包括全息确定生物粒子的位置的分析方法与流程

本发明涉及对接收生物粒子的样品进行分析的领域，该分析特别包括确定至少一种所述生物粒子沿着样品的深度轴的位置。

背景技术：

其中需要知道生物粒子沿着接收该粒子的样品的深度轴的位置的许多情况在现有技术中是已知的。

常用的解决方案为在样品的不同深度处获取样品的一系列图像。然后寻求其中观察到生物粒子的清晰图像的图像。

这种解决方案的缺点在于该解决方案不能得知透明生物粒子的位置，该透明生物粒子的清晰图像与周围环境的图像混淆。

本发明的目的是提出一种没有该缺点的方法和设备。

特别地，本发明的目的是提出一种使得可以根据三维空间的至少一个轴来确定任何生物粒子的位置的方法和设备。

技术实现要素：

该目的是通过对接收生物粒子的样品进行分析的方法来实现的，该生物粒子包括感兴趣粒子，该方法是在下述设备中实施的，该设备包括设置在第一光源和光学系统之间的所述样品，并且所述方法包括以下步骤：

-限定位于所述样品的第一界面上或者沿与所述光学系统的光轴平行的轴线距离所述第一界面已知距离处的参考点；

-使用所述第一光源对接收所述感兴趣粒子的区域进行照明，该区域被称为照明区域；

-使用位于所述光学系统的像平面中的传感器来获取所述照明区域的图像，该图像被称为参考图像，所述感兴趣粒子位于所述光学系统的所述物平面的外部，并且所述物平面与所述参考点之间沿着与所述光学系统的光轴平行的轴线的距离是已知距离，该已知距离称为有用距离；

-使用所述参考图像来数字化构建一系列重构图像，每个重构图像与所述物平面沿所述光学系统的光轴的预定偏移量相关联；

-使用所述一系列重构图像来确定所述感兴趣粒子与所述物平面之间沿与所述光学系统的光轴平行的轴线的距离。

因此，有利地，本发明包括下述步骤：通过下述方式来检测该参考点：将所述光学系统放置成使得所述光学系统的物平面被放置在所述参考点上、所述第一界面上或者距离所述第一界面已知距离处，并且将所述光学系统设置成使得所述感兴趣粒子位于所述光学系统的所述物平面的外部。

针对光学系统的该布置来获取参考图像，使得所述感兴趣粒子位于所述光学系统的所述物平面的外部。

光学系统的该布置可以直接对应于为了检测参考点而实施的光学系统的布置。在这种情况下，在检测到参考点之后直接获取参考图像或散焦图像。

或者，在检测到参考点之后，所述方法包括下述步骤：通过使接收所述样品的支持件相对于所述光学系统进行平移来使所述光学系统的所述物平面相对于所述参考点偏移。在该偏移步骤之后获取参考图像或散焦图像。

本发明使得可以精确地知道物平面和所述参考点之间的距离。由此可以精确地知道感兴趣粒子和物平面之间的距离，然后使得可以最佳地定位分析设备，以便对感兴趣粒子进行研究。

有利地，所述方法包括：使用所述感兴趣粒子与所述物平面之间的所述距离以及所述有用距离来确定所述感兴趣粒子与所述参考点之间的距离。

此外，所述方法可以包括：使用所述感兴趣粒子与所述物平面之间的所述距离来确定所述感兴趣粒子在介质中的存在。

确定所述有用距离包括下述子步骤：

-通过激光束对所述参考点进行照射，所述激光束被所述光学系统聚焦；

-在所述传感器上获取表示所述激光束在所述样品的界面上的反射的图像；

-根据在所述传感器上形成的所述图像的强度来调整所述样品与所述光学系统之间沿与所述光学系统的光轴平行的轴线的所述有用距离。

通常，所述生物粒子粘附到所述样品的第二界面上，所述第一界面和所述第二界面是不同的或被混为一谈。

与参考图像相关联的物平面的位置和参考点沿平行于光学系统的光轴的轴线在第二界面上的投影之间沿该轴线的距离例如在+5μm至+2000μm之间或-5μm至-2000μm之间。

所述照明区域可以包括多个生物粒子。

通常，所述第一光源具有小于200nm的谱宽。

有利地，该方法还包括使用所述一系列重构图像来确定感兴趣粒子在与光学系统的光轴正交的平面中的位置。

每个重构图像由实部和虚部构成，并且在所述实部和所述虚部中，有利地，仅使用所述重构图像的所述虚部来确定所述感兴趣粒子与所述参考点之间沿与所述光学系统的光轴平行的轴线的距离。

每个重构图像可以与沿着所述光学系统的所述光轴的偏移量和有用参数的值相关联，以构成根据所述偏移量来对所述有用参数的变化进行描述的函数，并且确定所述粒子与所述物平面之间的距离来实施对所述函数的显著值进行搜索，该显著值尤其为极值、拐点或过零值。

有利地，确定所述感兴趣粒子与所述物平面之间的距离包括以下子步骤：

-使用与所述物平面的偏移量的第一步长相关联的第一系列重构图像来确定所述感兴趣粒子与所述物平面之间的近似距离；

-使用与所述物平面的偏移量的第二步长相关联的第二系列重构图像来确定所述感兴趣粒子与所述物平面之间的精确距离，其中所述第二步长比所述第一步长更精细。

有利地，使用所述感兴趣粒子与所述物平面之间的距离使所述光学系统相对于所述感兴趣粒子移位，以便将分析激光束(363)聚焦在所述感兴趣粒子上。

有利地，使用所述感兴趣粒子与所述物平面之间的所述距离使所述光学系统相对于所述感兴趣粒子移位，以便调整位于所述像平面中的光电检测器的聚焦。

此外，所述方法可以包括对所述样品中存在的生物粒子的数目进行计数的步骤。这些生物粒子可以包括：细菌、孢子、细胞、酵母或微生物。

本发明还涉及一种用于对接收生物粒子的样品进行分析的设备，该生物粒子包括感兴趣粒子，所述设备包括：

-第一光源；

-成像单元，该成像单元包括光学系统和传感器，使得所述传感器位于所述光学系统的像平面中，所述像平面是物平面通过所述光学系统的共轭；

-支持件，该支持件适于接收布置在所述第一光源和所述成像单元之间的所述样品；

-平移装置，该平移装置适于使所述支持件沿与所述光学系统的所述光轴平行的轴线相对于所述成像装置进行移位；以及

-计算装置：

-连接至对与参考点相关的信息进行存储的存储器，该参考点位于所述样品的第一界面上或者在沿所述光学系统的光轴距离所述第一界面已知距离处，

-当所述物平面相对于所述参考点偏移时，接收由所述传感器获取的图像作为输入，该图像被称为参考图像，

-适于使用所述参考图像来进行一系列重构图像的数字化构建，每个重构图像与所述物平面沿所述光学系统的光轴的预定偏移量相关联；以及

-将所述感兴趣粒子与所述物平面之间沿着与所述光学系统的所述光轴平行的轴线的距离提供作为输出。

该设备还可以包括激光器，该激光器适于提供与光学系统的光轴对准的激光束，并且以激光束的聚焦点对应于物平面的方式耦接到光学系统。

附图说明

在参照附图阅读仅用于信息的目的且绝不是限制性而提供的实施例的描述时，将更好地理解本发明，在附图中：

图1示出了根据本发明的分析设备的第一实施例；

图2概略地示出了根据本发明的分析方法的第一实施例；

图3示出了根据本发明的分析设备的第二实施例；

图4概略地示出了根据本发明的分析方法的第二实施例的细节；

图5a至图5c示出了图4所示方法的细节；

图6示出了根据本发明的参考图像；

图7概略地示出了根据本发明的分析方法的第三实施例的细节；以及

图8示出了根据本发明的方法的第四实施例中使用的轮廓图。

具体实施方式

将共同描述根据本发明的分析方法和分析设备，根据本发明的分析设备适于实施根据本发明的分析方法。

图1示出了根据本发明的分析设备100的第一实施例。图2示出了在分析设备100中实施的根据本发明的分析方法的第一实施例。

分析设备100包括支持件110，该支持件110适于接收样品111。

例如，支持件110是夹具或透明板，或者穿有开口以允许光线通过的板。

样品111是透明或半透明介质，即，在可见光谱中或者更一般地，在300nm和1000nm之间的光谱中具有大于或等于70％的透射系数。

样品111由界面或边界、或样品与和该样品直接接触的介质之间的界限来限定。

样品由诸如水、缓冲溶液、含有试剂的液体、培养基之类的液体和位于该液体中的生物粒子112组成。或者，样品由诸如琼脂之类的固体培养基和位于该固体培养基上的生物粒子组成。根据另一替选方案，样品由生物粒子位于其中的气体组成。因此，生物粒子可以位于样品内(例如，在液体中)，或者在样品的表面上齐平(例如位于琼脂上)。

例如，生物粒子112表示细菌、孢子、细胞、酵母或任何类型的微生物。这些生物粒子之一被命名为感兴趣粒子112a。

在图1所示的示例中，样品111包括培养基，该培养基被封闭在由下载玻片113(例如标准显微镜载玻片)、上载玻片114和横向围绕样品111并与上载玻片和下载玻片连接在一起的粘合剂115所限定的流体室内。上载玻片114和下载玻片113在可见光范围内是透明的，并且这适用于其他有用波长的情况。

样品和下载玻片113之间的边界限定了样品111的下界面116。样品和上载玻片114之间的边界限定了样品111的上界面117。

第一光源120在从第一光源到样品111的光的传播方向上位于样品111的上游。在下文中，术语上游和下游是指从第一光源120到样品111的光的传播方向。

例如，第一光源120是激光器，发光二极管，白灯，特别是无论是否被滤波的汞蒸汽灯。第一光源可以包括光纤以便在下载玻片113下方传送光。

有利地，第一光源120是时间相干的。有利地，第一光源120具有小于200nm、甚至小于100nm或甚至25nm的光谱宽度。

优选地，第一光源120是空间相干的。

关于第一光源120的时间相干性和空间相干性，将在下文提供更多细节。

第一光源以透射方式照射样品的区域119。感兴趣粒子112a位于区域119中。

成像单元130在从第一光源到样品111的光的传播方向上位于上载玻片114的下游。在所描述的实施例中，成像单元130位于样品111上方。

成像单元130包括光学系统131和传感器132。

光学系统131例如包括物镜，特别是显微镜物镜。该光学系统具有物平面133和像平面134。像平面134是物平面通过光学系统的共轭面(或图像)。换句话说，位于物平面中的物体对应于像平面中的清晰图像。

传感器132例如是ccd型或cmos型的矩阵传感器。该传感器位于像平面134中。因此，传感器132获取物平面133的一部分的透射图像。

在无限平面配置中，物平面是光学系统的物体焦平面，并且像平面被发送到无限远。诸如镜筒透镜之类的邻近光学设备使得可以将像平面聚焦在传感器132上。在本文的其余部分中，术语传感器132将传感器132及其邻近光学设备组合在一起。

光学系统131具有光轴135。光轴垂直于物平面和像平面。光轴135限定样品111的深度。该轴连接样品111的下界面116和上界面117。优选地，光轴135基本上垂直于下界面116和上界面117。术语界面表示所研究样品111的边界。

根据本发明的分析特别包括沿着平行于光轴135的轴线来确定感兴趣粒子112a的位置。

设备100还包括用于平移的装置140，该装置适于沿着平行于光轴135的轴线移动成像单元130。在诸如上文所限定的无限平面配置中，平移装置140只能移动光学系统131，而传感器132保持固定。或者，平移装置140适于沿着平行于光轴135的轴线移动支持件110。

根据实施例，平移装置140还根据对与光轴135正交的平面进行限定的另外两个轴线来进行平移。

传感器132连接到用于计算的装置150，特别是处理器或微处理器。

设备100适于实施根据本发明的方法，如图2概略地所示那样。

该方法包括确定参考点118的第一步骤21。该步骤包括选择或限定参考点118。该选择一般是任意的。

参考点位于样品111的第一界面上，或者在距离该第一界面已知距离处，该距离是沿光轴135限定的。

特别地，参考点位于上界面117或下界面116上。在图1所示的示例中，参考点位于样品的上界面117上。

根据未示出的替选方案，参考点不直接位于样品的界面上，而是在距离样品界面已知距离处。例如，参考点位于上载玻片114的与样品相反的面上，该上载玻片114的厚度是已知的。

在设备100中，用于计算的装置150连接到存储器151，该存储器151存储与参考点有关的信息，特别是该参考点与所述第一界面之间沿着平行于光轴135的轴线的距离以及可选的该参考点在与光轴135正交的平面中的坐标。

然后使用第一光源120来照射样品111，由此在样品中形成如上所述的照明区域119(步骤22)。

然后，使用成像单元130获取照明区域119的透射图像(步骤23)。该图像被命名为参考图像。在该获取期间，物平面133位于距感兴趣点118已知距离d1处，该距离是沿着平行于光轴135的轴线来限定的。感兴趣粒子112a位于物平面133的外部。优选地，在参考图像的获取期间，物平面位于样品111的外部。例如，当参考点118位于上界面117上时，物平面位于参考点的上方或下方(上游或下游)的5μm与1500μm之间，优选在5μm与1000μm之间，更优选在5μm与800μm之间。同样地，这里的距离是沿着平行于光轴135的轴线来限定的。

通常，在参考图像的获取期间，物平面位于距离对样品111进行限定的界面大于2μm的距离处，优选地大于5μm，优选在[5μm-1500μm]的范围内，更优选在[5μm-1000μm]的范围内，还更优选在[5μm-800μm]的范围内。或者，关于粒子位置的信息可以先验地获得。然后，物平面相对于该先验信息偏移一个值，诸如如上所限定的值。

在图1所示的实施例中，先验信息的示例是附着到表面(例如，对样品111进行界定的上载玻片114)的生物粒子的观测值。了解载玻片的位置使得可以确立这些粒子的位置的先验值，这些粒子附着到与样品邻接的该载玻片的面117。

可以说，参考图像是照明区域的一部分的图像，因为该参考图像是由来自该照明区域的光线所形成的。特别地，参考图像是由来自第一光源并且被样品的生物粒子散射的光线与来自第一光源120并且已经通过样品而没有被散射的光线相互干涉而形成的全息图。参考图像特别地包括与感兴趣粒子相关联的全息图。

在设备100中，计算装置150连接到传感器132以便接收参考图像。

在步骤24中，实施了一系列重构图像的数字化构建。每个重构图像对应于物平面沿着光轴135的、相对于与参考图像相关联的物平面位置的预定偏移量。这些是虚拟偏移量，即，是通过数字化构建模拟的，而不是实际实施的。换句话说，在与相对于物平面的预定偏移量相关联的重构平面中计算每个重构图像。更准确地说，每个重构平面对应于相对于物平面偏移该预定偏移量的物平面的光学系统成像。这通常被称为数字传播。这些偏移量被记作di1，di2，...din，di-1，...di-n。优选地，偏移量在相对于物平面在两个端位置之间延伸，其中这两个端位置围绕上界面117，更一般地，围绕感兴趣点。这些偏移量可以按照有规律的步长分布，该步长特别是0.10μm和1μm之间的步长，例如该步长为0.25μm或0.20μm。因此，假设物平面相继地位于距离与参考图像相关联的物平面的位置di1，di2，...din，di-1，...di-n处，此时由传感器132所获取的图像被数字化重构。参考图像是以实验方式获得的图像，而重构图像形成通过数字传播构建的图像。

与这些偏移量相关联的两个端位置之间的差取决于所观察的样品111，特别是取决于该样品的厚度。当不存在关于感兴趣粒子的位置的先验时，将两个端位置确定为使得它们位于样品111的两侧上。当存在关于样品中感兴趣粒子的位置的先验时，将两个端位置设立成布置在该位置的两侧上。

数字化重构使用参考图像(可能已经经历了预先处理)的傅立叶变换，在将该参考图像转换回真实空间之前，对该参考图像应用传播算子。该传播算子是与所计算的重构图像相关联的偏移量的函数。

根据本发明，传播算子例如是基于瑞利-索末菲(rayleighsommerfeld)公式的积分。

在wilson等人在2012年7月16日第20卷第15期的光学快报16735-16744页发表的题为“3dlocalizationofweakscatterersindigitalholographicmicroscopyusingrayleigh-sommerfeldback-propagation(使用瑞利-索末菲反向传播的数字全息显微术中弱散射体的3d定位)”的文章中描述了使用微球体的图像所实现的数字传播的示例。lee等人在2007年2月19日第15卷第4期的光学快报第1505-1512页发表的题为“holographicmicroscopyofholographicallytrappedthree-dimensionalstructures(全息捕获的三维结构的全息显微术)”的文章中描述了数字传播的另一示例。

重构的图像是复数图像，即具有实部和虚部。这些重构图像包括一组点，图像的每个点被分配了复数量值。

根据本发明的设备100的计算装置150适于使用参考图像来执行如上所述的一系列重构图像的数字化构建。

然后，使用该一系列重构图像来确定感兴趣粒子112a与参考点118之间的距离，该距离是根据平行于轴线135的轴线来限定的(步骤25)。或者，使用一系列重构图像将该距离限制为感兴趣粒子112a与物平面133之间的距离dref。

为此，计算感兴趣粒子112a与和参考图像相关联的物平面之间沿着光轴135的距离dref。已知该物平面与参考点118之间沿着光轴135的距离d1，从该距离推断出感兴趣粒子112a与参考点118之间沿着光轴135的距离df。

为了确定感兴趣粒子112a与和参考图像相关联的物平面之间沿着光轴135的距离dref，将每个重构图像与有用参数的值相关联，其中有用参数为属于重构图像的点的复数强度参数(或复数幅度)的函数。例如，重构图像的复数强度参数(或复数幅度)是重构图像的虚部、实部、模数或相位。优选地，有用参数的这些值以轮廓图的形式聚集在一起，该轮廓图表示根据每个重构图像相对于物平面133沿着光轴135的偏移量的有用参数的值。

然后，寻找该轮廓图上的显著值，例如最大值或拐点或过零值。该显著值与下述偏移量相关联，该偏移量为感兴趣粒子和与参考图像相关联的物平面133的位置之间沿着光轴135的偏移量。优选地，将要搜寻的显著值设置为最大值并且通常是极值，以便限制通过二阶导数(检测拐点)期间的不确定性的影响，并且以便克服测量偏差的校正(检测过零点)。但有用参数的显著值也可以是对根据重构图像与物平面133之间的偏移量的该参数的变化进行描述的函数的过零值，或该函数的拐点，或任何其他准则。

因此，通常，通过以下一连串步骤来确定参考图像的物平面133与感兴趣粒子112a之间的距离dref：

-在参考图像上识别与所述感兴趣粒子相关联的全息图，

-通过下述方式来进行图像的数字化重构：将投影算子应用到所述参考图像或参考图像的包括所述全息图的感兴趣区域，使得针对相对于物平面133的多个预定偏移量di1，di2，...din，di-1，...di-n获得重构图像，每个重构图像对应于每个偏移量，

-在每个重构图像中提取表示图像的每个点的复数值的参数，该参数被称为有用参数，

-根据所述偏移量分析该有用参数的变化并且识别该有用参数的显著值，

-确定与该有用参数的所述显著值相对应的偏移量，然后认为感兴趣粒子112a与物平面133之间的距离dref等于该偏移量。

知道物平面133与参考点118之间的距离d1，则可以通过运算df＝dref–d1推导出感兴趣粒子112a与参考点118之间的距离df。

在每个重构图像上提取有用参数是指例如通过获取与构成图像的各个点中的每一点相关联的复数量值的和或平均值来计算代表这些点的参数。

有用参数可以是使用构成图像的各个点的虚部的值所确定的图像的虚部的平方。然后，有用参数对应于构成图像的所有点的虚部的平方的平均值。发明人已经观察到，这样的参数使得可以获得良好的定位精度。

除了成像部分之外，该参数还可以包括构成图像的点的实部的值，或构成图像的点的模数，或者这些不同量值的平方。发明人已经表明，可以沿着光轴135来定位感兴趣粒子112a的位置，该位置对应于有用参数的显著值，并且例如对应于：

-最大值：这是当沿着光轴135观察图像的虚部的平方上的变化或模数上的变化或模数的平方上的变化时的情况。

-过零值：例如当沿着光轴135观察图像的实部或其平方上的变化时。

可替选地或以互补方式，识别所述感兴趣参数的显著值使得可以得出关于培养基中的感兴趣粒子112a在所考虑的偏移范围内存在的结论，而感兴趣粒子112a与物平面之间的距离dref不一定要被记住。

每个感兴趣粒子112a对应于参考图像上的全息图。然后可以选择受限于全息图的感兴趣区域，并且将上述步骤应用于与全息图相关联的每个感兴趣区域。

计算装置150将感兴趣粒子112a与参考点118之间沿着轴线135的距离df提供作为输出。

借助于数字传播使得可以减少要获取的样品图像的数量。特别地，获取单个图像就足够了。因此，根据本发明的方法特别快并且可以自动化。

在某些情况下，当感兴趣粒子位于光学系统的物平面中时，没法将该感兴趣粒子的图像与周围介质(该周围介质对应于样品111的围绕该感兴趣粒子的部分)的图像区分开。例如，当感兴趣粒子处于在第一光源的光谱中具有相同的透射系数或近折射率(例如在20％以内)的介质中时就是这种情况。在这种情况下，根据例如在背景技术中所描述的现有技术的方法不能确定感兴趣粒子的位置。但是，根据本发明，可以在重构图像中识别感兴趣粒子，因为该重构图像是包含比所获取的图像更多的信息的复数图像。因此，根据本发明的方法使得即使在下述情况下也可以沿着平行于光学系统的光轴的轴线来确定粒子的位置，该情况为当粒子位于光学系统的物平面内时在所获取的图像中无法将该粒子与该粒子周围的介质区分开。

最后，根据本发明的方法使得可以沿着光轴135将图像与物平面的位置相关联，该位置是以极高的精度确定的(链接至在步骤23中实施的偏移的步骤)。使用物理和非虚拟偏移将不容易实现这样的精度。

参考图像可以包括单个生物粒子的全息图，然后该全息图限定根据本发明的感兴趣粒子。

或者，参考图像包括多个生物粒子的全息图，任意选择这些全息图之一来限定根据本发明的感兴趣粒子，并且重构图像的部分或感兴趣区域位于这些全息图之一的中央。

可以实施对参考图像进行标准化的预备步骤。为此，获取所谓的背景图像，该背景图像代表光学系统的缺陷(内部反射，灰尘等)。例如，背景图像对应于在拍摄图像的同时通过在与物平面平行的平面中移动样品而获取的图像。或者，背景图像是使用针对样品在平行于物平面的平面中的多个位置所获得的多个静态图像而形成的平均图像。然后，逐个像素地将参考图像除以背景图像。由此获得标准化参考图像。这样的标准化改进了该方法的结果。

根据本发明的第一替选方案，直接使用参考图像或使用如上所限定的标准化参考图像来执行数字传播。

将与偏移量z相关联的重构图像记为：

up(z)＝tf^-1{tf(u0)xh(z)}

其中：u0表示执行数字传播所使用的图像(此处为参考图像或标准化参考图像)，tf表示傅里叶变换算子，tf^-1表示傅里叶逆变换，x表示矩阵的逐项相乘，以及h表示基于瑞利-索末菲积分的传播算子。

在这里所示的例子中，我们特别有：

h(u，v，z)＝exp[-|z|*im(p(u，v))+i*z*re(p(u，v))]

其中：

■re表示实部算子，im表示虚部算子，i²＝-1，

■u和v表示与实际空间中和轴135正交的平面中的坐标x、y相关联的傅立叶空间中的坐标，

■以及

以下述方式来限定坐标u和v：

按的步长

按的步长

并且其中：

■δp为在物平面中限定的采样步长的大小(因此与传感器132的像素间距相关并且与光学系统131的放大系数相关)，

■nx和ny为在图像u0中分别根据x、y的像素数，

■λ为第一光源的中心波长。

然后使用每个重构图像up(z)的虚部来确定感兴趣粒子沿着光学系统的光轴的位置。特别地，寻找下述重构图像或重构图像的一部分，该重构图像或重构图像的部分的虚部的平方(即，构成图像的各个点的虚部的平方的平均值)最大。重构图像的一部分是重构图像的以感兴趣粒子的图像为中央的一部分。如果参考图像涉及多个生物粒子，则可以使用相同的参考图像，每次使用以不同生物粒子为中心的重构图像来确定这些生物粒子中每一个粒子的位置。

现在将参照图3和图4来描述根据本发明的设备300的第二实施例以及根据本发明的方法的第二实施例。将仅描述图3相对于图1的不同之处。

图1的附图标记111、120、112a、116、117、118、130、131、132、135、120、150、151分别对应于图3的附图标记311、320、312a、316、317、318、330、331、332、335、320、350、351。

把根据图3的设备与根据图1的设备区分开的特征中的每个特征可以独立地与图1的设备分离以及组合，以形成本发明的许多其它替代方案。

根据如图3所示的有利实施例，生物粒子直接粘附到样品的第二界面。

平行于轴335并通过参考点318的直线通过该第二界面。

有利地，将该第二界面与诸如上文所限定的第一界面混为一谈。在相反的情况下，优选地，沿着平行于光轴135的轴线，第一界面相对于第二界面的位置是已知的。特别地，该位置沿着平行于光轴135并经过参考点318的轴线延伸。

因此，存在关于参考点318相对于生物粒子的、沿着光轴335的位置的先验知识。

第二界面基本上与轴线335正交。特别地，第二界面是样品的下界面316或上界面317。

在实践中，例如，我们研究：

-琼脂，生物粒子在该琼脂的上表面上延伸，或

-生物粒子，该生物粒子自然地粘附在覆盖样品的载玻片上，所述载玻片位于样品上方。

在图3所示的示例中，生物粒子粘附到上界面317。

通常，上界面相对于垂直于轴线335的平面略微倾斜小于0.1rad(弧度)(甚至小于0.05rad或小于0.02rad)的角度。

根据本发明的方法使得可以在对样品上界面进行限定的上载玻片相对于与轴线335正交的平面倾斜的情况下，克服关于生物粒子沿着轴线335的定位的不确定性。

更一般地，根据本发明的方法使得可以在对样品上界面进行限定的上载玻片相对于与轴线335正交的平面形变的情况下，克服关于生物粒子沿着轴线335的定位的不确定性。该形变可以表示任何形变，例如粘附到所述第二界面的生物粒子位于由垂直于光轴335并且沿该轴间隔至少100μm(甚至小于50μm)的两个平坦表面所界定的圆柱体内。

优选地，与参考图像相关联的物平面的位置和参考点318沿平行于光轴335的轴线在第二界面上的投影之间沿该轴线的距离在+5μm至+1500μm之间或-5μm至-1500μm之间。有利地，该距离在+5μm至+1000μm之间或-5μm至-1000μm之间，或者甚至在+5μm至+800μm之间或-5μm至-800μm之间，或更甚至在+5μm至+200μm之间或-5μm至-200μm之间。由此限定了最佳散焦范围，使得更容易计算感兴趣粒子与参考点之间的距离。

由于生物粒子粘附到所述第二界面并且位于具有有限高度的圆柱体中，因此在参考图像的获取期间，容易确保感兴趣粒子位于距离最佳散焦范围中的物平面成一定距离处。

最佳散焦范围的宽度可以取决于第一光源320的特性，特别是该第一光源的时间相干性和空间相干性。

因此，可以根据期望研究的多个感兴趣粒子之间沿着光轴335的距离来适配第一光源，使得这些感兴趣粒子同时处于最佳散焦范围内。

例如，可以使用白光源，以获得+5μm至+200μm以及-5μm至-200μm的最佳散焦范围。第一光源的光谱宽度越小，最佳散焦范围的宽度就越大。

此外，第一光源320的表观直径越小，最佳散焦范围越宽。

在图3所示的示例中，分析设备300包括用于确定距离的装置，该装置用于确定参考点同与参考图像相关联的光学系统物平面的位置之间沿着与光轴335平行的轴线的距离。将该距离命名为有用距离。

这些装置特别地包括适于对参考点318进行照射的激光器360。当不期望激光束363照射参考点318时，连接到平移板362的快门361使得可以关闭激光器的输出。

有利地，激光束363沿着平行于光轴335的轴线入射在参考点上。

激光束363和图像传感器332光学耦接至同一光学系统331，使得激光束的聚焦点对应于传感器的物平面。

在图3所示的示例中，参考点位于上界面317上，这就是为什么激光束363经由该上界面317穿透到样品中的原因。

激光束363穿过第一分离载玻片371，然后在到达上界面317之前在第二分离载玻片371上反射。每个分离载玻片可以是二向色载玻片。或者，使用立方体或半反射镜。

通过实施图4所示的以下子步骤来确定有用距离。

在子步骤41中，使用激光束照射参考点318。

然后，以下述方式调整样品与光学系统331之间特别是沿着平行于光轴335的轴线的距离，该方式为使得传感器332接收由激光束363在参考点上的镜面反射而形成的斑点图像(子步骤42)。可以通过参照图1所描述的平移装置340来进行这种调整。

在实践中，参考点318的定义可以取决于激光束363在与光轴335正交的平面中的任意位置。

该调整实现了在接收参考点的表面上检测激光束363的镜面反射。图5a至图5c中示出了这种调整的示例，其中参考点位于上界面317上。

图像5a对应于上界面317上方的物平面533的位置。在传感器上获得的图像是不太亮的大斑点。

图像5b对应于上界面317上的物平面的位置。在传感器上获得的图像是窄小且非常亮的斑点。

图像5c对应于上界面317下方的物平面的位置。在传感器上获得的图像是不太亮的大斑点。

通过沿轴线335移动光学系统，连续观察如下：

-不太亮的大斑点；

-第一窄小且非常亮的斑点，该斑点对应于由光学系统331聚焦在上载玻片314的与样品相反的面315上的激光束363的反射，该斑点呈现最大亮度；

-第二窄小且非常亮的斑点，该斑点对应于由光学系统331聚焦在上载玻片314的面317上的激光束363的反射，其中该面与样品邻接，从而构成样品的界面之一，该斑点具有次极大亮度，然后，

-对应于激光束在样品311中的后向散射的不太亮的大斑点。

因此，对激光束的镜面反射信号的光强度随光学系统331与样品311之间的相对间隔而变化的分析使得可以确定感兴趣点318的位置，在本示例中，参考点对应于激光束的聚焦点，该聚焦点具有能够反射光束的表面，在这里是面317或面315。

在上述示例中，镜面反射的最强图像和具有次极大强度的镜面反射的图像对应于下述配置，在该配置中物平面分别穿过激光束与下述两个面的交叉点，该两个面分别为上载玻片314的和样品相反的面以及上载玻片314的和样品邻接的面。

可以注意到，检测激光束在上载玻片的与样品邻接的面上的反射是特别有意义的，因为即使在通过浸液物镜形成光学系统的情况下该面也是可见的。

然后，该方法可以包括子步骤43，该子步骤43包括相对于成像装置将接收样品的支持件沿着光轴335移动已知距离。这里也可以使用如参照图1所描述的平移装置。该子步骤可用于将感兴趣粒子置于如上所限定的最佳光学散焦范围内。

图3示出了在上界面317上反射且通过光学系统331在传感器上成像的激光束364。反射的激光束364在第二分离载玻片372上被反射，然后在第一分离载玻片371上被反射。

当快门361打开并且第一光源320熄灭时，计算装置351接收由传感器351所获取的图像作为输入。这些计算装置对平移装置340进行控制，以便实施子步骤42，并且在适用情况下，实施子步骤43。

优选地，根据本发明的方法还包括使用一系列重构图像来确定感兴趣粒子在与光学系统的光轴正交的平面中的位置。将参照图7来进一步描述这种确定的示例。

平移装置340可以根据下述两个轴线来实施平移，该两个轴线合起来对与光轴335正交的平面进行限定。由此，可以连续地定位同一样品的多个感兴趣粒子。在对参考点进行确定的单个步骤之后，如上所述地多次实施以下一系列步骤：

-对样品的区域进行照明；

-获取参考图像；

-数字化构建一系列重构图像；以及

-确定感兴趣粒子与参考点之间的距离，和/或使用参考图像或感兴趣粒子的一个或多个重构图像来检测数量和位置。

在两个这些步骤的系列之间，在与光轴335正交的平面中平移样品。

图3还示出了在根据本发明的方法和设备中所实施的分析的附加步骤。

设备300包括用于将激光束363的腰部(即激光束的直径最小的位置)定位在感兴趣粒子上的装置。

感兴趣粒子在反射中所发射的辐射由光学系统331收集并由对该辐射进行分析的光谱仪380接收。例如，光谱仪380是对拉曼散射进行分析的光谱仪或荧光光谱仪。在这种类型的分析中，优选的是，激发激光束集中在所检查的粒子上。这防止了粒子附近的拉曼散射光谱的干扰。

借助于诸如平移板(未示出)之类的平移装置来实施激光束363的腰部的定位，该平移板适于相对于成像装置331移动样品。可以由平移装置340来形成这些平移装置。平移装置由计算装置350来控制。计算装置350使用感兴趣粒子相对于参考点的位置来将光学系统331的物平面定位在感兴趣粒子上。

特别地，使成像装置相对于感兴趣粒子移动，以便将分析激光束聚焦在与成像装置的光轴正交的平面中，该平面接收所述感兴趣粒子，并且使该分析激光束的腰部在该平面中移动，使得将该腰部精确地放置在感兴趣粒子上。

可以考虑需要将激光束精确定位在感兴趣粒子上的任何其他类型的分析。可以使用与激光器360分离的激光源来对感兴趣粒子进行分析。

类似地，可以使用光学耦接到光学系统331的光电检测器332，例如以响应于激发信号来收集由感兴趣粒子112a发射的荧光信号。知道上述距离之一(df或者dref)使得可以将光学系统聚焦在粒子上，这优化了通过光电检测器332对荧光信号的收集。

在大多数情况下，介质包含多个感兴趣粒子。在第一阶段期间，确定并存储与样品的每个感兴趣粒子112a对应的距离dref或df。在第二阶段期间，调整光学系统331的相对定位，使得该光学系统的物平面包括感兴趣粒子。对于每个感兴趣粒子，相继进行这种调整，以便优化分析。

图6示出了根据本发明的参考图像的示例。横坐标轴和纵坐标轴以像素为单位。对多个衍射图案61进行区分，每个衍射图案与生物粒子相关联。

现在将参照图7来描述为了使用第一系列重构图像来确定感兴趣粒子与参考点之间沿着与光学系统的光轴平行的轴线的距离而实施的步骤的详细示例。

在所示的示例中，我们将自己置身于如上所述的实施例中，其中我们具有：

h(u，v，z)＝exp[-|z|*im(p(u，v))+i*z*re(p(u，v))]

然后实施下述子步骤：

子步骤71：

对于第一系列重构图像中的每个重构图像，计算虚部的平方。获得第一系列所谓的有用重构图像。因此，重构图像的虚部的平方限定了相应的有用重构图像的强度。

子步骤72：

每个有用重构图像对应于相同的像素矩阵。与每个像素相关联的强度根据有用重构图像而变化。

针对每个像素，从各有用重构图像上的强度中选择最大强度。由此形成最大值的图像。

类似地，形成最小值的图像。

然后，计算与最大值的图像和最小值的图像之间的差异对应的梯度720的图像。

可以使用第一矩阵来执行该步骤，该第一矩阵的一个维度对应于像素，而另一维度对应于与有用重构图像相关联的物平面的偏移量。沿着光学系统的光轴(以下称为轴线(oz))来测量该偏移量。

例如，如果有用重构图像各自具有x个像素的宽度和y个像素的高度，并且重构了n个有用重构图像，则第一矩阵具有xy列和n行。

然后，最小值的图像对应于第二矩阵xy列和1行。最大值的图像对应于第三矩阵xy列和1行。梯度的图像对应于第四矩阵xy列和1行，该第四矩阵等于第三矩阵和第二矩阵之间的差。

子步骤73：

选择沿着轴线(oz)具有强烈强度梯度的像素。限定与这些像素相关联的平均梯度。该平均梯度的最大值的位置粗略地限定了生物粒子沿着轴线(oz)的位置。

为此，在第四矩阵中，可以选择具有最高值(例如第一百分位数)的列。由此限定了m个像素的系列。然后，选择第一矩阵中的这些像素，并且将与沿轴线(oz)相同偏移量相关联的所选像素组合(例如求和或求平均)。由此形成第五矩阵n行和1列。

然后在该第五矩阵的值之中搜索最大值，并且记录与该最大值相关联的沿轴线(oz)的偏移量。

图730以轮廓图的形式示出了第五矩阵，其中横坐标轴是沿轴线(oz)的偏移量，纵坐标轴是第五矩阵上的相应值。

子步骤73限定了在参考图像上成像的多个生物粒子沿轴线(oz)的平均位置。该平均位置通过假设生物粒子基本上位于与轴线(oz)正交的同一平面内而限定了根据本发明的感兴趣粒子的近似位置。

充分利用与沿着轴线(oz)各自具有强梯度的像素的选择相关联的沿着该轴线的梯度。因此，更容易检测到与该选择相关联的梯度的最大值。

子步骤74：

从第一系列有用重构图像的图像中，选择与在子步骤73中计算的沿着轴线(oz)的位置相关联的图像。

对该图像进行阈值处理，以获得二值图像740。然后，检测由阈值处理所显示的二进制对象的坐标。由此，在与轴线(oz)正交的平面中计算每个生物粒子的近似位置。该步骤可以包括对每个二进制对象进行椭圆插值的步骤，以便另外计算每个二进制对象以及因此每个生物粒子的近似几何形状。

通过任意选择二进制对象之一来任意选择感兴趣粒子。因此已经在与轴线(oz)正交的平面中确定了感兴趣粒子的近似位置。

二进制图像740被限定为包含该单个二进制对象的感兴趣区域。该感兴趣区域是由像素的位置限定的。例如，该感兴趣区域是16×16像素的平方。

子步骤75：

通过在每个有用重构图像中选择与如上所限定的感兴趣区域对应的区域，使用第一系列有用重构图像来实施该步骤。

或者，使用第二系列有用重构图像来实施该步骤。第二系列有用重构图像中的每个图像由第二系列重构图像中的图像的虚部的平方形成。

第二系列重构图像与沿着轴线(oz)的、比第一系列重构图像的采样步长小的采样步长相关联。第二系列重构图像中的每个图像对应于如上所限定的感兴趣区域。与第二系列重构图像相关联的沿着轴线(oz)的采样范围的幅度小于与第一系列重构图像相关联的采样范围的幅度。可以仅为了搜索感兴趣粒子的精确位置而计算第二系列重构图像。

在第二系列有用重构图像上实施子步骤72和子步骤73，以便计算感兴趣粒子沿轴线(oz)的精确位置。

图750对应于图730，其中用第二系列有用重构图像代替了第一系列有用重构图像。

子步骤76：

在与轴线(oz)正交的平面中计算感兴趣粒子的精确位置。

为此，从第二系列有用重构图像的图像中选择与感兴趣粒子沿着轴线(oz)的精确位置相关联的图像。

对该图像进行阈值处理，以获得新的二值图像。然后，检测由阈值处理所显示的二进制对象的中心的坐标。

可以考虑许多替选方案。

特别地，我们可以考虑如上所述的实施例，其中我们具有：

■h(u，v，z)＝exp(i*2*π*z*w)，其中：对于具有

■否则：h(u，v，z)＝0

因此，有用重构图像被限定为是相应重构图像的模数的平方。

然后，实施与上述步骤类似的步骤，不同之处在于，搜索沿轴线(oz)的位置所实施的是搜索具有最大标准偏差值的有用重构图像。

根据另一替选方案，我们可以考虑如上所述的实施例，其中我们具有：

■h(u，v，z)＝exp(i*2*π*z*w)，其中：对于具有

■否则：h(u,v,z)＝0

然后，每个有用重构图像被限定为是相应重构图像的模数的平方。

然后如上所述地形成梯度的图像，并且通过阈值处理在与轴线(oz)正交的平面中推导生物粒子的近似位置。这里通过阈值处理获得的图像称为第一阈值图像。特别地，由此，在与轴线(oz)正交的平面中限定了感兴趣粒子的近似位置。

在第一阈值图像中，任意选择与生物粒子相关联的第一二进制对象。限定接收该单个二进制对象的第一感兴趣区域。

然后，在每个有用重构图像中选择对应于该第一感兴趣区域的区域。使用如此创建的第一感兴趣区域的一系列图像来寻求具有最大标准偏差值的图像的沿轴线(oz)的位置。假设所有生物粒子基本上位于与轴线(oz)正交的同一平面内，则该位置限定了感兴趣粒子沿着轴线(oz)的近似位置。

然后，我们返回到梯度的图像并且使用下述阈值形成第二阈值图像，该阈值大于用于形成第一阈值图像的阈值(例如，大1.5倍)。在第二阈值图像中，通过任意选择第二二进制对象来限定感兴趣粒子。通过搜索该第二二进制对象的中心，在与轴线(oz)正交的平面中推导出感兴趣粒子的精确位置。

使用该第二阈值图像来限定接收该单个第二二进制对象的第二感兴趣区域。然后，在每个有用重构图像中选择对应于该第二感兴趣区域的区域。使用如此创建的一系列图像来寻求具有最大标准偏差值的图像的沿轴线(oz)的位置。该位置限定了感兴趣粒子沿轴线(oz)的精确位置。

图8用于示出本发明的具体情况。参照图1的附图标记。

为了确定感兴趣粒子和参考点之间沿平行于轴线135的轴线的距离，对感兴趣粒子和与参考图像相关联的物平面之间沿该轴线的距离进行计算。

在实践中，该计算使得可以确定感兴趣粒子和与参考图像相关联的物平面之间沿平行于轴线135的轴线的距离的绝对值。然后，知道实验设置来选择一个或另一个符号。

例如，

-如果参考点位于上界面117上方，并且

-如果与参考图像相关联的物平面位于上界面117上方，

-那么已知感兴趣粒子在与参考图像相关联的物平面下方。

当不能可靠地确定该距离的符号时，可以使用与重构图像的实部相关的沿着轴线(oz)的轮廓图。然后可以考虑如上所述的实施例，其中我们具有：

h(u，v，z)＝exp[-|z|*im(p(u，v))+i*z*re(p(u，v))]

特别地，可以实施以下步骤：

-使用一系列重构图像来确定一系列二级图像，其中每个二级图像是由相应重构图像的实部形成的；

-以与图7所示的子步骤72相同的方式，将该一系列二级图像(三维矩阵)变换成二维矩阵，其中二维矩阵中的一维对应于像素，另一维对应于沿轴线(oz)的偏移量。

-在所述二维矩阵中，选择沿着轴线(oz)具有强烈强度梯度的像素。由此限定与这些像素相关联的平均梯度。图8中示出了该梯度。横坐标轴是沿着轴线(oz)的偏移量，特别是和与参考图像相关联的物平面的位置有关的物平面的偏移量。纵坐标轴与二级图像的实部相关。

-根据轮廓图的形状来确定感兴趣粒子和与参考图像相关联的物平面之间沿平行于轴线135的轴线的距离的符号：

-如果对于增加的横坐标轴，我们从正的最大值移动到负的最小值(图8的情况)，则参考图像在物平面上方(在光的传播方向上)，

-如果对于增加的横坐标轴，我们从负的最小值移动到正的最大值(图8的相反情况)，则参考图像在物平面下方(在光的传播方向上)。

本发明不限于上述示例，并且在不脱离本发明的范围的情况下可以考虑许多替选方案。例如，数字化构建一系列重构图像的步骤可以实施除了示例中提到的那些传播算子之外的传播算子。也可以以不同的方式来利用重构图像系列，以推导出与参考图像相关联的物平面和感兴趣粒子之间的距离。