一种对蜂蜜中挥发性成分的萃取的优化方法
【专利摘要】本发明属于测试领域，提出了一种对蜂蜜中挥发性成分萃取的优化方法，包括步骤：1)蜂蜜样品密封在顶空瓶内，用萃取头取样后进行样品的气相色谱分析，2)在单因素试验的基础上，确定Plackett-Burman试验的因素及水平；3)响应曲面试验，以筛选得到的对响应值影响显著的因素作为分析因素，以色谱图总峰面积作为响应值Y；确定顶空固相微萃取的最佳条件。本发明以枣花蜂蜜为实验材料，以气相色谱峰中的总峰面积为考察指标，运用Plackett-Burman设计和响应曲面法对蜂蜜挥发性成分的萃取技术进行优化，优化后萃取效率高，优化模型合理，可为不同蜜源蜂蜜中挥发性成分的进一步定性与定量分析提供一定的方法性指导。
【专利说明】一种对蜂蜜中挥发性成分的萃取的优化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于测试领域，具体涉及一种利用色谱法分析蜂蜜的挥发性组分的方法。
【背景技术】
[0002] 天然蜂蜜具有浓郁的花香气味，且气味特征因蜜源种类而不同，其主要源自花蜜 或蜜露中的挥发性成分，故不同蜜源蜂蜜的挥发性成分可能存在较大差异。因此，精密分析 蜂蜜的挥发性成分可作为鉴别蜂蜜蜜源、产地及质量控制的重要方法。蜂蜜中的挥发性成 分受到多种因素影响，包括蜂蜜的理化特征、储存条件、加工方式和分析方法等。其中，蜂 蜜挥发性成分的分析结果受萃取和鉴定技术的影响较大。挥发性成分的萃取技术包括有 同时蒸馏萃取法、动态顶空萃取法、静态顶空萃取法、超声波辅助萃取法、水蒸馏法、溶剂萃 取法和固相微萃取法等，其中的部分技术可适用于蜂蜜中挥发性成分的萃取。以上方法各 有不足，如水蒸馏法比较耗时，尤其是当研究样品量较大时更为明显；溶剂萃取法中去除溶 剂的过程易造成挥发性成分的损失；同时蒸馏萃取法中的加热程序会导致人工副产物的形 成，如加热会造成蜂蜜中糖分的降解。利用以上技术萃取蜂蜜中的挥发性成分，除上述弊端 夕卜，还应考虑其挥发性成分的浓度非常低，萃取前应尽可能去除蜂蜜中的主要成分一糖的 影响。因此，顶空萃取法显然比较合适，经前人对其进行大量的技术改进，降低了不利状况 的影响，使其萃取物更加接近于蜂蜜挥发性成分组成的真实情况。
[0003] 固相微萃取（Solid phase microextraction，SPME)是一种基于无溶剂样品预处 理的技术，通过注射器内石英纤维表面上的特殊固相涂层，对样品挥发性成分进行萃取和 富集，其操作简单，萃取效率高及选择性强。近年来SPME广泛用于蜂蜜样品中挥发性成分 的分析研究，Kaskoniene 等人通过 HS-SPME (Head space-Solid phase microextraction) 和GC_MS(Gas Chromatograph-Mass Spectrometer)技术分析不同蜜源的蜂蜜样品，对蜂 蜜挥发性成分中93种化合物进行鉴定，得到的化合物包括醇类、酮类、醛类、羧酸类、萜 烯类、烃类、苯和呋喃衍生物等。Jerkovic等人利用HS-SPME法和超声波萃取法对马哈 利搜桃（Prunusmahaleb L )蜂蜜的挥发性成分进行萃取，并经GC-MS技术进行分析，发 现香豆素可作为该种蜜源蜂蜜的潜在生物标志物。由于HS-SPME萃取条件（萃取温度、 萃取时间、样品预处理情况等）不同，对相同材料的分析结果可能差异较大。因此，有必 要针对特定材料对HS-SPME的萃取条件进行优化研究，以期更真实、高效地反映材料中挥 发性成分的组成和含量。前人对蜂蜜挥发性成分的HS-SPME萃取条件进行优化，多采用 改变一个因素的逐因子实验，其只能比较各因素选定水平的优劣，无法提供未考察区域 的信息。Plackett-Burman法可通过较少的实验次数，从众多的影响因子中筛选出主要 因子。Williams将Plackett-Burman试验与随机平衡实验、部分因子实验相比较，认为 Plackett-Burman法在筛选重要实验因子方面较为有效和准确。响应曲面法是一种优秀的 多因素影响实验的优化方法，可以对各研究对象进行全面分析，提供响应面区域内的必要 信息及扩展有限资源，而得到理论上的最优实验条件。
【发明内容】
[0004] 针对本领域现有技术存在的不足之处，本发明的目的是提出一种对蜂蜜中挥发性 成分的萃取的优化方法。
[0005] 实现本发明目的的技术方案为：
[0006] 一种对蜂蜜中挥发性成分的萃取的优化方法，包括步骤：
[0007] 1)蜂蜜样品密封在顶空瓶内，用萃取头取样后与去离子水和NaCl混合，搅 拌后分析样品的气相色谱，以色谱图中总峰面积作为评估条件，通过单因素实验确定 Plackett-Burman试验各因素（萃取温度、萃取时间、样品量、去离子水添加量、NaCl添加 量、搅拌速度）的中点值；
[0008] 2)在单因素试验的基础上，确定Plackett-Burman试验的因素及水平；共6个因 素，分别为萃取温度A、萃取时间B、样品量C、去离子水添加量D、NaCl添加量E、搅拌速度F; 每个因素取2个水平，在中点值上下100%以内浮动，作为高水平+1和低水平-1 ;以色谱图 总峰面积作为响应值Y，筛选得到对其影响显著的因素；
[0009] 3)响应曲面试验，以Plackett-Burman法筛选得到的对响应值影响显著的因素作 为响应曲面法分析的因素，每个因素取2个水平，在中点值上下浮动作为高水平+1和低水 平 -1，以色谱图总峰面积作为响应值Y ;运用Box-Benhnken中心组合试验设计的方法进行 响应曲面分析，确定顶空固相微萃取的最佳条件；
[0010] 其中，步骤1)中，在室温下，将蜂蜜样品密封轻摇IOrnin至均匀状态，用于萃取头 取样。
[0011] 优选地，步骤1)中，萃取温度测试范围为40-80°C，萃取时间测试范围为 20-60min，样品量测试范围与顶空瓶体积的比例为0. 01-0. 5mg :lmL，去离子水添加量的测 试范围为样品量的0-1倍、NaCl添加量的测试范围为为样品量的0-0. 5倍、搅拌速度的测 试范围为300-1000rpm，通过单因素实验确定Plackett-Burman实验各因素（萃取温度、萃 取时间、样品量、去离子水添加量、NaCl添加量、搅拌速度）的中点值。
[0012] 其中，步骤1)中，所述萃取头在取样之前经过老化处理：萃取头在首次使用前，于 气相色谱的进样口进行老化处理，老化温度为270°c，时间为Ih ;老化处理应直至空载时的 色谱图无杂峰。
[0013] 所述萃取头每使用8-10次均进行1次老化处理。
[0014] 其中，所述步骤2)中，因素为萃取温度A、萃取时间B、样品量C、去离子水添加量 D、搅拌速度F时；每个因素取2个水平，在中点值上下25%以内浮动，作为其高水平+1和 低水平-1 ;因素为NaCl添加量E时，在中点值上下100%以内浮动。
[0015] 蜂蜜样品中挥发性成分测定技术中，尚没有人在萃取头取样时添加NaCl。因此本 蜂蜜的优化方法中，在单因素实验中测试了完全不添加NaCl的效果。根据实验结果得知， 添加NaCl能够使挥发性成分更好地被萃取头吸附。本发明提出的优化方法还进一步确定 了 NaCl的适宜加入量。
[0016] 其中，所述步骤3)中，以Plackett-Burman法筛选得到对响应值影响显著的因素 作，每个因素取2个水平低水平（-1)和高水平（+1)，在中点值上下20%以内浮动。
[0017] 其中，所述气相色谱分析方法为：用萃取头取样后，迅速向气相色谱仪进样，250°C 下解吸附5min ;气相色谱使用毛细管色谱柱，初始温度40°C，保持2min，4°C /min升温到 160°C，保持2min，再以KTC /min升至250°C，保持5min ;进样口温度250°C，不分流。
[0018] 气相色谱载气条件可以为：载气为氦气,流速I. 5mL/min，压力10-12psi。
[0019] 步骤2)中，试验设计及数据分析可采用Minitabl6. 0软件辅助完成。
[0020] 步骤3)中，试验设计、数据分析及模型建立可由Design-Expert软件辅助完成。
[0021] 进一步地，步骤3)确定顶空固相微萃取的最佳条件之后，通过Expert-design软 件进一步优化蜂蜜挥发性成分萃取条件，在进一步优化的条件下用响应面模型预测最大总 峰面积；并对优化后的萃取条件进行验证试验。
[0022] 本发明的有益效果在于：
[0023] 本发明基于Plackett-Burman法和响应曲面法相结合，对蜂蜜挥发性成分的顶 空固相微萃取条件进行了优化，以期确定蜂蜜样品挥发性成分的顶空固相微萃取最佳条 件，为其挥发性成分的进一步高效、准确分析提供方法性指导。
[0024] 本发明以单一蜜源蜂蜜为实验材料，以气相色谱峰中的总峰面积为考察指标，运 用Plackett-Burman设计和响应曲面法对蜂蜜挥发性成分的萃取技术进行优化，优化后萃 取效率高，优化模型合理，可为不同蜜源蜂蜜中挥发性成分的进一步定性与定量分析提供 一定的方法性指导。单一蜜源为单独一种主要蜜源植物开花时蜜蜂所采集的蜂蜜（比较纯 正），例如枣花蜂蜜、槐花蜂蜜、油菜蜂蜜等。本发明针对单一蜜源蜂蜜进行萃取技术优化， 符合材料真实情况，结果可信。同样的而优化方法也可用于其他类型的蜂蜜。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为萃取温度对总峰面积的影响关系图。
[0026] 图2为萃取时间对总峰面积的影响关系图。
[0027] 图3为样品量对总峰面积的影响关系图。
[0028] 图4为样品与去离子水质量比对总峰面积的影响关系图。
[0029] 图5为NaCl添加量对总峰面积的影响关系图。
[0030] 图6为搅拌速度对总峰面积的影响关系图。
[0031] 图7a为萃取温度（X1)和萃取时间（X2)对总峰面积的交互影响关系图（二维）； 图7b为萃取温度（X1)和萃取时间（X2)对总峰面积的交互影响关系图（三维）。
[0032] 图8a为萃取温度（Xl)和样品量（X3)对总峰面积的交互影响关系图（二维）；图 8b为萃取温度（Xl)和样品量（X3)对总峰面积的交互影响关系图（三维）。
[0033] 图9a为萃取时间（X2)和样品量（X3)对总峰面积的交互影响关系图（二维）；图 9b为萃取时间（X2)和样品量（X3)对总峰面积的交互影响关系图（三维）。
【具体实施方式】
[0034] 现以以下实施例来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中使用的手 段，如无特别说明，均使用本领域常规的手段。
[0035] 实施例1 :
[0036] 室温下，蜂蜜样品（为枣花蜂蜜，于2014年5月取自山东吕梁市临县）密封轻摇 IOmin至均匀状态，备用；萃取纤维头的老化处理：纤维萃取头在首次使用前，于气相色谱 的进样口进行老化处理，直至空载时的色谱图无杂峰，老化温度为270°C，时间为lh，之后 每使用8-10次均需老化1次；萃取方法：准确称取一定质量的蜂蜜样品，与不同质量的去 离子水进行配比，并加入不同质量的NaCl，置于15mL顶空瓶内，密封，在设定不同搅拌速度 的磁力搅拌器上平衡5min ;然后，将萃取头从顶部插入顶空瓶内大约Icm处，不要接触到样 品，以免污染萃取头的针头，推出萃取头，按照特定的时间和温度进行萃取操作，最后，收回 萃取头，迅速向气相色谱仪进样，250°C下解吸附5min。
[0037] 气相色谱条件：HP-5MS毛细管色谱柱30mX 250 μ m，0. 25 μ m ;初始温度40°C，保持 2min，4°C /min 升温到 160°C，保持 2min，再以 10°C /min 升至 250°C，保持 5min ;进样口温 度250°C ;载气He，流速1.5mL/min，压力11.962psi，不分流。
[0038] 单因素实验：
[0039] (1)萃取温度的确定设定样品量为5g，去离子水添加量为0. 5g，NaCl添加量为 〇. 3g，搅拌速度为650rpm，萃取时间为50min，分别在萃取温度为40、50、60、70、801：的条件 下进行挥发性成分萃取，通过比较色谱图中总峰面积来确定Plackett-Burman试验中点萃 取温度。
[0040] (2)萃取时间的确定设定样品量为5g，去离子水添加量为0. 5g，NaCl添加量为 〇. 3g，搅拌速度为650rpm，萃取温度为60°C，分别在萃取时间为20、30、40、50、60min的条 件下进行挥发性成分萃取，通过比较色谱图中总峰面积来确定Plackett-Burman试验中点 萃取时间。
[0041] (3)样品量的确定设定去离子水添加量为0. 5g，NaCl添加量为0. 3g，搅拌速度为 650rpm，萃取温度为60°C，萃取时间为50min，分别在样品量为2、3、4、5、6g的条件下进行挥 发性成分萃取，通过比较色谱图中总峰面积来确定Plackett-Burman试验中点样品量。
[0042] (4)去离子水添加量的确定设定样品量为5g，NaCl添加量为0. 3g，搅拌速度为 650rpm，萃取温度为60°C，萃取时间为50min，分别在去离子水添加量为0、0. 5、1、2. 5、5g的 条件下进行挥发性成分萃取，通过比较色谱图中总峰面积来确定Plackett-Burman试验中 点去尚子水添加量。
[0043] (5)NaCl添加量的确定设定样品量为5g，去离子水添加量为0. 5g，搅拌速度为 650rpm，萃取温度为60°C，萃取时间为50min，分别在NaCl添加量为0、0· 3、0· 6、0· 9、L 2g 的条件下进行挥发性成分萃取，通过比较色谱图中总峰面积来确定Plackett-Burman试验 中点NaCl添加量。
[0044] (6)搅拌速度的确定设定样品量为5g，去离子水添加量为0. 5g，NaCl添加量为 〇. 3g，萃取温度为60°C，萃取时间为50min，分别在搅拌速度为350、500、650、800、950印111的 条件下进行挥发性成分萃取，通过比较色谱图中总峰面积来确定Plackett-Burman试验中 点搅拌速度。
[0045] 通过单因素实验确定Plackett-Burman试验中的各因素的中点值。由图1可以 看出，总峰面积随着萃取温度的变化趋势较为平缓，其在萃取温度为60°C时达到峰值，其余 萃取温度条件下，总峰面积稍低。基于此，Plackett-Burman实验中拟选用的中点萃取温度 为60°C。由图2可以看出，总峰面积随萃取时间的变化总体呈先增加后减少的趋势，其于 萃取时间为50min时达到峰值。所以，Plackett-Burman试验中拟选用的中点萃取时间为 50min。由图3可以看出，总峰面积随样品量的增加而先增大后变小，其在样品量为5g时 达到峰值，故Plackett-Burman试验中拟选用的样品量为5g。由图4可以看出，总峰面积 随去离子水添加量的增加而先增大后变小，当去离子水添加量为0. 5g时，总峰面积达到峰 值。所以，Plackett-Burman试验中拟选用的中点去离子水添加量为0. 5g。由图5可以看 出，当NaCl的添加量在0-1. 2g范围内变化时，总峰面积的变化趋势存在一定的起伏，但其 在NaCl添加量为0. 3g时达到最大。所以，Plackett-Burman试验中的中点NaCl添加量为 0. 3g。由图6可以看出，总峰面积在搅拌速度为650rpm和950rpm时均较大，但考虑到搅拌 速度为950rpm时易造成HS-SPME装置稳定性变差，故Plackett-Burman试验中的中点搅拌 速度为650rpm。
[0046] 实施例2 :
[0047] 样品处理方法和气相色谱条件同实施例1。
[0048] 在单因素试验的基础上，确定Plackett-Burman试验的因素及水平。共6个因素， 分别为萃取温度（A)、萃取时间（B)、样品量（C)、去离子水添加量（D)、NaCl添加量（E)、搅 拌速度（F)。每个因素取2个水平，即低水平（-1)和高水平（+1)。因素为萃取温度A、萃取 时间B、样品量C、去离子水添加量D、搅拌速度F时；每个因素取2个水平，分别在中点值上 下浮动17%、20%、20%、20%、23%，即为高水平+l和低水平-l因素为NaCl添加量E时， 在中点值上下浮动100%。
[0049] 以色谱图总峰面积作为响应值Y，筛选得到对其影响显著的因素。试验设计及数据 分析采用Minitabl6. 0软件辅助完成。
[0050] 以单因素试验结果为基础，确定Plackett-Burman试验设计的因素和水平，具体 见表1。由于峰个数和主要挥发性物质峰面积的变化与总峰面积的变化基本保持一致，只是 在个别物质略有差异，因此可以以总峰面积为判定指标即响应值Y来分析蜂蜜中香气物 质的萃取效果从而筛选得到对其影响显著的因素。
[0051] 表IPlackett-Burman试验设计及相应值
[0052]
【权利要求】
1. 一种对蜂蜜中挥发性成分的萃取的优化方法，其特征在于，包括步骤： 1) 蜂蜜样品与不同量的去离子水和NaCl混合，并被密封在顶空瓶内，用萃取头 取样后进行气相色谱分析，以色谱图中总峰面积作为评估条件，通过单因素实验确定 P1 ackett-Burman试验的各因素的中点值，包括萃取温度、萃取时间、样品量、去离子水添加 量、NaCl添加量和搅拌速度； 2) 在单因素试验的基础上，确定Plackett-Burman试验的因素及水平；共6个因素，分 别为萃取温度A、萃取时间B、样品量C、去离子水添加量D、NaCl添加量E、搅拌速度F ;每个 因素取2个水平，即在中点值上下100%以内浮动，分别为高水平+1和低水平-1 ;以色谱图 总峰面积作为响应值Y，筛选得到对其影响显著的因素； 3) 响应曲面试验，以Plackett-Burman法筛选得到的对响应值影响显著的因素作为响 应曲面实验分析的因素，每个因素取2个水平，即低水平-1和高水平+1，以色谱图总峰面积 作为响应值Y ;运用Box-Benhnken中心组合试验设计的方法进行响应曲面分析，确定顶空 固相微萃取的最佳条件。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1)中，在室温下，将蜂蜜样品密 封轻摇lOmin至均匀状态，用于萃取头取样。
3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1)中，萃取温度测试范围 为40-80°C，萃取时间测试范围为20-60min，样品量测试范围与顶空瓶体积的比例为 0. 01-0. 5mg :lmL，去离子水添加量的测试范围为样品量的0-1倍、NaCl添加量的测试范 围为为样品量的〇_〇. 5倍、搅拌速度的测试范围为300-1000rpm，通过单因素实验确定 Plackett-Burman试验各因素的中点值。
4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述萃取头在取样之 前经过老化处理：萃取头在首次使用前，于气相色谱的进样口进行老化处理，老化温度为 270°C，时间为lh ; 所述萃取头每使用8-10次均进行1次老化处理。
5. 根据权利要求1-4任一所述的优化方法，其特征在于，所述步骤2)中，因素为萃取温 度A、萃取时间B、样品量C、去离子水添加量D、搅拌速度F ;每个因素取2个水平，在中点值 上下25%以内浮动，即低水平-1和高水平+1 ;因素为NaCl添加量E，在中点值上下100% 以内浮动。
6. 根据权利要求1-4任一所述的优化方法，其特征在于，所述步骤3)中，以 Plackett-Burman法筛选得到对响应值影响显著的因素，每个因素取2个水平低水平（-1) 和高水平（+1)，在中点值上下20%以内浮动。
7. 根据权利要求1-4任一所述的优化方法，其特征在于，所述气相色谱分析方法为：用萃取头取样后，迅速向气相色谱仪进样，250°C下解吸附5min;气相色谱使用毛细管色 谱柱，初始温度40°C，保持2min，4°C /min升温到160°C，保持2min，再以10°C /min升至 250°C，保持5min ;进样口温度250°C ;不分流。
8. 根据权利要求1-4任一所述的优化方法，其特征在于，步骤3)确定顶空固相微萃取 的最佳条件之后，用该响应曲面模型预测最大总峰面积；并应采用优化后的萃取条件进行 验证试验。
【文档编号】G01N30/88GK104391066SQ201410572993
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月23日 优先权日:2014年10月23日
【发明者】彭文君, 任佳淼, 赵亚周, 田文礼, 方小明, 国占宝 申请人:中国农业科学院蜜蜂研究所