一种白喉乌头及其炮制品hplc指纹图谱的建立方法及其指纹图谱的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种白喉乌头及其炮制品HPLC指纹图谱的建立方法，包括供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和指纹图谱的制作。本发明白喉乌头及其炮制品HPLC指纹图谱的建立方法可有效的区分各种原碱成分和含量，提供了精准的白喉乌头及其炮制品的质量控制和真伪鉴别方法--HPLC指纹图谱的建立方法。并且，本发明HPLC指纹图谱的建立方法稳定性强，回收率高，较其它方法更适合用于白喉乌头生品及其炮制品的质量控制和真伪鉴别。
【专利说明】一种白喉乌头及其炮制品HPLC指纹图谱的建立方法及其指纹图谱
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种白喉乌头及其炮制品HPLC指纹图谱的建立方法。
【背景技术】
[0002]随着国际国内对中药的研究逐渐提出中药的“国际化” “标准化” “科学化”原则。乌头制剂的研究还多停留在复方制剂水平上，不明确其有效活性成分就无法进一步研究其具体的作用机理，这也是阻碍中药走向世界赢得世界认可的一个重要的瓶颈。
[0003]乌头属植物中主要化学成分为二萜生物碱，是一类结构复杂的多环含氮化合物，因其具有显著的生理活性和较大的毒性，成为人们广泛研究的热点，但研究也多集中在有药典标准的川乌草乌上，对新疆乌头属化学成分的研究尚不深入，白喉乌头作为乌头属药用植物所含毒性成分与川乌草乌药材中双酯型生物碱成分类似。白喉乌头为有毒药用植物，必须经炮制减毒后方可使用，虽然在民间(如新疆哈萨克族)已采用一定的炮制方法减毒，但白喉乌头的炮制方法及其炮制品品的质量控制尚有待深入研究。
[0004]目前关于乌头类植物中生物碱的提取方法报道有很多，提取效率也参差不齐，而且对用HPLC法测定白喉乌头及其炮制品中生物碱的供试品前处理方法并未见到相关详尽的报道。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种新白喉乌头及其炮制品的质量控制和真伪鉴别方法一HPLC指纹图谱的建立方法；
[0006]本发明的另一目的是提供一种可用于白喉乌头及其炮制品的质量控制和真伪鉴另_指纹图谱。
[0007]本发明的目的通过以下技术方案来具体实现:
[0008]一种白喉乌头及其炮制品HPLC指纹图谱的建立方法，包括供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和指纹图谱的制作。
[0009]所述供试品的制备方法为:
[0010]a.取白喉乌头样品粉末加入氨水中密闭浸润后，以95%乙醇溶剂，采用超声方法提取后，再次称定重量并用95%乙醇补足，过滤，滤液60°C以下挥干；
[0011]b.残渣加稀盐酸调节PH在I左右，再加入氨水调pH在10左右，然后用三氯甲烷萃取3次，合并三氯甲烷层并60°C以下挥干，残渣加乙腈中，微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
[0012]优选的，所述步骤a中，所述白喉乌头样品粉末:氨水:95%乙醇为5g:5mL:50mL。
[0013]优选的，所述步骤a中，所述超声方法提取时，提取温度为23°C、超声强度为53KHz、提取 30min。
[0014]优选的，所述步骤b中，所述稀盐酸为1%盐酸溶液。
[0015]所述对照品的制备方法为:[0016]分别取氢溴酸高乌甲素、乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱，用色谱乙腈定容配制成浓度分别为4.lmg/mL、2mg/mL、2.lmg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL 的混合对照品溶液。
[0017]所述指纹图谱的制作方法为:采用高效液相色谱法测定分析供试品溶液，其中，色谱条件为:
[0018]色谱柱:XBridgeTM— C18、250mmX4.6mm、5 μ m 色谱柱；
[0019]填充剂:十八烷基硅烷键合硅胶；
[0020]流动相:乙腈⑶-0.05mol/L醋酸胺⑶；
[0021]洗脱程序:采用梯度洗脱；
[0022]检测波长::235nm；
[0023]流速:1.0ml/min ；
[0024]柱温:30°C
[0025]进样量:10μ L
[0026]优选的，所述流动相中的醋酸胺的PH为7.25，所述梯度洗脱的程序为Omin — 155min — 158min — 160min,乙臆 18% — 31% — 35% — 45%。
[0027]一种白喉乌头及其炮制品HPLC指纹图谱(参见附图1，图中第1、2、3、4、5、6号色谱峰分别依次对应I苯甲酰乌头原碱；2苯甲酰次乌头原碱；3氢溴酸高乌甲素；4未知化合物I ;5新乌头碱；6乌头碱，其中3号峰最强，图谱总长度为160min，平均保留时间t如下:
[0028]I号峰，平均保留时间t为34.1min ;
[0029]2号峰，平均保留时间t为40.7min ;
[0030]3号峰，平均保留时间t为50.4min ；
[0031]4号峰，平均保留时间t为80.8min ;
[0032]5号峰，平均保留时间t为90.0min ；
[0033]6号峰,平均保留时间t为108.6min ；
[0034]白喉乌头3种炮制品(药典法、文献法、哈萨克族法)均有6个特征峰，第1、2、3、4、
5、6号色谱峰分别依次对应I苯甲酰新乌头原碱；2苯甲酰乌头原碱；3苯甲酰次乌头原碱；4氢溴酸高乌甲素；5未知化合物I ;6新乌头碱，其中4号峰最强，图谱总长度为160min，平均保留时间t如下:
[0035]I号峰，平均保留时间t为27.4min ;
[0036]2号峰，平均保留时间t为34.1min ;
[0037]3号峰，平均保留时间t为40.7min ;
[0038]4号峰，平均保留时间t为50.4min ；
[0039]5号峰，平均保留时间t为80.8min ;
[0040]6号峰，平均保留时间t为90.0min ；
[0041]为了进一步说明本发明的实质，发明人针对本发明技术进行了精密度实验、重现性实验、稳定性实验和加样回收实验进行验证。
[0042]一、精密度实验
[0043]取上述混合对照品溶液按照上述色谱条件连续进样6次，计算3种化合物的含量的RSD分别为2.24%U.56%,2.25%，结果显示仪器精密度较高。[0044]二、重现性实验
[0045]精密称取白喉乌头药材6份，按上述方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样，测定氢溴酸高乌甲素、乌头碱、新乌头碱的峰面积，计算氢溴酸高乌甲素的平均含量为
2.7535mg/g，RSD 为 2.06% (η = 6);乌头碱的平均含量为 0.0686mg/g,RSD 为 1.16% (η =6);新乌头碱的平均含量为0.3713mg/g, RSD为2.57% (η = 6)，结果表明本方法的重复性较好。
[0046]三、稳定性实验
[0047]取白喉乌头药材约5g，精密称定，按上述方法制成供试品溶液，按上述色谱条件分别在0，4，8，14，20，24h进样10 μ L，记录色谱峰面积，计算氢溴酸高乌甲素、乌头碱、新乌头碱峰面积的RSD分别为2.77%, 1.61%, 2.08%,结果表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
[0048]四、加样回收实验
[0049]取白喉乌头药材粉末约5g精密称定，按上述方法制成供试品溶液，分别加入3种不同浓度的氢溴酸高乌甲素、乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、混合对照品，按上述色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表1-6。
[0050]表1氢溴酸高乌甲素加样回收率测定结果
【权利要求】
1.一种白喉乌头及其炮制品HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于:包括供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和指纹图谱的制作。
2.根据权利要求1所述的白喉乌头及其炮制品HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于:具体步骤如下:. 1)供试品溶液的制备 a.取白喉乌头样品粉末加入氨水中密闭浸润后，以95%乙醇溶剂，采用超声方法提取后，再次称定重量并用95%乙醇补足，过滤，滤液60°C以下挥干； b.残渣加稀盐酸调节PH在I左右，再加入氨水调pH在10左右，然后用三氯甲烷萃取.3次，合并三氯甲烷层并60°C以下挥干，残渣加乙腈中，微孔滤膜滤过，取续滤液即得； . 2)对照品溶液的制备 分别取氢溴酸高乌甲素、乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱，用色谱乙腈定容配制成浓度分别为4.lmg/mL、2.0mg/mL、2.lmg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL的混合对照品溶液； . 3)指纹图谱的制作 采用高效液相色谱法测定分析供试品溶液，其中，色谱条件为: 色谱柱:XBridgeTM — C18、250 mmX4.6 mm、5 μ m 色谱柱； 填充剂:十八烷基硅烷键合硅胶； 流动相:乙腈(B)-0.05mol/L醋酸胺(D)； 洗脱程序:采用梯度洗脱； 检测波长::235nm ；
流速:1.0ml/min ； 柱温:30°C 进样量:10yL。
3.根据权利要求2所述的白喉乌头及其炮制品HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于:所述步骤I)的步骤a中，所述白喉乌头样品粉末:氨水:95%乙醇为5g:5mL:50mL。
4.根据权利要求2所述的白喉乌头及其炮制品HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于:所述步骤I)的步骤a中，所述超声方法提取时，提取温度为23°C、超声强度为53KHz、提取 30min。
5.根据权利要求2所述的白喉乌头及其炮制品HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于:所述步骤I)的步骤b中，所述稀盐酸为1%盐酸溶液。
6.根据权利要求2所述的白喉乌头及其炮制品HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于:所述步骤3)中，所述流动相中的醋酸胺的PH为7.25，所述梯度洗脱的程序为Omin — 155min — 158min — 160min,乙腈 18% — 31% — 35% — 45%。
7.一种白喉乌头药材HPLC指纹图谱，其特征在于:按照权利要求1-6任一项的方法制作得到白喉乌头药材的标准HPLC指纹图谱，有6个特征峰，其中3号峰最强，图谱总长度为.160min,6个特征峰的平均保留时间t如下: I号峰，平均保留时间t为27.4min，对应化合物为苯甲酰新乌头原碱； . 2号峰，平均保留时间t为40.7min，对应化合物为苯甲酰次乌头原碱； . 3号峰，平均保留时间t为50.4min，对应化合物为氢溴酸高乌甲素；.4号峰，平均保留时间t为80.8min ； .5号峰，平均保留时间t为90.0min，对应化合物为新乌头碱； .6号峰，平均保留时间t为108.6min，对应化合物为乌头碱。
8.一种白喉乌头炮制品HPLC指纹图谱，其特征在于:权利要求1-6任一项的方法制作白喉乌头不同炮制品的HPLC指纹图谱，共有6个特征峰，保留时间分别为27.4min、34.lmin、40.7min、50.4min、80.8min、90.0min,这些特征峰构成白喉乌头炮制品指纹特征。
【文档编号】G01N30/88GK103995080SQ201410254218
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年6月9日 优先权日:2014年6月9日
【发明者】聂继红, 赵翡翠, 王伟 申请人:新疆医科大学附属中医医院