抗血清的制备和纯化I)纯化好的上述单抗+完全佐剂一免疫山羊一加强免疫2次，每次间隔I个月一第二次加强后10天左右取血一离心取血清一(NH4)2SO4沉淀一DEAE离子交换层析纯化；2)效价测定ELISA夹心法，抗体效价稀释度应大于I : 256;3)蛋白浓度测定紫外分光法测定OD279,计算蛋白浓度。4.胶体金及金标抗体制备1)胶体金的制备以柠檬酸盐还原法制备40-60nm的胶体金。将O. 01 % HauCl4加热至沸，加入一定量的I %柠檬酸三钠(Na3C6H5O7 · 2H20)，继续加热煮沸5min，待胶体金溶液颜色由兰一紫一红，稳定后，冷却即可。胶体金溶液应清亮透明，如需长期保存，可加入0. 02% NaN3。2)将胶体金液500mL用O. IM NaOH调pH 84，磁力搅拌下缓慢加入单抗2mL，搅拌20min。5，500Xg离心30min,除去上清液中未结合的蛋白质。离心后吸取胶体金标记抗体沉淀，沉淀溶于IOmL保存液中，用O. 45 μ m微孔滤膜过滤。取样进行检定，其余置4°C保存。5.膜反应体系Ml的制备1)将BT-Cry IAh抗体及纯化的羊抗鼠1gG以0. 1M磷酸盐缓冲液稀释，终浓度为约 0. 2_2mg/mL。2)纯化的羊抗鼠IgG溶于O. IM磷酸盐缓冲液中，浓度为2. Omg/mL ；3)硝酸纤维素膜大小10cmX 27cm，每张膜可喷长25cm的检测及控制带各4条；4)将以上两种溶液分别加入Biodot XYZ3000喷涂机的2个喷头储存瓶中；5)设置喷速为2μ L/cm,NC膜的移行速度为50mm/s。以单抗Cry I AhAD 2 (2mg/mL)在NC膜上包被反应检测线，以I. Omg/mL兔抗鼠IgG包被反应对照线，对照线与检测线的距离为 4_4. 5mm ；6)完成包被后，置37°C干燥箱24h，用BB封闭液封闭处理O. 5h，用WB洗液抽洗I次；7) 37 °C干燥箱干燥备用；8)切制备好的硝酸纤维素膜1. 8cmX27cm/条，放入铝薄袋中密封干燥保存。置
室温保存备用。6.膜反应体系M2a、M2b及M3的制备将吸水纤维膜分别浸泡于M2a、M2b、M3溶液中，浸透后，取出晾干，装入塑料袋中，
室温保存。l)M2a制备将制好的玻璃纤维切27cmX I. 2cm/条；2)M2b制备将制好的玻璃纤维切27cmX I. 8cm/条；3)M3制备将制好的玻璃纤维切27cmX I. 2cm/条。7.膜反应体系M4的制备I)取胶体金-单抗复合物加稀释液，混匀配成工作浓度；2)将溶液加入喷涂机Biodot的Airjet喷头储存瓶中；3)设定压力为15PSI，玻璃纤维膜的移动速度为50mm/s ；4)喷制规格为O. 5-1. 5cmX 25cm/条，每条喷2遍；5)于37°C烘干12h，放入铝薄袋中，加入干燥剂，热合封口，室温保存。8.反应体组装1)在M6塑料基板上贴6条双面胶带M7 ；[0079]2)在M7中间贴反应膜Ml (18mm)，离M6上缘约22_ ；3)在M7上贴M5 (22mm)，与M6上缘对齐并与Ml上缘交1_ ;4)在M7上贴M2a(12mm)，与Ml下缘相接；5)在 M2 上贴 M4 (IOmm)，压住 Ml 下缘 O. 5mm ;6)在 M7 上贴 M3 (12mm),上缘压住 M4 约 2/3 ；7)在M7上贴M2b (18mm)，上缘压住M4约2/3，下缘与M7的下缘对齐；8)在M4和M7上贴透明保护胶带M8，上缘完全压住M4，并压住Ml约I. 5mm ;9)在M5上贴彩色标记胶带M9，与Ml上缘交1mm，另一端翻过M6上缘，贴于M6被面；10)将组装成型的反应体用全自动切条机切成3. 5mm规格。实施例2试剂盒装配将制备好的检测BT-Cry IAc,BT-Cry IAh,BT-Cry 2AB、BT_Cry 9C、BT_Cry 3A 和BT-CryIAa蛋白的六种测试带分别嵌入底板的六个凹槽中，然后将上盖与底板扣紧，即成试剂盒。将试剂盒、滴管和使用说明书装塑料袋封装后，即可。实施例3试剂盒使用过程I.检测样本处理及准备植物种子、叶子、籽苗等样本在检测前需经研磨，并以蒸馏水抽提和稀释。为获得最佳检测效果，各不同样品应根据下表中的比例稀释，在完成研磨和稀释后，将样本混匀，静置，取上清液作为检测样品。
权利要求1.一种组合式抗虫BT蛋白金标快速检测试剂盒，包括底板、上盖，底板盖入上盖后组成试剂盒；其特征是试剂盒形状是扁平的扇面形盒，且底板上放置有4 8个测试带；上盖设置有4 8个观测窗(I)和4 8个加样孔(2)。
2.根据权利要求I所述的组合式抗 虫BT蛋白金标快速检测试剂盒，其特征是所述底板的上表面设置有4 8个可嵌入一条测试带的凹槽。
专利摘要本实用新型涉及一种组合式抗虫BT蛋白金标快速检测试剂盒，本试剂盒由底板、上盖组成；底板内有4～8条测试带；上盖有4～8个观测窗和4～8个加样孔。本试剂盒可一步同时检测多种不同的转基因成份，不需其它任何附加仪器设备。本试剂盒操作简便、检测结果形象、准确、快速只要将送检物品的提取液分别滴加在试剂盒的4～8个加样孔中，5-10min后，通过肉眼就可以通过观测窗直接观察到准确的检测结果。
文档编号G01N33/68GK202676705SQ201220069968
公开日2013年1月16日 申请日期2012年2月28日 优先权日2012年2月28日
发明者张维, 陈明, 滕超, 刘奇, 林敏 申请人:中国农业科学院生物技术研究所