专利名称：检测氟苯尼考和甲砜霉素的试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及ー种检测氟苯尼考和甲砜霉素的试纸，特别是检测牛奶中氟苯尼考和甲砜霉素的试纸。
背景技术：
氟苯尼考、甲砜霉素与氯霉素均属于氯霉素类药物，其中甲砜霉素是氟苯尼考的衍生物，它们的抗菌作用与氯霉素相似。由于氯霉素药物存在严重副作用，国际上相继禁止或严格限制使用氯霉素。氟苯尼考与甲砜霉素均具有较高抗菌活性，现有替代氯霉素的趋势，主要用于治疗鱼、猪、牛及家禽的细菌性疾病，已在养殖业中大規模使用。但是，氟苯尼考和甲砜霉素在畜禽生产上的大量应用也导致其在畜禽产品中残留，危害公众健康。欧盟(EEC)96/23指令中規定，甲砜霉素MRL值为50Pg/kg，氟苯尼考MRL值为5(T2000l^g/kg，我国规定甲砜霉素在各种动物组织中的MRL值为50|ag/kg，氟苯尼考标志残留物为氟苯尼考胺，它在肌肉中MRL值为lOOOPg/kg。动物组织中氯霉素类药物的残留检测主要为理化检测法、免疫分析法。理化检测方法有气相色谱法、气相色谱ー质谱法等，理化检测方法精确度高，但其存在检测成本高，检测设备复杂，对检测人员的要求较高，检测耗时长等缺点；目前常用的免疫学分析法，主要为酶联免疫检测法，其需要的检测费用还是较高，不适合企业低成本的检测需要。
实用新型内容本实用新型的目的提供一种灵敏度高、成本低、操作简单、检测时间短的检测氟苯尼考和甲砜霉素的试纸。本实用新型的试纸包括试纸盒体、具有12个孔的固定用具及放置其中的12个具塞试剂桶，试剂桶包括微孔 试剂条和8个试纸条，微孔试剂条有8个反应孔，反应孔上具有微孔塞，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜等组成，与常规试纸条不同的是，其中的甲砜霉素单克隆抗体-胶体金标记物金不是包被在结合物释放垫上，组装入试纸条，而是冻干在微孔试剂条板孔中。将金标抗体冻干在微孔试剂条中，这样做的好处是在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，増加整个体系的反应灵敏度。所述反应膜上分別包被有甲砜霉素半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“ I ”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹。在反应膜上检测线印迹和质控线印迹组合排列为“I I”。所述的检测线位于距离样品吸收垫ー侧5-8mm，优选6mm，所述质控线位于距离检测线4-7mm，优选5_。所述试纸条覆盖在样品吸收垫上的保护膜上有MAX标记线。本实用新型试纸中试纸条底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜；保护膜为PE材质保护膜；试纸盒体为硬纸盒；试剂桶为塑料试剂桶；固定用具为硬质支撑材料。本实用新型试纸具有如下有益效果:1.灵敏度高。氟苯尼考和甲砜霉素检测试纸以胶体金标记高亲和カ的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华カ相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和カ影响很小，且具有较高的标记率。因此，本实用新型试纸具有较高的特异性和灵敏度。本试纸对氟苯尼考和甲砜霉素的检测限均为 5 V- g/Lo2.操作简便快速。使用试纸检测时无需任何其它试剂，只要将待检样品溶液滴加于微孔试剂中，混匀后，将试纸标有MAX线标记端的试纸条向下，插入孵育后的微孔试剂后计时，5min内观察结果。3.显示检测结果形象、直观准确。检测是试纸条以显示红线色“ I ”及“ Il ”印迹作为阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上显示一条红线“ I ”印迹表示在被检测样本液中氟苯尼考或甲砜霉素的含量高于或等于试纸对氟苯尼考和甲砜霉素的最低检测限，两条红线“ Il ”印迹表示在被检测样本中氟苯尼考或甲砜霉素含量低于试纸对氟苯尼考和甲砜霉素的最低检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现结果误判。4.成本低，投资少。使用本实用新型试纸，不需另配仪器设备及其他试剂，使现场检测一歩到位，成本低廉，投资少，见效快。5.易于大范围推广应用。试纸操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、乳业企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
图1为本实用新型试纸条结构示意图；图2为本实用新型试纸条俯视图；图3为本实用新型微孔试剂图图4为本实用新型试纸条检测结果判定图。图5为本实用新型试剂桶结构示意图；图6为本实用新型固定用具的俯视图；图7为本实用新型盒体与固定用具的侧视图。
具体实施方式
一、氟苯尼考和甲砜霉素检测试纸的组装制备I)、试纸条:样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜依次按顺序黏贴在所述底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，试纸条样品吸收垫上黏贴有保护膜7，保护膜上印有MAX标记线，检测线4包被有甲砜霉素半抗原-载体蛋白偶联物，质控线5包被有羊抗鼠抗抗体。底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水纸，保护膜为PE材质保护膜。2)微孔试剂条微孔试剂条8具有微孔塞9，板孔中冻干有甲砜霉素药物单克隆抗体-胶体金标记物。3)将I)试纸条和2)微孔试剂条装入塑料试剂桶10，将塑料试剂桶放置于试纸盒体12内的固定用具11中。二、试纸的使用待检牛奶样品溶液滴加200 μ I到微孔试剂中，混匀后，将试纸标有MAX线标记端的试纸条向下，插入孵育后的微孔试剂后计，5min内观察结果。三、检测结果分析氟苯尼考和甲砜霉素在样本中的含量高于或等于试纸对其的最低检测限时，甲砜霉素药物单克隆-胶体金标记物与氟苯尼考或甲砜霉素结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测区内因为竞争反应，不会与甲砜霉素半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带。如图4所示。阳性:当质控线(C)显示一条红色条带，而检测线(T)不显色，试纸条以显示红线色“ I ”，判为阳性，如图4.a图所示。阴性:当质控线(C)显示一条红色条带，检测线(T)同时也显示出一条红色条带，且检测线(T)颜色接近或浅于质控线(C)时，试纸条以显示红线色为“ II ”，判为阴性，如图
4.b所示。无效:当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸条判为无效，如图4.c、4.d所示。四、检测试纸中用到的材料制备方法如下:1、甲砜霉素半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定甲砜霉素药物是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。I)甲砜霉素半抗原的制备:0.39g溴乙酸叔丁酯在5ml 二甲基亚砜(DMSO)中的溶液，40°C下缓慢滴加入
0.71g甲砜霉素和Iml吡啶在IOml DMSO中的混合物中。滴加完毕后，继续反应4小时后，蒸除溶剂。简单柱层析分离后，除去溶剂，加入20ml DMSO和5ml甲酸，室温反应20小时，蒸除溶剂，乙醇-水体系中重结晶得到甲砜霉素半抗原。2)免疫原的制备-甲砜霉素半抗原与牛血清白蛋白偶联物合成取甲砜霉素半抗原IOmg溶于Iml水中，得到I液；取牛血清白蛋白50mg溶于5ml水中，再向其中加入碳化二亚胺(EDC) 25mg活化反应30min，得到II液；将I液加到II液后搅拌反应过夜，得到免疫原。3)包被原的制备-甲砜霉素半抗原与卵清蛋白偶联物合成取甲砜霉素半抗原IOmg溶于Iml水中，得到I液；取卵清蛋白50mg溶于5ml水中，再向其中加入EDC 25mg活化反应30min，得到II液；将I液加到II液后搅拌反应过夜，得到包被原。[0047]4)甲砜霉素半抗原-载体偶联物的鉴定将载体蛋白、甲砜霉素半抗原、甲砜霉素半抗原-载体蛋白偶联物用PH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长200-800rim范围内扫描，得到载体蛋白、甲砜霉素半抗原、甲砜霉素半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明甲砜霉素半抗原与载体蛋白偶联成功。2、甲砜霉素药物单克隆抗体的制备(I)制备单抗a.动物免疫将步骤1得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150)^/只，使其产生
抗血清。b.细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞,按9:1 (数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选得到稳定分泌甲砜霉素药物单克隆抗体的甲砜霉素药物单克隆杂交瘤细胞株。经筛选得 到甲砜霉素单克隆抗体交瘤细胞株D-4-1。该杂交瘤细胞株于2012年5月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC N0.6067。该杂交瘤细胞株分泌的抗体针对氟苯尼考和甲砜霉素特异性良好，检测灵敏度能达到5iig/L。c.细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成IX IO9个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。d.单克隆抗体的制备与纯化增量培养法:将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，_20°C保存。所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20% (质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2% (质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.4。3、羊抗鼠抗抗体的制备以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。4、甲砜霉素药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备(I)胶体金的制备用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01% (质量百分含量)，置磁力加热搅拌器上搅拌煮沸，每IOOml 0.01%氯金酸加入2.5 ml 1%柠檬酸三钠，继续搅拌加热反应至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。(2)甲砜霉素药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备在磁力搅拌下,用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7.0,按50-100 ii g抗体/ml胶体金的标准向胶体金溶液中加入上述甲砜霉素药物单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10%牛血清白蛋白至牛血清白蛋白在胶体金溶液中的终浓度为1%(体积百分含量)，静置30min。12000rpm、4°C离心30min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/20的复溶缓冲液将沉淀重悬，得到的甲砜霉素药物单克隆抗体-胶体金标记物溶液的浓度为50 ii g单抗/ml溶液，置4°C备用。复溶缓冲液:含牛血清白蛋白、吐温-80的0.02mol/L、pH7.2的磷酸盐溶液，其中牛血清白蛋白在复溶缓冲液中的终浓度为0.06 0.1% (体积百分含量)，吐温-80在复溶缓冲液中的终浓度为0.05 0.10% (质量百分含量)。5、将甲砜霉素药物单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上向微孔试剂微孔板中加入50 U I甲砜霉素药物单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，冷阱温度为-70°C条件下，预冻4h后，再冻干14h，即可取出，得到冻干有甲砜霉素药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂。6、样品吸收垫的准备将样品吸收垫置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0.5%(体积百分含量))、pH为7.2,0.05mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37°C烘2h备用。7、反应膜的制备包被过程:用磷酸缓冲液将甲砜霉素半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区，包被量为1.0il g/cm2 ;用0.0lmol/L、pH 7.4 PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200 yg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区，包被量为1.0 u g/cm2。将包被好的反应膜置于37°C条件下干燥2h,备用。
权利要求1.一种检测氟苯尼考和甲砜霉素的试纸，其特征在于试纸包括试纸盒体、具有固定用具及放置其中的具塞试剂桶，试剂桶中包括微孔试剂条和试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成。
2.如权利要求1所述的试纸，其特征在于所述反应膜上具有包被有甲砜霉素半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“ I ”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“ I ”。
3.如权利要求2所述的试纸，其特征在于所述检测线和质控线平行。
4.如权利要求1、2或3所述的试纸，其特征在于所述的检测线位于距离样品吸收垫一侧5-8mm，所述质控线位于距离检测线4_7mm。
5.如权利要求1所述的试纸，所述底板可为PVC底板，样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸，吸水垫为吸水纸，反应膜可为硝酸纤维素膜，保护膜为PE材质保护膜。
6.如权利要求1所述的试纸，其特征在于所述试纸盒体为硬纸盒，试剂桶为塑料试剂桶，固定用具是硬质支撑材料。
7.如权利要求1所述的试纸，其特征在于所述微孔试剂条有反应孔，反应孔上具有微孑L塞ο
8.如权利要求7所述的试纸，所述微孔试剂中冻干有甲砜霉素药物单克隆抗体-胶体金标记物。
专利摘要本实用新型提供了一种检测氟苯尼考和甲砜霉素的试纸，试纸包括试纸盒盒体，具有固定用具及放置其中具塞试剂桶，试剂桶中包括微孔试剂条和试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样本吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，甲砜霉素药物单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中。反应膜具有包被有甲砜霉素半抗原－载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体构成质控线。本实用新型试纸具有便携性好，灵敏度高，检测时间短等特点，可以在氟苯尼考和甲砜霉素的试纸残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/577GK202956385SQ201220519389
公开日2013年5月29日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者冯才伟, 孙震, 陶光灿, 杨秀贤, 赵正苗, 罗贵昆, 张荃, 吴小胜 申请人:北京勤邦生物技术有限公司