本发明属于医学免疫学领域，涉及一种免疫检测试剂，进一步地，本发明涉及一种磷酯酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒。
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：：原发性肝癌(primaryhepaticcarcinoma，PHC)是目前世界上死亡率最高的恶性肿瘤之一，确诊后的五年生存率不足12％，近年来其发病率在世界范围内有增高趋势。外科切除仍是目前PHC最常用的治疗方法，但大多数患者就诊时已属中晚期，失去了最佳手术治疗时机，因而提高PHC的早期诊断水平是提高肝癌治疗和预后效果的关键。甲胎蛋白(AFP)是目前全世界应用最广泛的肝癌肿瘤标记物，但PHC患者AFP敏感性仅为35％-65％，特异性不到80％，尤其是早期肝癌阳性率更低，以此作为PHC早期确诊的方法并不十分理想，迫切需要寻找新的标记物。磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)是近来发现的具有潜在价值的肝癌血清标记物。GPC3属于膜性硫酸乙酰肝素类糖蛋白超家族成员，具有羟基末端连接在细胞膜上，氨基端游离在细胞外的特殊结构，被认为与定位，输送有关。它是由蛋白质、脂类和糖三者共价连接的复杂糖复合物，其氨基端(N)为可溶性蛋白，在肝癌细胞中表达时可分泌至外周血液中，这是外周循环血液中能够检测到GPC3的分子生物学基础。临床基础研究显示，肝细胞发生癌变时GPC3可异常表达，激活的GPC3可通过多种信号传导通路促进肝细胞恶性转化，增强其侵袭转移能力。单一GPC3或AFP在PHC表达有限，而联合GPC3和AFP检测显著提高PHC诊断的敏感性和特异性，分别达84.2％和95.7％，显著高于AFP或GPC3单独检测。能改善PHC诊断水平。尤其是利用GPC3检测可以提高AFP阴性PHC的诊断水平，对PHC早期诊断和筛查具有一定意义，是提高PHC早期诊断和鉴别诊断水平的有意义的指标。。目前常用的测定磷酯酰肌醇蛋白聚糖3蛋白的方法主要是酶联免疫吸附法(ELISA)。ELISA法操作时间长，无法准确进行定量测定，更多的是用来定性。胶乳增强免疫比浊法是一种可以准确定量测定的方法，它的基本原理是：将抗体包被在胶乳颗粒上，在与相应抗原发生免疫反应后，能够形成聚集颗粒，在一定波长条件下，聚集颗粒形成的浊度与相应抗原有比例关系，因此通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出样本中待检抗原的含量。技术实现要素：：本发明所要解决的技术问题是针对上述
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的不足，提供一种灵敏度高，准确性好，线性范围宽，并且生产成本低的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒。为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种磷酯酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2，试剂R1包括缓冲液、稳定剂、电解质、表面活性剂和防腐剂；试剂R2包括用抗磷酯酰肌醇蛋白聚糖3抗体致敏的聚苯乙烯胶乳颗粒、缓冲液、稳定剂、表面活性剂和防腐剂。本发明上述试剂盒中试剂R1与试剂R2的体积比为4∶1。本发明试剂R1和试剂R2中的缓冲液包括但不限于PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、氯化铵缓冲液以及其他具有相似性质的缓冲液中的一种或者几种。试剂R1所用的缓冲液与试剂R2所用的缓冲液只要为上面的缓冲液中的一种任意搭配均可。本发明试剂R1和试剂R2中的防腐剂包括但不限于苯甲酸钠、亚硝酸钠、Proclin300、山梨酸钾、叠氮钠以及其他具有类似性质的防腐剂中的一种或几种。本发明试剂R1和试剂R2中的稳定剂包括但不限于聚乙二醇、丙二醇、蔗糖、丙三醇、山梨醇、BSA、海藻糖以及其他具有类似性质的稳定剂中的一种或者几种。本发明试剂R1中的电解质包括但不限于氯化钠、氯化钾、氯化钙以及其他具有类似性质的电解质中的一种或者几种。本发明试剂R1中的表面活性剂包括但不限于SPAN系列表面活性剂、TRITON系列表面活性剂、TWEEN系列表面活性剂以及其他具有类似性质的表面活性剂中的一种或者几种。本发明所述的聚苯乙烯胶乳颗粒，平均粒径在50-500nm之间，粒径小于50nm的时候，胶乳颗粒聚集产生的光密度变化太小，结果很难满足试剂盒检测的敏感度要求，同时再制备试剂的时候，需要花费过多的离心时间，延长了试剂生产的时间，增加了试剂成本并且批间重复性差。而粒径大于500nm的胶乳颗粒在测量高浓度待检物时，聚集产生的光密度变化会超出检测限，导致很难获得对应于分析物浓度的光密度变化，而且颗粒太大会加速自聚集，导致分散性降低。在使用不同试验方法和设备的时候，最优胶乳颗粒粒径会有所改变，因此选择的颗粒粒径最好是介于200nm-300nm之间。本发明所述抗体包括但不限于多克隆抗体(羊、兔、鸡)及单克隆抗体。本发明磷酯酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒除包括试剂R1和试剂R2外，还包括磷酯酰肌醇蛋白聚糖3蛋白校准品；进一步的，所述磷酯酰肌醇蛋白聚糖3蛋白校准品中的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3蛋白的含量为0-800ng/ml。本发明所述的试剂R2是用抗磷酯酰肌醇蛋白聚糖3抗体致敏的聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成，该试剂R2制备步骤包括：(1)聚苯乙烯胶乳颗粒的激活：在带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，混合均匀，反应结束后加入己二酸二酰肼，继续反应，得到激活的聚苯乙烯胶乳颗粒；(2)抗磷酯酰肌醇蛋白聚糖3抗体的氧化：用高碘酸钠将抗磷酯酰肌醇蛋白聚糖3抗体Fc端糖链上的羟基氧化成醛基；(3)抗磷酯酰肌醇蛋白聚糖3抗体与聚苯乙烯胶乳颗粒的偶联：将步骤(1)激活的聚苯乙烯胶乳颗粒和步骤(2)氧化的抗磷酯酰肌醇蛋白聚糖3抗体混合进行反应，反应结束后，加入葡萄糖封闭聚苯乙烯胶乳颗粒上没有发生反应的集团，获得偶联抗磷酯酰肌醇蛋白聚糖3抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒。本发明上述制备方法各个步骤中物料配比为：步骤(1)中乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺∶聚苯乙烯胶乳颗粒＝0.1-1∶100(质量比)；己二酸二酰肼∶聚苯乙烯胶乳颗粒＝10-50∶100(质量比)；步骤(2)中高碘酸钠∶抗磷酯酰肌醇蛋白聚糖3抗体＝1∶2；(质量比)步骤(3)中抗磷酯酰肌醇蛋白聚糖3抗体∶激活的聚苯乙烯胶乳颗粒＝5-20∶100(质量比)，葡萄糖∶激活的聚苯乙烯胶乳颗粒＝20-50∶100(质量比)。本发明所用检测磷酯酰肌醇蛋白聚糖3蛋白的方法为胶乳增强免疫比浊法，其原理是将抗体包被在胶乳颗粒上，在与相应抗原发生免疫反应后，能够形成聚集颗粒，在一定波长条件下，聚集颗粒形成的浊度与相应抗原有比例关系，因此通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出样本中待检抗原的含量。在本发明中，血清中的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3蛋白与结合在聚苯乙烯胶乳颗粒表面的抗人磷酯酰肌醇蛋白聚糖3抗体结合，产生抗原抗体反应，使聚苯乙烯胶乳颗粒形成聚集；在600nm波长处测定吸光度，对照标准曲线即可得到磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的含量。本发明的优点：1、本发明通过优化的胶乳颗粒包被方法，使得该试剂盒灵敏度高，准确性好，线性范围宽，并且生产成本低。2、本发明试剂盒中的试剂R2制备是一种抗原抗体反应试验方法，特别之处在于采用定向偶联法将抗磷酯酰肌醇蛋白聚糖3抗体包被到聚苯乙烯胶乳颗粒上；本发明将抗磷酯酰肌醇蛋白聚糖3抗体的非结合活性区域的Fc端定向偶联到聚苯乙烯胶乳颗粒上，不会发生类风湿因子(RF)和嗜异性抗体的干扰所导致的检测结果的假性升高；该方法定向偶联的抗磷酯酰肌醇蛋白聚糖3抗体偶联到聚苯乙烯胶乳颗粒上后，其抗原结合位点指向流动相，抗体偶联部位为Fc片段，因此不会发生抗体结合力降低的情况，保持了抗体活力，从而大大减少抗体用量，降低了生产成本。3、本发明试剂盒中的试剂R2制备采用定向化学偶联法，得到的致敏胶乳颗粒稳定性好，抗体不会从胶乳颗粒上脱落，而且由于化学偶联过程中，偶联部位在Fc片段，对该部位产生了空间位阻，因此避免了类风湿因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，大大提升了检测结果的准确性和可行性。具体实施方式下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。实施例1磷酯酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒的制备本发明的试剂盒涉及试剂的主要原材料如下：1、抗磷酯酰肌醇蛋白聚糖3抗体：鼠单克隆抗体，ELISA法测定效价为1∶100000。2、胶乳颗粒：本发明仅示例性的采用带羧基基团的粒径200-250nm的聚苯乙烯胶乳颗粒来进行试验。本实施例的主要试剂的配制如下：试剂R1：含1％PEG8000(聚乙二醇8000)，1.5％氯化钠，1.5％蔗糖，0.3％吐温20，0.1％叠氮钠的0.2M氯化铵缓冲液，该试剂为无色透明溶液。试剂R2：0.2M氯化铵缓冲液中含有0.15％抗磷酯酰肌醇蛋白聚糖3抗体致敏的聚苯乙烯胶乳颗粒，0.5％蔗糖，0.2％叠氮钠。该试剂为乳白色溶液。具体制备步骤如下：1、取1ml(100mg/ml)胶乳颗粒，用0.2M，pH5.0的MES溶液(2-吗啉乙磺酸缓冲液)洗涤三次，分散；2、加入0.05ml用0.2M，pH5.0的MES溶液新鲜配制的10mg/mlEDAC溶液，室温反应10分钟；3、加入0.5ml用0.2M，pH5.0的MES溶液新鲜配制的100mg/ml已二酸二酰肼溶液，4度反应过夜；4、用0.2M，pH5.0的MES溶液洗涤两次，0.2M，pH7.4的磷酸盐缓冲液洗涤一次，分散备用；5、取1ml抗体(10mg/ml)溶液，加入0.5ml用0.2M，pH7.4的磷酸盐缓冲液配制的10mg/ml的高碘酸钠溶液，室温混合15分钟；6、将步骤5中氧化好的抗体加入到步骤4中激活的胶乳颗粒溶液中，4度反应过夜；7、加入0.5ml10％牛血清白蛋白溶液，4度反应2小时；8、加入0.5ml10％葡萄糖溶液，4度反应过夜；9、用0.2M，pH7.5的氯化铵缓冲液洗涤三次，加入含0.5％蔗糖，0.2％叠氮钠的0.2M，pH7.5的氯化铵缓冲液至胶乳颗粒终浓度为0.15％。磷酯酰肌醇蛋白聚糖3蛋白校准品：在0.9％生理盐水中加入不同含量的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3蛋白，除菌过滤。所述的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3蛋白校准品中磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的蛋白含量控制在0-800ng/ml之间，这些校准品均为无色透明液体。实施例2磷酯酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒各项性能指标测试1、精密度试验使用2个不同磷酯酰肌醇蛋白聚糖3含量的人血清样品，测定本发明检测试剂盒的批内精密度。使用3个批号检测试剂盒分别测定同一个人血清样品各20次，计算本发明检测试剂盒的批间相对极差。结果表明，本发明检测试剂盒的批内精密度为4.26％和1.78％(见表1)，而批间相对极差为4.38％(见表2)。表1批内精密度样品1样品2测定次数2020平均值(ng/ml)26.72598.08最大值(ng/ml)28.07627.98最小值(ng/ml)24.59580.14标准差(SD)1.038410.6408变异系数(CV)3.88％1.78％表22、线性测定试验测定10个不同磷酯酰肌醇蛋白聚糖3蛋白含量的样本，每个样本测试3次，求取平均值，按照判定依据r2＞＝0.990进行判定。结果显示本发明检测试剂盒的最高检测范围可达到800ng/ml(见表3)。表3GPC3理论值(ng/ml)GPC3实测值(ng/ml)10.000.0529.439.80320.5821.49464.4466.37598.8697.876185.49194.627273.02281.218405.03392.879562.07584.5510801.21762.903、准确度试验在去除磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的人血清样品中加入一定体积的标准溶液，获得5个不同含量的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3样本。每个样本测定三次，得到平均值，计算回收率。结果显示本发明检测试剂盒在各个浓度点的回收率摆动均小于5％(见表4)。表44、稳定性试验在2-8度储存条件下，分别在0个月、6个月、9个月、12个月和15个月对同一血清样本进行测定，每个样本测定20次，取均值(试验结果见表5)。结果表明，6个月、9个月、12个月和15个月与0个月相比，测值差异非常小，说明本发明的检测试剂盒在2-8度储存条件下至少可以稳定12个月以上。表55、抗干扰试验在同一份人血清样本中分别加入不同含量的干扰物质，然后进行测定。加入干扰物质后的测定值和加入干扰物质之前的测定值的差值与加入干扰物质之前的测定值的比值作为干扰率。试验结果表明游离胆红素，结合胆红素，血红蛋白以及乳糜微粒的浓度分别在200mg/dl，200mg/dl，4000mg/dl以及20000以下时，它们对测定结果的干扰均在5％以下(见表6)。表6从上述实施例可知，本发明的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒具有检测灵敏度高，检测范围宽，准确性好，抗干扰能力强以及生产成本低的优点。当前第1页1 2 3