专利名称：一种新的基于同系/类似化合物结构-质谱响应关系研究的不依赖标准品的定量分析方法
技术领域：
本技术发明属于分析领域，涉及同系/类似化合物的定量分析，特别是复杂基质样品中不存在标准品的化合物的定量分析方法。
背景技术：
在草药、环境、食品和制药等复杂基质研究领域中，多组分同步定量能够揭示其中关键物质或潜在活性化合物的含量，对于整体质量控制和效应/毒性评估非常重要。然而，与定性分析相比，定量分析却要面临更多的问题和挑战。例如现已有许多非靶标分析策略，可不依赖标准品对未知化合物进行结构推测，但对于定量分析而言，由于各化合物的响应各异，标准品的缺乏已成为一个非常大的桎梏；此外，对于定量分析而言，系统的方法学考证也比定性分析的要求更为严格，需要对线性范围、准确度、精密度、稳定性、提取回收率、介质效应等一系列项目进行考察。在复杂体系中，同系/类似化合物往往是有机化合物的主要存在形式，这些化合物可能以整体或协同的形式发挥生物效应。以往的研究中，常以一个或一些现有标准品的且在体系中含量较高的化合物作为评价指标来代表同系化合物进行定量分析、质量评价或进行进一步的药物代谢动力学研究，但该思路存在着明显的局限性，由于一些化合物或代谢产物仍可能在低浓度条件下产生生物效应或毒性反应，因而不能被简单地忽略。近年来，分析仪器特别是高分辨质谱的发展为复杂体系中化合物的分析提供了便利，与此同时，一些半定量或相对定量的方法学也相继被提出，来克服复杂体系定量中标准品难以获得的瓶颈。例如有人提出以同系/系列化合物中一个化合物的标准曲线作为参照，对其余化合物直接或通过分子量校正进行定量；有人先采用一系列化合物，研究其在特定仪器中响应的相对关系，既而在以后的定量中可仅用一个化合物，即可实现这些化合物的绝对定量；也有人提出了 “提取物标准曲线”的概念，评价同系/系列化合物在体内的药代动力学过程。但这些方法终究局限于相对含量的估算，不能够准确外推不存在标准品的化合物的实际浓度，未能真正摆脱标准品的限制。除了分析领域的进展之外，一些计算机辅助的化学信息学策略也已经应用于制药和环境领域的研究，诸如药物先导物的发现，复杂体系中系列化合物构效关系研究等。在这些计算机辅助手段中，应用得较多的主要为分子对接/药效团分析和定量构效关系/结构保留时间关系研究。然而，这些技术在复杂体系系列化合物定量研究中暂无应用实例，其原因可能为化合物定量的影响因素较多，且尚未找到合适的量化指标，用于表征化合物的仪器响应等。本技术发明旨在解决同系/系列化合物定量过程中标准品缺乏的问题。通过选取合适的能表征化合物质谱响应的量化指标，建立化合物内在理化结构性质和质谱响应之间的关系。通过模型的建立和验证，可解释在用质谱对同系/系列化合物定量时对其响应有影响的关键理化参数，预测同系/系列化合物在质谱中的响应，以实现不依赖于标准品的复杂基质中同系/系列化合物的定量。
发明内容
本技术发明的目的是提供一种新的基于同系/类似化合物结构-质谱响应关系研究的不依赖标准品的定量分析方法，通过如下步骤完成1、选取一系列同系/类似化合物进行其质谱定量方法学研究及考证选取尽可能多且简单易得的标准品建立质谱定量方法，确定其定量范围，并对准确度、精密度、稳定性、介质效应、提取回收率等项目进行系统的方法学考证。2、根据在一定浓度范围内建立的各化合物的标准曲线，进行截距为零的线性拟合考虑到化合物的标准曲线包含斜率和截距两项，斜率体现化合物的响应强弱，而截距的存在主要为校正低浓度样品的准确度，在理想情况下化合物的标准曲线应过零点，故进行截距为零的线性拟合，以拟合斜率作为表征化合物响应的指标。3、用分子模拟软件对化合物进行结构优化，计算与其各理化性质相关的分子描述符用分子模拟软件对标准品化合物的结构进行处理，计算其优化构象，并计算在优化构象条件下化合物的理化参数描述符，如分子量、极性、能量、电性等。4、用分子模拟软件进行化合物结构(包括各理化参数描述符、分析条件中与质谱响应相关的参数)与质谱响应(线性拟合标准曲线的斜率)之间关系的建立及验证对于已有的化合物，挑选部分作为训练集，建立化合物结构与质谱响应之间的关系，表现形式可为多元一次回归方程(MLR)、人工神经网络(BNN)等，并用其余的化合物作为预测集，对该方程进行验证。需保证所建立的方程具有较好的拟合度和解释度，所包含的自变量具有一定的实际意义，且需防止方程的过拟合。5、应用相关质谱技术对复杂基质样品进行定性分析，从总离子流图谱中寻找及确定主要的离子峰，并通过准确分子质量、碎裂途径等质谱信息对筛选的该系列化合物进行结构鉴定本技术发明中应用了加拿大ABI公司生产的TripleTOF 5600 (LC/MS-Q-T0F)系统，对中药复方注射剂脉络宁注射液中的有机酸类化合物进行了搜寻及结构鉴定。首先根据该类化合物的特征碎片离子和碎裂途径进行筛选，再根据所筛选出化合物的分子式及碎片信息进行结构鉴定。6、根据先前建立的结构-质谱响应关系方程，计算所鉴定出系列化合物的线性拟合标准曲线的斜率，即预测该系列化合物的标准曲线对所鉴定出的化合物用分子模拟软件进行结构优化，计算分子描述符，并将其代入之前建立的结构-质谱响应关系方程中，计算出其拟合斜率值，得其拟合标准曲线。7、用该系列化合物的拟合标准曲线，对这些化合物进行定量分析，求得其在复杂基质样品中的浓度，即实现不依赖于标准品的定量分析将化合物与内标峰面积的比值代入拟合标曲，求得其估算浓度，若该估算浓度位于之前方法学建立的定量范围内，则该估算具有较高的准确度。本技术发明具有以下优点
1、对于系列同系/类似化合物，能得出对其质谱响应有影响的关键理化参数，可用于化合物质谱响应高低的预估；2、通过已建立的化合物结构与质谱响应之间关系的模型，可对实际不存在标准品的复杂体系中其它同系/类似化合物进行较为准确的定量；3、本发明切实可行，且具有普遍适用性的特点，不局限于复杂基质样品中某特定类别的同系/类似化合物的分析。
图1 ;有机酸标准品(a)、空白辅料制剂(b)、脉络宁注射液(C)在负离子模式下的总离子流色谱图。图2 ;所构建的化合物结构-质谱响应关系中，预测值和实际值之间的比较图。
具体实施例方式实施例1 ;脉络宁注射液中有机酸类成分的定量分析1、选取一系列同系/类似化合物进行其质谱定量方法学研究及考证；选取苯甲酸(Al)、4-甲基苯甲酸(A2)、水杨酸(A3)、3_羟基苯甲酸(A4)、4_羟基苯甲酸(A5)、肉桂酸(A6)、2-羟基-3-甲基苯甲酸(A7)、原儿茶酸(A8)、2，4_ 二羟基苯甲酸(A9)、4-甲基肉桂酸(AlO)、香豆酸(All)、香草酸(A12)、异香草酸(A13)、没食子酸(A14)、4-甲氧基肉桂酸(A15)、2-甲氧基肉桂酸(A16)、咖啡酸(A17)、3，4-二甲氧基苯甲酸(A18)、阿魏酸(A19)、丁香酸(A20)、3，4，5-三甲氧基肉桂酸(A21)、绿原酸(A22)、l，5-二氧咖啡酰奎尼酸(A23)、3，4-二氧咖啡酰奎尼酸(A24)、3，5-二氧咖啡酰奎尼酸(A25)这25个有机酸标准品进行定量方法学建立及考察，内标选取2-羟基马尿酸。运用加拿大ABI公司生产的TripleTOF 5600 (LC/MS-Q-T0F)系统建立系列有机酸的质谱定量方法，并对线性范围、准确度、精密度、稳定性等项目进行方法学考证。有机酸标准品在特定分析条件下的总离子流色谱图见图1 (a)。 2、根据在一定浓度范围内建立的各化合物的标准曲线，进行截距为零的线性拟合；在50ng/ml-10ug/ml浓度的定量范围内，进行截距为零的线性拟合，并考察其定量准确度。结果如表I所示。3、用分子模拟软件对化合物进行结构优化，计算与其各理化性质相关的分子描述符;用Sybyl-X1. 2 (Tripos Inc. , St. Louis, USA)软件对标准品化合物的进行结构处理，计算其优化构象；运用 Discovery Studio 2. 5 (Accelrys Inc.，San Diego, USA)软件计算在优化构象条件下化合物的理化参数描述符，如分子量、极性、能量、电性等。4、用分子模拟软件进行化合物结构(包括各理化参数描述符、分析条件中与质谱响应相关的参数)与质谱响应(线性拟合标准曲线的斜率)之间关系的建立及验证；为了避免拟合斜率出现负值，选取化合物线性拟合标准曲线斜率的自然对数值(LN(Slope Rate))作为表征其质谱响应的量化参数。对于现有的25化合物，挑选其中的20个作为训练集，以多元一次回归方程(MLR)的形式建立了其结构与质谱响应之间的关系，并用其余的5个化合物作为预测集，对该MLR方程进行验证。拟合的结果见表2 (a)、表2(b)和图2。5、应用相关质谱技术对复杂基质样品进行定性分析，从总离子流图谱中寻找及确定主要的离子峰，并通过准确分子质量、碎裂途径等质谱信息对筛选的该系列化合物进行结构鉴定；应用加拿大ABI公司生产的TripleTOF 5600 (LC/MS-Q-T0F)系统，对中药复方注射剂脉络宁注射液中的有机酸类化合物进行了搜寻及结构鉴定，将用甲醇稀释100倍的注射液直接进样，方法同前。空白辅料制剂和脉络宁注射液的总离子流色谱图见图1(b)和1(c)。通过与空白辅料制剂的图谱对比挑选出注射液中的药源性化合物，根据该类化合物的特征碎片离子和碎裂途径进行筛选，挑选出其中的有机酸类化合物，再根据所筛选出化合物的分子式及碎片信息进行进一步的结构鉴定。共从脉络宁注射液中鉴定出34个有机酸类化合物，结果见表3。6、根据先前建立的结构-质谱响应关系方程，计算所鉴定出系列化合物的线性拟合标准曲线的斜率，即预测该系列化合物的标准曲线；对脉络宁注射液中所鉴定出的有机酸类化合物用Sybyl-X1. 2软件进行结构优化，再用Discovery Studio 2. 5软件计算分子描述符,并将其代入之前建立的结构_质谱响应关系方程中，计算出各化合物的拟合斜率值，得其拟合标准曲线。7、用该系列化合物的拟合标准曲线，对这些化合物进行定量分析，求得其在复杂基质样品中的浓度，即实现不依赖于标准品的定量分析；将各有机酸化合物峰面积与内标峰面积的比值代入拟合标曲，求得其估算浓度。对于有标准品的化合物，同时进行绝对定量，并将其绝对定量和用该法定量所得的结果进行比较，结果见表4。从表4可以看出，从脉络宁注射液中所鉴定出的34个化合物，有16个化合物有标准品。通过比较这16个化合物的绝对定量和拟合定量结果发现，该拟合结果具有较高的预测准确度，可对浓度在50ng/ml-10ug/ml范围内的有机酸类化合物进行较为准确的定量。本发明切实可行，具有普遍适用性的特点，也可用于复杂基质样品中其它类别同系/类似化合物的定量分析。表I有机酸标准品化合物拟合标准曲线与原标准曲线的比较J
权利要求
1.一种新的基于同系/类似化合物结构-质谱响应关系研究的不依赖标准品的定量分析方法，其特征在于由如下几个步骤组成a :选取一系列同系/类似化合物进行其质谱定量方法学研究及考证； b :根据在一定浓度范围内建立的各化合物的标准曲线，进行截距为零的线性拟合； c :用分子模拟软件对化合物进行结构优化，计算与其各理化性质相关的分子描述符； d :用分子模拟软件进行化合物结构(包括各理化参数描述符、分析条件中与质谱响应相关的参数)与质谱响应(线性拟合标准曲线的斜率)之间关系的建立及验证；e :应用相关质谱技术对复杂基质样品进行定性分析，从总离子流图谱中寻找及确定主要的离子峰，并通过准确分子质量、碎裂途径等质谱信息对筛选的该系列化合物进行结构鉴定;f :根据先前建立的结构-质谱响应关系方程，计算所鉴定出系列化合物的线性拟合标准曲线的斜率，即预测该系列化合物的标准曲线；g:用该系列化合物的拟合标准曲线，对这些化合物进行定量分析，求得其在复杂基质样品中的浓度，即实现不依赖于标准品的定量分析。
2.如权利要求1a中所述的系列同系/类似化合物，其特征在于具有相似或相同的结构母核或理化性状，如生物碱类化合物、人参皂苷类化合物、多环芳烃类化合物、杀虫剂类化合物等，本技术发明以有机酸类化合物为例进行具体说明。
3.如权利要求1c和Id中所述的分子模拟软件，其特征在于提供分子处理的平台，如实现化合物的能量最小化、定量构效关系分析等功能。
4.如权利要求1d中所述的质谱响应，其特征在于表征化合物在定量分析仪器中响应的强弱，包括标准曲线的斜率及经数学公式计算处理或拟合处理后的斜率，本技术发明使用了线性拟合标准曲线斜率的自然对数为例进行具体说明。
5.如权利要求1e中所述的相关质谱技术，其特征在于能够对样品进行分离及结构解析，包括各种液-质联用、气-质联用等技术，本技术发明使用了加拿大ABI公司生产的 TripleT0F5600 (LC/MS-Q-T0F)系统。
6.如权利要求1e中所述的复杂基质样品，包括且不局限于植物提取物、中草药制剂、 生物样品、环境样品、食品样品等，本技术发明以由金银花、玄参、牛膝、石斛四味药材制备而成的中药复方注射剂脉络宁注射液为例进行具体说明。
全文摘要
本技术发明属于分析领域，涉及同系/类似化合物的定量分析，特别是复杂基质样品中不存在标准品的化合物定量分析。步骤如下1.选取一系列同系/类似化合物进行其质谱定量方法学研究及考证；2.根据在建立的各化合物的标准曲线，进行截距为零的线性拟合；3.用分子模拟软件对化合物进行结构优化，计算相关的分子描述符；4.用分子模拟软件进行化合物结构与质谱响应之间关系的建立及验证；5.应用相关质谱技术对复杂基质样品进行定性分析；6.根据先前建立的结构-质谱响应关系方程，计算所鉴定出系列化合物的线性拟合标准曲线的斜率；7.用该系列化合物的拟合标准曲线，求得其在复杂基质样品中的浓度，即实现不依赖于标准品的定量分析。
文档编号G01N27/62GK103018317SQ20131000000
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月4日 优先权日2013年1月4日
发明者王广基, 郝海平, 吴亮, 龚平, 吴昱铮 申请人:中国药科大学