一种利用离子液体萃取/HPLC检测昆明山海棠根茎中雷公藤次碱含量的方法与流程

本发明涉及中药材活性成分检测领域，尤其涉及一种利用离子液体萃取/HPLC检测昆明山海棠根茎中雷公藤次碱含量的方法。

背景技术：

雷公藤次碱(wilforine)为昆明山海棠(Tripterygium hypoglaucum(Levl.)Hutch)根茎中的药用活性成分之一,属于倍半萜大环内酯类生物碱，为雷公藤生物碱类物质中的一种。研究表明雷公藤生物碱类物质普遍在治疗类风湿性关节炎方面有效率较高，同时还有抗肿瘤、抗雄性生育的作用，其中有些生物碱单体具有明显的抗免疫抑制、抗肿瘤作用以及较小毒性的特点，例如雷公藤次碱有明显的体液免疫抑制作用，雷公藤康碱(wilfordconine)对白血病细胞有很好的抑制效果。因此，从中药质量控制的角度出发,需要在昆明山海棠制剂的生产中检测昆明山海棠原料中的雷公藤次碱含量。

目前，雷公藤生物碱的分析检测方法较多,如荧光法、电化学法、蒸发光散射法等，尤其是LC/MS联用技术的应用，增强了对生物碱的定性检测能力，提高了检测灵敏度，近年的文献报道也日渐增多,例如雷公藤口服液中总生物碱的紫外分光光度法检测，高效液相色谱法分离测定雷公藤根皮中的雷公藤次碱，也有文献采用毛细管电泳色谱分离法测定雷公藤次碱，又如申请号为201410402202.9(申请公布号为CN 104407081 A)的中国发明专利《一种蜂蜜中雷公藤次碱的检测方法》。然而，上述方法均存在一些问题，主要问题在于针对昆明山海棠根茎原料中的生物碱含量检测所采用的前处理方法大都是回流提取，浸提等手段，因此对于含量较低或基体相对复杂的昆明山海棠根茎原料样品，这些方法难以满足实际检测工作的需求，如何快速、高效的提取药材中的生物碱并进行含量分析，需要建立一种可行的有效的分析方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种萃取效率高，检测快速、准确的利用离子液体萃取/HPLC检测昆明山海棠根茎中雷公藤次碱含量的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种利用离子液体萃取/HPLC检测昆明山海棠根茎中雷公藤次碱的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)样品萃取：称取昆明山海棠粉末样品放入带有搅拌子的容器中，加入固液比为1:20～60的离子液体溶液，200～600w微波功率下微波辅助提取1～9min，提取1～3次；

(2)检测：采用HPLC进行检测，HPLC色谱条件为：采用Kromasil ODS-C18柱(4mm×250mm,5um)；流动相为乙腈-水；流速为0.3～0.5ml/min；检测波长为275nm；柱温为25℃。

离子液体是由一种含氮杂环的有机阳离子和一种无机阴离子组成的盐，在室温或室温附近温度下呈液态，又称为温室离子液体、室温熔融盐、有机离子液体等，本发明中所述离子液体溶液由体积比为1:3～9的离子液体和甲醇混合而成，所述离子液体为[Bmim]Br(溴化3-甲基-1-丁基咪唑)、[Bmim]BF₄(1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐)、[Bmim]PF₆(1-丁基-3-甲基咪唑六氟硼酸盐)、[Hmim]Br(溴化1-已基-3甲基咪唑)、[Hmim]BF₄(1-已基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐)和[Hmim]PF₆(1-已基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐)中的至少一种。

与甲醇做萃取溶液相比，离子液体的加入明显影响荷叶中荷叶碱的萃取效果，但影响的大小与离子液体的种类有关。离子液体溶液所具有的强萃取能力与其自身的性质有关，一方面，离子液体具有多种分子作用力和强的溶解能力，尤其是氢键作用力、极性作用力、离子电荷作用力等，这些作用有助于雷公藤次碱在离子液体溶液中溶解，从而使雷公藤次碱从雷公藤根茎中能有效地被萃取出来；另一方面，离子液体是由有机阳离子和有机或无机阴离子组成的有机盐，对微波具有强的吸收和转化能力团，能有效提高离子液体溶液对微波的吸收和转化，使溶剂和样品迅速升温，因此，所述离子液体溶液中的离子液体为[Bmim]BF₄，且[Bmim]BF₄与甲醇的体积比为1:9。

作为优选，所述步骤(1)中昆明山海棠粉末样品与离子液体溶液的固液比为1:50。

作为优选，所述步骤(1)中微波功率为400w，提取时间为5min，提取温度为60℃，提取一次。

作为优选，所述步骤(2)中的流动相中乙腈-水体积比为20:80，流速为0.3ml/min。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明中利用离子液体与甲醇混合形成离子液体溶液作为萃取剂，结合微波辅助提取，避免了雷公藤次碱提取中目标产物分解、提取率较低的问题，从而获得较高的萃取效率，结合HPLC检测技术，结果显示雷公藤次碱在20～100μg/mL的范围内呈良好的线性关系，加标回收率在88.7％～93.0％之间，该方法操作简单、萃取效率高、检测快速准确，可实现快速高效检测昆明山海棠根茎中雷公藤次碱的含量。

附图说明

图1为实施例1的1-2中雷公藤次碱标准曲线图；

图2为实施例1的1-2中雷公藤次碱标准品HPLC图谱；

图3为实施例2的2-1中不同离子液体溶液对雷公藤次碱萃取效果的影响；

图4为实施例2的2-1中[Bmim]BF₄离子液体溶液的HPLC图谱；

图5为实施例2的2-2中离子液体浓度对雷公藤次碱萃取率的影响；

图6为实施例2的2-3中不同微波功率对雷公藤次碱萃取率的影响；

图7为实施例2的2-4中萃取时间对雷公藤次碱萃取率的影响；

图8为实施例2的2-5中液固比对雷公藤次碱萃取率的影响；

图9为实施例2的2-6中提取次数对雷公藤次碱萃取率的影响。

具体实施方式

以下结合附图实施例对发明作进一步详细描述。

实施例1：检测条件

1-1、HPLC色谱条件

HPLC色谱条件为：采用Kromasil ODS-C₁₈柱(4mm×250mm,5um)，流动相为乙腈-水(20:80)，每100ml加0.2ml磷酸；流速：0.3mL/min；检测波长：275nm；柱温：25℃。

1-2、标准曲线的制备

精密量取雷公藤次碱标准品(中国药检所)10mg，定容在10ml的容量瓶中备用，在分别配置成浓度为0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.1mg/ml雷公藤次碱标准品溶液，采用HPLC法测定昆明山海棠中昆明山海棠碱含量。以峰面积为纵坐标，雷公藤次碱浓度为横坐标制作标准曲线。如图1所示，雷公藤次碱在20-100μg/mL的范围内呈良好的线性关系，回归方程为：y＝39111x-21.09，R²＝0.9996，雷公藤次碱标准品HPLC图谱如图2所示。

实施例2：样品萃取

精确称取1.0g昆明山海棠粉末样品(购于中药店)置于圆底烧瓶中，接着加入离子液体溶液，放入搅拌子，在70℃(微波功率400w～600w时萃取液温度平衡70℃左右)于时下微波辅助提取。

2-1、离子液体种类的选择

采用V_离子液体/V_甲醇(1/9)的[Bmin]Br、[Bmim]BF₄、[Bmim]PF₆、[Hmim]Br、[Hmim]BF₄、[Hmim]PF₆6种离子液体溶液为萃取溶液，昆明山海棠粉末样品与上述萃取溶液的固液比为1:30，在微波功率为400w下微波辅助提取10min，各实验组所得的提取溶液定容在100ml的容量瓶中检测，结果如图3所示。

从图3可知，[Bmim]BF₄对雷公藤次碱的萃取效果优于其他五种离子液体，具体地：对具有相同阳离子结构的[Bmim]Br、[Bmim]BF₄、[Bmim]PF₆和[Hmim]Br、[Hmim]BF₄、[Hmim]PF₆两对离子液体来说，它们的萃取率却不同，[Bmim]BF₄比[Bmim]Br增高了4.2％，比[Bmim]PF₆增高了19.9％；对具有相同阴离子结构的[Bmim]Br、[Hmim]Br和[Bmim]BF₄、[Hmim]BF₄和[Bmim]PF₆、[Hmim]PF₆三对离子液体来说，它们的萃取率同样不同，[Bmim]Br比[Hmim]Br增高了9.9％，[Bmim]BF₄比[Hmim]BF₄增高了6.1％，[Bmim]PF₆比[Hmim]PF₆增高了38.3％。由此可以看出，雷公藤次碱的萃取率与离子液体的阴阳离子的种类有关，阴离子影响的大小关系是BF₄^->Br^-->PF₆^-，阳离子影响的大小关系是[Bmim]⁺>[Hmim]⁺。综上，本实施例中选择[Bmim]BF₄为萃取雷公藤次碱的离子液体，[Bmim]BF₄离子液体萃取液的HPLC图谱如图4所示。

2-2、离子液体浓度的选择

众所周知，不同的离子液体浓度，离子液体的萃取能力也不同，因此通过不同浓度的[Bmim]BF₄对昆明山海棠中的雷公藤次碱分别进行萃取，具体地，分别以V_离子液体/V _甲醇1:3、1:5、1:7、1:9、1:29的[Bmim]BF₄离子液体溶液为萃取溶液，其他萃取条件为：固液比1:30(g/mL)、功率400w、微波辅助提取5min，结果如图5所示。

由图5可知，当离子液体浓度(V_离子液体/V_甲醇)从1:29增加到1:9时，随着离子液体[Bmim]BF₄浓度的增加，雷公藤次碱的萃取率也明显增加，萃取率从0.286％增加到0.37％，增加了29.4％。当离子液体浓度(V_离子液体/V_甲醇)从1:9增加到1:3时，随着离子液体[Bmim]BF₄浓度的增加，雷公藤次碱的萃取率也明显降低，萃取率从0.37％减少到0.275％，减少了25.7％。因此选择离子液体浓度(V_离子液体/V_甲醇)1:9为最佳萃取溶剂。

2-3、微波功率的选择

考虑到微波辐射功率的不同，雷公藤次碱萃取率可能不同，故选择不同的微波功率萃取昆明山海棠中雷公藤次碱，来研究微波功率对雷公藤次碱萃取率的影响。本实施例中分别以微波功率200w、300w、400w、500w、600w为微波辅助萃取功率，其他萃取条件为：[Bmim]BF₄V_离子液体/V_甲醇(1:9)为萃取溶液，以固液比为1:30、萃取5min，结果如图6所示，各萃取功率对应的萃取液温度如表1所示。

表1萃取功率所对应的萃取液温度

由图6可知，当微波功率500w时，对雷公藤次碱的萃取率增加高于其他功率，萃取率随微波功率增大而增大；当微波功率增加到一定程度后，雷公藤次碱萃取率随微波功率的增大而减少，因此选择400w为最佳萃取功率。

2-4、萃取时间的选择

由于微波技术加热的快速高效，短时间内即可萃取出相当多的目标物，因此萃取时间是影响萃取率的主要因素，故选择不同的萃取时间考察萃取时间对萃取率的影响。本实施例中分别选择1min、3min、5min、7min、9min为萃取时间，其他萃取条件为：微波功率500w照射，以[Bmim]BF₄V_离子液体/V_甲醇(1:9)为萃取溶液，以固液比为1:30(即液固比30)，结果如图7所示。

由图7可知，当萃取时间从1min增加到5min时，萃取率随着时间的增加而增加；当萃取时间从5min增加到9min时，萃取率随着时间的增加而降低，因此选择萃取时间5min为最佳萃取时间。

2-5、液固比的选择

分别以液固比20、30、40、50、60的[Bmim]BF₄为萃取溶液，其他萃取条件为：微波功率500w、萃取时间5min、[Bmim]BF₄V_离子液体/V_甲醇(1:9)，结果如图8所示。

由图8可知，液固比为60时的萃取率高于其他液固比，但是液固比50略低于60时，从萃取成本考虑故选择液固比50为最佳液固比。

2-6、提取次数的选择

由上述2-1、2-2、2-3、2-4、2-5可得在不考虑提取次数的情况下的较优萃取条件为：[Bmim]BF₄V_离子液体/V_甲醇(1:9)为萃取溶液，微波功率400w、固液比为1:60、萃取5min，在该较优萃取条件下进行提取次数实验，分别在相同萃取条件下提取1次、提取2次、提取3次，结果如图9所示，由图9可知，提取1次时，即提取一次时萃取率较高。

综上可得，最佳萃取条件为：[Bmim]BF₄V_离子液体/V_甲醇(1:9)为萃取溶液，微波功率400w，固液比为1:60，萃取5min，提取一次。

实施例3：回收率和精密度试验

在上述最佳微波萃取条件下，萃取昆明山海棠中雷公藤次碱，于室温下保留7d，进行日间精密和日内精密度度实验。在6d内每隔2d测试一次，一次重复测定3次；在12h内每隔4h测定一次，一次重复测定3次。

从表2中可以看出每个样品分别在日内和日间重复进样5次，测得日内及日间精密度相对标准差，其回收率介于88.7％-93.0％之间,日内RSD分别为4.7％、4.3％和3.8％，日间RSD分别为4.2％、5.1％和5.9％。

表2标准添加回收率与精密度

对比例：微波萃取与常规萃取技术比较

微波萃取技术、超声萃取技术和回流萃取技术萃取雷公藤次碱进行对比，对比结果如表3所示。

表3微波萃取和其他萃取技术的数据比较

由表3可知，与回流萃取和超声萃取相比，利用微波萃取可在较短的时间内达到较高的萃取率。回流萃取120min的萃取率与微波萃取5min的萃取率相似，高于超声萃取9.9％，高于回流萃取5.01％，充分体现出了微波快速、高效的特性。