盐酸克仑特罗荧光微球免疫层析试纸条的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种盐酸克仑特罗荧光微球免疫层析试纸条。试纸条包括底板及附着在底板上依次紧密相连的样品结合垫、层析膜、吸水垫，其中在层析膜上有用偶联盐酸克仑特罗的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹和用羊抗鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“‖”，样品结合垫上包埋有荧光微球标记的抗盐酸克仑特罗单克隆抗体。试纸条具有灵敏度高、检测快速、操作方便、经济实用等优点，可用于盐酸克仑特罗残留的检测。
【专利说明】 盐酸克仑特罗荧光微球免疫层析试纸条
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种检测兽药的器具，特别是涉及一种盐酸克仑特罗荧光微球免疫层析试纸条。
【背景技术】
[0002]克仑特罗(Clebuterol，CL)是一种属于苯胺类的β -受体激动剂，主要以盐酸盐形式存在，具有重新分配机体营养、抑制脂肪沉积、提高蛋白质含量、增加酮体瘦肉率、改善肉质以及促进动物生长的作用。因此，近年来在经济利益的驱使下，大量克仑特罗被滥用于畜牧业和养殖业。人体摄入CL的量过大时，会导致一系列不良反应，主要有肌肉震颤、心跳和呼吸加快等，严重的会危害生命。鉴于此，许多国家已经禁止将克仑特罗作为饲料及饲料添加剂使用，我国农业部也于2002年明确将其列入《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》。
[0003]目前，检测盐酸克仑特罗比较经典的方法有高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS )、气相色谱-质谱联用法(GC-MS )、高效液相色谱法(HPLC)，这些都是比较传统的方法，也是目前的确证方法。另外，目前常用的还有酶联免疫法(ELISA)。但由于以上方法均需先进检测仪器，检测费用昂贵、步骤繁琐耗时，且对操作人员专业性要求较高，不适用于基层企事业单位的大通量快速筛查检测。胶体金免疫层析法具有检测速度快、价格便宜、操作简单等优点，是目前国内外检测盐酸克仑特罗的主要监控方法，但仍存在一些缺陷，如稳定性较差、灵敏度较低、无法实现定量检测、基质效应明显背景干扰大，且颜色单一，难以实现多检和联检。
[0004]荧光微球免疫层析技术是继胶体金免疫层析技术后，在荧光染料标记技术上发展起来的，作为一种免疫学检测方法，它是免疫亲和技术、免疫标记技术、免疫层析技术的结合，与胶体金免疫层析技术一样具有快速、操作简便等优点。但是相比胶体金等传统标记物，荧光微球的发光强度可以随激发光的强度增强而增强，所以荧光微球标记有望提高免疫层析技术的检测限；而在微球壳结构的作用下，荧光微球具有相对稳定的形态结构，粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好，有较好的生物相容性；且形成微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，且基本不受外界环境介质变化的影响。因此相比上述检测方法，荧光微球免疫层析技术同时具有检测灵敏度高、操作简便、稳定性好的优点。
实用新型内容
[0005]本实用新型的目的是提供一种灵敏度高、操作简便、检测快速、价格低廉的盐酸克仑特罗荧光微球免疫层析试纸条。
[0006]本实用新型的技术方案:
[0007]—种盐酸克仑特罗荧光微球免疫层析试纸条，包括底板及附着在底板上依次紧密相连的样品结合垫、层析膜、吸水垫，层析膜上有用偶联盐酸克仑特罗的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹和用羊抗鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“ Il ”，检测印迹位于靠近样品结合垫的末端的一侧，对照印迹位于远离样品结合垫的末端的一侧。
[0008]底板是用不吸水的硬质塑胶条或硬纸条制成。
[0009]样品结合垫用包埋盐酸克仑特罗荧光微球标记抗体的玻璃棉制成，盐酸克仑特罗荧光微球标记抗体为荧光微球标记的抗盐酸克仑特罗单克隆抗体。
[0010]层析膜用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。
[0011]吸水垫用吸水纸制成。
[0012]本实用新型的盐酸克仑特罗荧光微球免疫层析试纸条具有以下优点:
[0013](I)特异性强、灵敏度高。该试纸条采用将荧光微球标记的抗盐酸克仑特罗单克隆抗体包埋在样品结合垫上，具有亲水性佳、可大容量吸附抗体偶联物、迅速重湿润、抗体结合物释放充分、性能好、释放快、形态好等优势，从而减少误差，降低成本，增加整个体系的反应灵敏度。因此，本实用新型试纸条具有较高的特异性和灵敏度，对盐酸克仑特罗的检测灵敏度为I μ g/L。
[0014](2)操作简便、快速。使用试纸条检测时无需任何其它试剂，只需吸取待检样本溶液约100 μ L垂直滴加于样品结合垫上，液体流动时开始计时，反应lOmin，用荧光检测仪分析检测结果。
[0015](3)成本低、投资少。使用本实用新型试纸条，可随时随地进行检测，费用低廉，节省了大量贵重仪器及设备费用。
[0016](4)应用范围广，便于推广应用。试纸条操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为本实用新型试纸条结构示意图。
[0018]图2为本实用新型试纸卡结构示意图。
【具体实施方式】
[0019]一、盐酸克仑特罗荧光微球免疫层析试纸条的结构(图1)
[0020]图中I为包埋有盐酸克仑特罗荧光微球标记抗体的样品结合垫，用玻璃棉制成，2为层析膜，采用硝酸纤维素膜，3为吸水垫，用吸水纸制成，6为底板，用硬质塑胶条制成，将编号1、2、3各层从左至右依次粘贴固定在底板6上，样品结合垫I的末端与层析膜2的始端相连，层析膜2的末端与吸水垫3的始端相连，样品结合垫I的始端与底板6的始端对齐，吸水垫3的末端与底板6的末端对齐。在层析膜2上，4为用偶联盐酸克仑特罗的载体蛋白溶液印上检测印迹“ I ”，5为用羊抗鼠IgG溶液印上对照印迹“ I ”，两印记平行排列形成组合印迹带“ Il ”。
[0021]二、盐酸克仑特罗荧光微球免疫层析试纸条的制备
[0022]制备盐酸克仑特罗荧光微球免疫层析试纸条，首先需制备偶联盐酸克仑特罗的载体蛋白和荧光微球标记的抗盐酸克仑特罗单克隆抗体，从而制备检测印迹和样品结合垫；其次需制备羊抗鼠IgG抗体，用于制备对照印迹。以下是相关材料的制备方法:[0023]1、盐酸克仑特罗半抗原的制备
[0024](I)取1.4g盐酸克仑特罗，溶入25mL 二甲基甲酰胺(DMF)中，(TC下分3次加入1.Sg氯铬酸吡啶(PCC)，逐步升温到室温，继续反应3h后，除去大部分溶剂，乙酸乙酯萃取，洗涤，干燥，除去溶剂后柱层析纯化，得到白色固体，为盐酸克仑特罗氧化物；
[0025](2)取1.0g步骤(I)所得的盐酸克仑特罗氧化物，溶入20mL DMF中，加入ImL丙二胺，60°C反应10h，除去溶剂，乙醇-水中重结晶，得到白色固体，为盐酸克仑特罗的丙二胺单缩合物，即为盐酸克仑特罗半抗原，经核磁共振氢谱实验鉴定，结构正确。
[0026]2、盐酸克仑特罗半抗原与载体蛋白的偶联
[0027]将盐酸克仑特罗半抗原与牛血清白蛋白(BSA)采用活泼酯法进行偶联制备免疫原。
[0028](I)取 BSA50mg 用 4mL 水溶解；
[0029](2)取碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)各50mg用2mL水溶解完全后加入蛋白溶液中，室温揽祥反应30min ；
[0030](3)取半抗原15mg用2mL DMF溶解后，缓慢加入到步骤(2)所得的溶液中，室温搅拌反应24h ；
[0031](4)将经步骤(3)反应后的溶液装于透析袋，在4°C用0.02mol/L的PBS溶液透析3天，期间每天换透析液3次，即得到目的产物，分装后_20°C保存。
[0032]将盐酸克仑特罗半抗原与卵清蛋白(OVA)采用同样的方法进行偶联制备包被原。
[0033]3、抗盐酸克仑特罗单克隆抗体的制备
[0034](I)动物免疫:将免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150 μ g/只，使其产生
抗血清。
[0035](2)细胞融合和克隆化:取产生特异性抗体的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP20融合，采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0036](3)细胞冻存和复苏:取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
[0037](4)单克隆抗体的制备与纯化:采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油，7?14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7?10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，纯度经SDS-PAGE电泳鉴定，小瓶分装，_20°C保存。
[0038]4、荧光微球标记的抗盐酸克仑特罗单克隆抗体的制备
[0039](I)活化:取市售的内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液100 μ L混悬于900 μ L活化缓冲液中，于4°C 10000r/min离心IOmin后弃上清，重悬微球于ImL活化缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入适量活化剂，混匀后室温振荡活化IOmin ；
[0040](2)偶联:将(I)所述混悬液于4°C 10000r/min离心IOmin后弃上清，重悬于偶联缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入10?20 μ L抗盐酸克仑特罗单克隆抗体溶液(蛋白浓度lmg/mL),混勻后室温振荡偶联120min ；
[0041](3)封闭:将(2)所述混悬液于4°C 10000r/min离心IOmin后弃上清，重悬于封闭缓冲液中，以此法洗涤微球I次，混匀后室温振荡封闭30min ；[0042](4)贮存:将(3)所述混悬液于4°C 10000r/min离心IOmin后弃上清，重悬于贮存缓冲液中，以此法洗涤微球I次，混匀后于4°C避光保存。
[0043]所述活化缓冲液为ρΗ5.5?6.5、0.05mol/L的2_(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液。
[0044]所述活化剂为水溶性碳二亚胺，其中摩尔质量比EDC: NHS: C00H=(1.5?3): (8?20): 1，临用前用活化缓冲液稀释至所需浓度。
[0045]所述偶联缓冲液为pH7.5?8.5,0.05mol/L的硼酸盐缓冲液(避免使用存在游离胺的溶剂)。
[0046]所述封闭缓冲液为含0.1?0.4mol/L伯胺(盐酸羟胺、乙醇胺或氨基乙醇)、1%?10%BSA的ρΗ7.4的PB缓冲液。
[0047]所述贮存缓冲液为含0.03%Proclin300、0.1%BSA的ρΗ7.4的PB缓冲液。
[0048]5、样品结合垫的制备
[0049](I)将样品结合垫用含牛血清白蛋白(BSA在缓冲体系中的终浓度为0.5%体积百分含量)、pH7.2,0.lmol/L的磷酸盐缓冲液均匀浸泡2h，37°C下烘干2h ；
[0050](2)将贮存的荧光微球标记的抗盐酸克仑特罗单克隆抗体以贮存缓冲液稀释后，将(I)处理过的样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后备用。
[0051]6、羊抗鼠IgG的制备
[0052]以山羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠IgG，用于盐酸克仑特罗荧光微球免疫层析试纸条对照印迹的制备。
[0053]7、层析膜的制备
[0054]用0.05mol/L、pH7.2的PBS缓冲液将包被原(盐酸克仑特罗半抗原_卵清蛋白偶联物)稀释到100μ g/mL，用Isoflow点膜仪将其喷涂于层析膜上的检测印迹(T)，喷膜量为
1.0 μ L/cm ;用 0.01mol/L、pH7.4 的 PBS 缓冲液将羊抗鼠 IgG 稀释到 200 μ g/mL，用 Isoflow点膜仪将其喷涂于层析膜上的对照印迹(C)，喷膜量为1.0 μ L/cm。将制备好的层析膜置于37°C条件下干燥16h，备用。
[0055]8、试纸条的组装
[0056]将样品结合垫、层析膜、吸水垫从左至右依次粘贴固定在底板上，样品结合垫的末端与层析膜的始端相连，层析膜的末端与吸水垫的始端相连，样品结合垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，然后用机器切成3.96mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸卡(图2)。盐酸克仑特罗荧光微球免疫层析试纸卡在2?8°C阴凉避光干燥处保存，有效期为12个月。
[0057]三、盐酸克仑特罗荧光微球免疫层析试纸条的应用
[0058]1、样品前处理
[0059]( I)尿液样本
[0060]取清亮尿液样本直接测定，样本必须收集在洁净干燥、不含任何防腐剂的塑料尿杯或玻璃容器中；若不能及时送检，在2?8°C冷藏可保存24h，若长期保存需置于-20°C冷冻，切忌反复冻融。
[0061 ] (2)动物组织样本
[0062] 取已去脂肪的动物组织样本于均质器中10000r/min均质Imin ;称取2.0g±0.05g均质好的组织样本至4mL聚苯乙烯离心管中，加入500 μ L样本提取液(0.35mol/L的PB缓冲液)，润动Imin ;放入80°C水浴锅中水浴IOmin后，4000r/min离心5min,冷却至室温,待检。
[0063]2、操作步骤
[0064]吸取100 μ L待检样本溶液垂直滴加于试纸卡加样孔中，液体流动时开始计时,反应IOmin ;将试纸卡插入KFT-100A型荧光检测仪的承载器中，通过触摸显示屏选择待检项目，按下“开始检测”按键，荧光检测仪将自动对试纸卡进行扫描测试；通过仪器的显示屏幕上读取或打印检测结果。
[0065]3、结果判读
[0066]测试完成后，仪器将根据检测得到的荧光信号的强弱，自动计算出尿液、动物组织样本中盐酸克仑特罗的浓度值，并根据预设的阈值给出阴阳性判断。
[0067]阴性(一):若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阴性，表示样本中不含有盐酸克仑特罗或其浓度低于检测限。
[0068]阳性( + ):若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阳性，表示样本中盐酸克仑特罗浓度等于或高于检测限。
[0069]无效:若质控线未检出荧光信号强度，表明不正确的操作过程或试纸卡已失效。
【权利要求】
1.一种盐酸克仑特罗荧光微球免疫层析试纸条，包括底板及附着在底板上依次紧密相连的样品结合垫、层析膜、吸水垫，其特征在于:层析膜上有用偶联盐酸克仑特罗的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹和用羊抗鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“ Il ”。
2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于:检测印迹位于靠近样品结合垫的末端的一侧，对照印迹位于远离样品结合垫的末端的一侧。
3.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于:底板是用不吸水的硬质塑胶条或硬纸条制成。
4.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于:样品结合垫用包埋盐酸克仑特罗荧光微球标记抗体的玻璃棉制成，盐酸克仑特罗突光微球标记抗体为突光微球标记的抗盐酸克仑特罗单克隆抗体。
5.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于:层析膜用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。
6.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于:吸水垫用吸水纸制成。
【文档编号】G01N33/543GK203720183SQ201420067384
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年2月15日 优先权日:2014年2月15日
【发明者】冯才伟, 何方洋, 赵正苗, 刘玉梅, 崔廷婷, 王建霞, 李勇, 刘叶 申请人:北京勤邦生物技术有限公司